毕赤酵母N_糖基化改造的研究进展
N-糖基化对β-甘露聚糖酶在毕赤酵母中异源表达的影响
N-糖基化对β-甘露聚糖酶在毕赤酵母中异源表达的影响马清1，蔡瑞1，姜风超1，马立娟1,2,*，杜丽平1,2，肖冬光1,2（1.天津科技大学生物工程学院，工业发酵微生物教育部重点实验室，天津 300457；2.天津食品安全低碳制造协同创新中心，天津 300457）摘 要：为研究N-糖基化对里氏木霉β-甘露聚糖酶（β-mannanase，Man1）在毕赤酵母GS115中异源表达的影响，采用定点突变的方法，将Man1上3 个N-糖基化修饰位点（N131、N158和N329）上的天冬酰胺用中性谷氨酰胺取代。
结果发现，N-糖基化位点的突变对Man1的转录水平无明显影响，突变后获得的Man1表观分子质量有轻微下降，与Man1相比，3 个突变体N131、N158和N329的甘露聚糖酶活力分别降低了85.43%和79.48%和16.3%；而热稳定性分别提高了7.87%、13.5%和15.37%。
由此可见，N-糖基化修饰对于β-甘露聚糖酶的高效表达是必需的，其中N131和N158糖基化位点尤为重要，但是会稍微降低β-甘露聚糖酶的热稳定性。
关键词：β-甘露聚糖酶；N-糖基化；定点突变；酶活力；热稳定性Effect of N-Glycosylation on the Heterologous Expression of β-Mannanase in Pichia pastorisMA Qing1, CAI Rui1, JIANG Fengchao1, MA Lijuan1,2,*, DU Liping1,2, XIAO Dongguang1,2(1. Key Laboratory of Industrial Microbiology, Ministry of Education, College of Biotechnology,Tianjin University of Science and Technology, Tianjin 300457, China;2. Tianjin Food Safety & Low Carbon Manufacturing Collaborative Innovation Center, Tianjin 300457, China)Abstract: In order to investigate the influence of N-glycosylation on the expression of β-mannanase from Trichoderma reesei (Man1) in Pichia pastoris GS115, the asparagine (Asn) residues at three N-linked glycosylation sites (N131, N158 and N329) of Man1 were substituted by neutral glutamine (Gln) through site-directed mutagenesis. The results showed that mutations of the N-glycosylated sites had no significant effects on the expression of Man1 at the transcriptional level.Compared with Man1, the apparent molecular mass of the mutant Man1 decreased slightly, and the activities of the mutants (N131, N158 and N329) decreased by 85.43%, 79.48% and 16.3%, respectively. However, the thermal stability of mutant N131, N158 and N329 increased by 7.87%, 13.5% and 15.37% compared to that of Man1. Therefore, N-glycosylation especially at N131 and N158 was essential for the high-level expression of Man1 in P. pastoris GS115, but led to a slight reduction in the thermal stability of Man1.Key words:β-mannanase; N-glycosylation; site-directed mutagenesis; enzyme activity; thermal stabilityDOI:10.7506/spkx1002-6630-201716013中图分类号：Q55 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2017）16-0086-06引文格式：马清, 蔡瑞, 姜风超, 等. N-糖基化对β-甘露聚糖酶在毕赤酵母中异源表达的影响[J]. 食品科学, 2017, 38(16): 86-91.DOI:10.7506/spkx1002-6630-201716013. MA Qing, CAI Rui, JIANG Fengchao, et al. Effect of N-glycosylation on the heterologous expression of β-mannanase in Pichia pastoris[J]. Food Science, 2017, 38(16): 86-91. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201716013. 收稿日期：2016-10-20基金项目：天津科技大学青年教师创新基金项目（2014CXLG10）；工业发酵微生物教育部重点实验室暨天津市工业微生物重点实验室（天津科技大学）开放基金项目（2014IM101）；天津市自然科学基金重点项目（16JCZDJC31800）作者简介：马清（1993—），女，硕士研究生，研究方向为酶与分子生物学。
n-糖基化对蛋白质药物关键质量属性影响机制的研究进展
DOI: 10.3969/j.issn.1673-713X.2020.01.010·综述·N-糖基化对蛋白质药物关键质量属性影响机制的研究进展刘国芳，刘晓志，高健，王志明蛋白质糖基化是真核生物蛋白质翻译后修饰的主要方式。
它分布于许多膜结合蛋白上，以N- 或O- 形式和蛋白质连接，其中N- 连接是天冬酰胺（N）和聚糖连接，O- 连接主要是苏氨酸（T）或丝氨酸（S）同聚糖连接。
许多激素、酶以及抗体的N-糖基化位点一般含有保守序列N-X-S/T（其中X 为非脯氨酸的氨基酸），糖基化蛋白一般分布于细胞外，内质网（endoplasmic reticulum，ER）、高尔基体和溶酶体内[1]。
N-糖基化反应在内质网（ER）内开始，ER 和高尔基体内的多种糖苷酶和糖基转移酶参与这个修饰过程。
治疗性抗体药物的Fc 区域有一个N-连接聚糖，位于重链CH2 结构域中的N297。
它具有复杂的双触角型结构，核心结构为甘露糖α1,3 和甘露糖α1,6 键连接的 2 个糖链，添加半乳糖和唾液酸延长糖链。
当含有N-糖基化共有序列的新生抗体通过ER 膜时，N-聚糖前体[包含有3 个葡萄糖（Glc），9 个甘露糖（Man）和 2 个N]通过寡糖基转移酶将乙酰葡糖胺（GlcNAc）转移至新生多肽的N 侧链的酰胺氮上。
在ER 内，N-聚糖末端的葡萄糖残基被α-葡糖苷酶依次修剪，蛋白质正确折叠后形成寡甘露糖9（Man9 或Man9-GlcNAc2）结构。
随后通过ER α-甘露糖苷酶I 除去Man9 中的α1,2-连接的甘露糖，并且将聚糖转化为寡甘露糖5（Man5 或Man5-GlcNAc2）结构。
当抗体从ER 转运到高尔基体时，通过糖苷转移酶I（GlcNAcT I）将GlcNAc 添加到Man5 的α1,3 臂末端甘露糖上，成为杂合型分子。
α1,6-岩藻糖基转移酶VIII（FucT VIII）催化α1,6-岩藻糖转移到GlcNAc-GlcNAc 核心中的最内部的GlcNAc 上，将聚糖转化为岩藻糖型聚糖。
巴斯德毕赤酵母表达系统研究系统进展
➢翻译后修饰
毕赤酵母糖蛋白因与哺乳动物糖蛋白糖链结构的差 异而具有潜在的抗原性，使其在医药工业上的应用受到 一定的制约。它们在哺乳动物体内可被免疫系统清除而 失去效能，而且有引起超敏反应的危险性。
解决糖基化策略：
①尝试胞内表达，避免目的蛋白的糖基化；
②对非活性中心的糖基化位点进行突变改造，清除糖基 化；
稀有密码子制约翻译速率
此时需要进行全基因的合成，使编码序列 符合毕赤酵母密码子的偏爱性和具有更高的
➢基因剂量
相对剂量效应
一般情况下，随着整合拷贝数的增加，表达量也会增加， 例如，1-8整合拷贝数范围内，HBsAg表达量成比例升高。 但也有例外，如小牛溶菌酶的表达随着拷贝数从1-3的上 升反而减少，这可能与mRNA翻译、蛋白折叠效率有关。
重组子在酵母细胞中的命运
导入毕赤酵母的重组质粒能通过同源重组整合到 染色体上，不同的整合方式可产生不同表型的转化子：
（1）同源双交换：表达载体线性化后，两端分别为5’AOX1和 3’AOX1序列，与基因组的同源序列发生双交换后，导致毕赤 酵母基因组内AOX1编码区被表达单元所替换，胞内醇氧化酶 只能来自AOX2基因，酶活性大大降低。因此转化子表现为甲 醇利用缓慢，表型为Muts。
若整合发生在his4位点处，可能出现表达单 元丢失现象，这可能是由于基因组中突变的his4与表 达单元中的his4基因之间发生了基因转换（gene conversion）所致，所以一般选择AOX1位点整合。
his4
用于转化子筛选的基因标记
用于毕赤酵母转化子筛选的基因标记主要有营养 缺陷型互补基因和显性基因：
二、巴斯德毕赤酵母简介
Pichia pastoris
巴斯德毕赤酵母是一种甲基营养菌，能 够在低 廉的甲醇培养基中生长，甲醇能高效 诱导甲醇代谢途径中各酶编码基因的表达， 因此生长迅速、乙醇氧化酶基因AOX1所属 强启动子、表达的可诱导性是巴斯德毕赤酵 母表达系统的三大优势。由于巴斯德毕赤酵 母没有合适的自主复制型载体，所以外源基 因的表达序列一般整合入受体的染色体DNA 上，因此能够稳定遗传。目前已有500多种 外源蛋白在巴斯德毕赤酵母系统中获得成功 表达。
毕赤酵母表达研究进展
利用强效可调控启动子AOX，已高效表达了HBsAg、TNF、EGF、破伤风毒素C片段、基因1工程抗体等多种外源基因［11、12、13］，证实该系统为高效、实用、简便，以提高表达量并保持产物生物学活性为突出特征的外源基因表达系统，而且非常适宜扩大为工业规模［14］11. 彭毅，杨希才，康良仪。
影响甲醇酵母外源蛋白表达的因素。
生物技术通报2000，4：33-3612. 11 3 Cregg JM . Tschopp JF Stillman C, et al .High-level expression and efficient assembly of hepatitis B surface antigen in the methylotrophic yeast pichia.pastoris Bio/Technology,1987,5:479-48513. Sreekrishma K , Nelles L ，Potenz R，et al .High-level expression ,purification ,and characterization of recombinant human tumor necrosis factor synthesized and characterization in the methylotrophic yeast pichia .pastoris ,Biochemistry ,1989,28:4117-412514. Siegel RS , Buckholz RG, Thill GP , et al .Production of epider growth factor in methylotrophic yeast cells, International Patent Application ,1990 ,Publication No:WO90/10697毕赤酵母是甲醇营养型酵母，可利用甲醇作为其唯一碳源。
毕赤酵母表达外源蛋白糖基化研究进展
ｔ ｅ ｉ ｎ ｓ ． Ｉ ｎ ｔ ｈ ｉ ｓ ｒ ｅ ｖ ｉ ｅ ｗ， ｗｅ ｄ ｉ ｓ ｃ ｕ ｓ ｓ ｐ ｒ ｏ ｔ ｅ ｉ ｎ ｇ ｌ ｙ ｃ ｏ ｓ ｙ ｌ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ａ ｎ ｄ ｈ ｕ ｍａ ｎ ｉ ｚ ｅ ｄ ｇ ｌ ｙ ｃ ｏ ｓ ｙ ｌ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｅ ｎ ｇ ｉ ｎ ｅ ｅ ｒ ｉ ｎ ｇ ｉ ｎ Ｐ ｉ ｃ ｈ ｉ ａ ｐａ ｓ ｔ ｏ ｒ ｉ ｓ ． Ｋ ｅ ｙ ｗｏ ｒ ｄ ｓ Ｐ ｉ ｃ ｈ ｉ ａ ｐ ａ ｓ ｔ ｏ ｒ ｉ ｓ Ｏ－ｇ ｌ ｙ ｅ ｏ ｓ ｙ ｌ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ Ｎ－ ｇ ｌ ｙ ｃ ｏ ｓ ｙ ｌ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｈ ｕ ｍａ ｎ ｉ ｚ ｅ ｄ ｇ ｌ ｙ ｃ ｏ ｓ ｙ ｌ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ
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毕赤酵母作为基础研究的新兴模式生物研究进展
毕赤酵母作为基础研究的新兴模式生物研究进展
艾聪聪;龚国利;焦小雨;田露;盖中朝;缑敬轩;李慧
【期刊名称】《广西师范大学学报（自然科学版）》
【年(卷),期】2024(42)3
【摘要】毕赤酵母Komagataella phaffii已经被广泛应用于生物技术行业,近年来,其作为模式生物的潜力逐渐受到关注。
目前,酿酒酵母是最常用酵母模型,毕赤酵母与酿酒酵母在2.5亿年前分化,相比酿酒酵母,毕赤酵母进化速度较慢,更多保留了古代酵母祖先的特征,还具有利用甲醇作为唯一碳源生长的能力,这些特征使其成为研究真核生物分子细胞生物学的有价值模式生物。
本文总结了毕赤酵母基础生物学方面的研究成果,包括甲醇同化、过氧化物酶体生成、交配与产孢行为,以及蛋白质分泌、脂质合成和细胞壁形成等过程,旨在全面且系统地综述毕赤酵母作为模式生物的研究进展。
【总页数】10页(P17-26)
【作者】艾聪聪;龚国利;焦小雨;田露;盖中朝;缑敬轩;李慧
【作者单位】陕西科技大学生物与医药学院;陕西科技大学食品科学与工程学院【正文语种】中文
【中图分类】Q78
【相关文献】
1.基于毕赤酵母系统表达的重组自身免疫调节生物制剂的研究进展
2.竹笋壳提取物对膜璞毕赤酵母及其生物膜的抑制作用
3.一株毕赤酵母菌MC-1降解呕吐毒素、
生物学特性及初步应用4.异常毕赤酵母和纤维素酶对甜高粱青贮质量及微生物多样性的影响5.鸭IFNα-AvBD2融合蛋白在毕赤酵母中的分泌表达及生物学活性检测
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毕赤酵母表达蛋白质的糖基化
α32岩藻糖化增强,许多乳房肿瘤丧失了Le b抗原的表达,这和疾病的恶性程度和转移性相关。
乳房癌组织中S Le x也有增加。
3.肿瘤转移O2G alNAc聚糖结构对肿瘤转移的形成是很关键的。
对肝癌细胞株P LC/PEF/5的研究表明含大量核心1、核心2结构的O2G alNAc聚糖与一种新型的肿瘤相关抗粘附素(dysadherin)结合,抑制了抗粘附素的稳定表达并导致E2钙粘蛋白表达上调。
结果促进了细胞之间的粘附作用,促进了肿瘤转移[1]。
在各种人类结肠癌细胞中,K M12细胞表达与粘蛋白链结合的二聚S Le x,表现出高度转移性。
K M122HX细胞表达S Le a抗原,结果较无S Le a表达的K M122LX细胞表现出更强的粘附能力[10]。
抑制唾液酸化可以减弱肿瘤细胞的转移能力。
以上这些表明,唾液酸化链可能调节肿瘤细胞和其他细胞以及细胞基质之间的相互作用、影响肿瘤细胞的粘附和抗粘附性并延长其在血液中的生存期。
参考文献[1] Tsuiji H et al.G lycobiology,2003,13(7):521—527[2] Seko A et al.G lycobiology,2002,12(6):379—388[3] Schneider F et al.Cancer Res,2001,61:4605—4611[4] W ang F et al.J Histochem Cytochem,2001,49:1581—1592[5] M eichenin M et al.Cancer Res,2000,60:5499—5507[6] Seko A et al.G lycobiology,2000,10(9):919—929[7] M are L et al.Eur J Biochem,2004,271:186—194[8] M achida E et al.Cancer Res,2001,61:2226—2231[9] Dalziel M et al.J Biol Chem,2001,276(14):11007—11015[10] Ota M et al.Cancer Res,2000,60:5261—5268 文章编号:100021336(2004)0420353203毕赤酵母表达蛋白质的糖基化顾 园 诸欣平 王少华(首都医科大学寄生虫学教研室,北京100054)摘要:毕赤酵母表达系统可对表达产物进行翻译后加工如糖基化等。
《毕赤酵母(Pichiapastoris)LNF013产纳豆激酶发酵优化及发酵动力学研究》
《毕赤酵母（Pichia pastoris）LNF013产纳豆激酶发酵优化及发酵动力学研究》一、引言随着生物技术的快速发展，酶类物质在工业、医药及生物工程等领域的应用日益广泛。
纳豆激酶作为一种天然存在的溶栓酶，因其具有良好的生物活性和稳定性而备受关注。
本文选取毕赤酵母（Pichia pastoris）LNF013作为纳豆激酶的生产菌株，通过对其发酵过程进行优化及发酵动力学研究，以期提高纳豆激酶的产量及发酵效率。
二、材料与方法2.1 材料本研究所用材料包括毕赤酵母LNF013菌株、发酵培养基、酶活性检测试剂等。
2.2 方法（1）发酵过程优化：通过调整培养基组成、发酵温度、pH 值、接种量等参数，对毕赤酵母LNF013产纳豆激酶的发酵过程进行优化。
（2）发酵动力学研究：采用动力学模型对发酵过程进行描述，分析各参数对纳豆激酶产量的影响，并建立相应的数学模型。
三、结果与分析3.1 发酵过程优化结果通过调整各参数，我们发现：（1）培养基组成：适当增加碳源、氮源浓度有助于提高纳豆激酶的产量。
（2）发酵温度：在30℃左右，毕赤酵母LNF013产纳豆激酶的活性较高。
（3）pH值：pH值为6.5左右时，菌株生长及纳豆激酶产量达到最佳状态。
（4）接种量：适宜的接种量有助于提高菌株的生长速度及纳豆激酶的产量。
3.2 发酵动力学研究结果通过建立动力学模型，我们发现：（1）菌体生长与纳豆激酶产量之间存在明显的相关性，可通过监测菌体生长情况来预测纳豆激酶的产量。
（2）各参数对纳豆激酶产量的影响程度不同，其中培养基组成、温度和pH值对纳豆激酶产量的影响最为显著。
四、讨论通过对毕赤酵母LNF013产纳豆激酶的发酵过程进行优化及发酵动力学研究，我们找到了提高纳豆激酶产量的关键因素。
在实际生产中，可根据实际情况调整这些参数，以实现更高的纳豆激酶产量及发酵效率。
此外，建立的动力学模型有助于预测和调控发酵过程，为工业化生产提供有力支持。
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毕赤酵母N 糖基化改造的研究进展张 倩,宋海峰(军事医学科学院放射与辐射医学研究所药理毒理研究室,北京100850)[摘要] 毕赤酵母表达系统具有诸多优点,广泛用于生产重组蛋白。
由于其糖基化途径与人不同,表达的糖蛋白为高甘露糖型,改变了糖蛋白的结构,影响其特性和功能,且具有免疫原性,限制了以毕赤酵母为表达系统大量生产重组蛋白的应用。
在过去的20多年里,很多研究集中在毕赤酵母N 糖基化人源化改造研究上,希望产生类人的糖链结构,但进展缓慢。
近期,毕赤酵母N 糖基化改造研究已经取得了重大进展,产生了类人的末端为唾液酸的糖链结构,为应用毕赤酵母表达系统大量生产重组蛋白铺平了道路。
现对毕赤酵母N 糖基化的研究进展进行简述。
[关键词] 毕赤酵母;N 糖基化;糖蛋白[中图分类号]Q513.2;R915.2 [文献标识码]A [文章编号]1003-3734(2008)14-1206-03 Advances i n the asparagi nes li nked glycosyl ati on i n Pichi a pastorisZ HANG Q ian,SONG H a i feng(Depart m ent of Phar m aco logy and Toxico logy,Institute of Rad i a tion M ed icine,A cade my of M ilitar y M e d ical Sciences,B eijing100850,Ch i n a)[Abstract] W ith m any advantages,P ichia pastoris is w i d ely used to pr oduce reco m binan t pro teins.Due to t h e differences i n N g l y cosylati o n pathw ay bet w een P ichia pastoris and hum an,the struct u re o f h i g h m annose g lycan of P ichia pastoris w as changed,the characterization and functi o n o f t h e glycopro teins,or even i m munogen ic w ere af fected.The applicati o n of P ichia pastoris to produce g l y coprote i n s w as li m ited.I n the past t w o decades,m any re searches focused on the m od ificati o n of N glycosylati o n to obtai n hum an li k e glycopro teins,yet got li m ited success. Rencently,great advance m ents have been m ade to produce hum anized sia l y lated gycopro teins,w hich paved t h e w ay to use P ichia pastoris as host to produce reco m b i n ant pro teins.Th is rev i e w summ arizes the re levant researches.[Key w ords] P ichia pastoris;N g l y cosy lati o n;glycopr o te i n毕赤酵母(P ichia pastoris)表达系统是20世纪80年代初期发展起来的一种新型的外源蛋白表达系统,它既具有原核表达系统操作简易、易于培养、生长速度快、表达量高、成本低等优点,还具有真核生物表达系统的对外源蛋白的翻译后修饰等特点,如糖基化、蛋白磷酸化等。
目前,已有越来越多的药用重组蛋白通过酵母表达系统表达,如肿瘤坏死因子和表皮生长因子等,其中有300多种外源蛋白在该表达系统中获得了高效表达,而明胶的表达量甚至达到了14.8g L-1[1]。
虽然有着诸多优点,但毕赤酵母并不是表达糖蛋白的主要表达系统,重组糖蛋白占到了已经批准的药用蛋白的70%,这些糖蛋白一般都是用哺乳动物细胞系进行表达的。
因为哺乳动物细胞能够产生类人的糖链结构,而毕赤酵母产生高甘露糖型糖链结构。
近期,毕赤酵母N 糖基化改造研究已经取得了重大进展,产生了类人的末端为唾液酸的糖链结构,为应用毕赤酵母表达系统大量生产重组蛋白铺平了道路。
现综述如下。
1 毕赤酵母和人N 糖基化过程及特点N连接糖链还原端为N 乙酰氨基葡萄糖(G lc NA c),与蛋白质肽链中Asn X Ser/Thr结构的Asn的酰胺氮以 1,4糖苷键连接,具有这种糖链的蛋白称为N 糖蛋白。
在内质网中,毕赤酵母和人形成共同的寡糖核心M an8G lc NA c2。
在人体内,M an8G lc NAc2转入内侧高尔基体,再经 甘露糖苷酶作用去掉3个甘露糖(M an)形成M an5G lc NA c2结构,在N 乙酰氨基葡萄糖转移酶的催化下形成G lc NA c M an5G l c NA c2糖链结构,再经 甘露糖苷酶!和N 乙酰氨基葡萄糖转移酶!形成G lc NAc2M an3G lc NA c2糖链结构。
此结构在外侧高尔基体中经由半乳糖基转移酶加入半乳糖(Ga l),最后在唾液酸转移酶作用下加入末端唾液酸(NANA)完成二天线复杂型N 糖链NANA2Gal2G lc NAc2M an3G lc NAc2的合成。
简言之,人N 糖基化的过程是由高甘露糖型经杂合型而形成末端为唾液酸的复杂型糖链结构。
在毕赤酵母中,M an8G lc NAc2转入高尔基体,在一系列甘露糖转移酶的作用下添加甘露糖,形成高∀1206∀甘露糖型结构[2]。
2 毕赤酵母N 糖基化改造的意义和目的毕赤酵母高甘露糖型结构与哺乳动物中的复杂型糖链结构显著不同,而糖链结构能改变重组糖蛋白的功能和特点[3-4]。
毕赤酵母高甘露糖型糖链在人体内可以与甘露糖受体结合,导致药动学性质不良和产生免疫反应[5],如具有甘露糖末端结构的糖蛋白清除率高[6]。
这成为制约毕赤酵母作为生产重组糖蛋白表达系统的主要因素,需要进行改造,生产出类人的糖蛋白。
3 毕赤酵母N 糖基化改造的方法3.1 传统的方法 #通过改变培养基组分以达到降低糖基化的目的 E lbei n等[7]发现在培养基中添加衣霉素可以降低糖基化的程度。
添加糖基化位点类似物Benzoyl A sn Leu Thr N M ethyla m ide同样可以达到降低糖基化的目的,因为B enzoy l A sn Leu Thr N M et h yla m ide可与糖基化位点Asn X Ser/Thr 结构与糖链竞争结合。
∃定点突变法 在不影响蛋白活性和功能的情况下,可以利用定点突变法改变蛋白糖基化位点来阻止糖基化,如将糖基化位点A sn X Ser结构的A sn定点突变为A la,可以完全阻止糖基化。
%诱变处理 Ba ll o u等[8]用甲基磺酸乙脂作为诱变剂筛选出甘露糖转移酶缺陷菌株。
3.2 基因工程法改造N 糖基化 要使毕赤酵母N 糖基化途径模拟人体内的N 糖基化途径,就要对涉及此途径的基因进行改造。
主要就是敲除毕赤酵母内源性的形成高甘露糖型的基因,引入一系列形成类人的末端为唾液酸的复杂型糖链结构所需的基因。
毕赤酵母N 糖基化改造的第一步是敲除 1,6甘露糖基转移酶(Och1)基因,Och1基因存在于毕赤酵母内质网,作用是将甘露糖添加到M an8G lc NAc2寡糖链的 1,3连接的甘露糖臂上,形成M an9G lc NA c2糖链结构。
毕赤酵母内源性的其他的甘露糖基转移酶以此糖链作为底物,继续添加甘露糖,形成高甘露糖型结构。
Nakan ish i Shindo等[9]首次报道敲除了Och1基因,形成了M an8G lc NAc2结构,为进一步改造打下了基础。
毕赤酵母N 糖基化进一步改造需要去除甘露糖,由M an8G lc NA c2结构转变为M an5G lc NA c2结构。
1,2甘露糖苷酶(M ns)广泛存在于各种真核生物的内侧高尔基体,主要作用是降解甘露糖残基,M aras等[10]将里氏木霉的M ns基因引入毕赤酵母得到表达,C alle w aert等[11]将内质网定位序列HDEL引入里氏木霉的M ns基因在毕赤酵母中进行表达,发现大多数 1,2甘露糖都被切除。
Cho i等[12]采用组合基因文库和高通量筛选的方法来进行N 糖基化改造。
在敲除Och1基因的基础上,将不同来源的M ns催化区与不同来源的内质网,高尔基体定位序列融合表达,通过高通量筛选, M a l d i to f法检测报告蛋白K3的糖链结构,得到了能够高效表达M an5G lc NAc2结构的菌株。
乙酰氨基葡萄糖转移酶(GnT)的作用是向M an5G lc NAc2结构添加乙酰氨基葡萄糖催化复杂型糖链合成的起始。
Yosh i d a等[13]将GnT基因在酵母中表达并显示活性。
Cho i等[12]采用组合基因文库和高通量筛选的方法将不同来源GnT基因催化区与酵母定位序列融合表达,得到效率最高的结构,并将其转入高效表达M an5G lc NAc2结构的菌株。
检测显示,几乎所有的寡糖都是G lc NA c M an5G lc NAc2结构,这是毕赤酵母N 糖基化改造产生的第1个杂合型糖链结构,标志着毕赤酵母N 糖基化改造向前推进了一大步。
H a m ilton等[14]同样采用上述方法,在Cho i等工作的基础上,引入了甘露糖苷酶!和乙酰氨基葡萄糖转移酶!基因,成功得到了G lc NA c2M an3G lc NA c2。
这是毕赤酵母N 糖基化改造产生的第1个复杂型糖链结构,被称为令人震惊的研究成果[15]。
Vervecken等[16]用基因敲入技术失活Och1基因,以内质网定位序列HDEL定位里氏木霉M ns基因,以 1,2甘露糖基转移酶(K re2)的定位序列替换GnT基因的N端,将其定位于高尔基体,通过将半乳糖基转移酶(Gal T)基因的N端替换为K re2的定位序列,得到了Ga l2G lc NA c2M an5G lc NAc2结构的糖链。
Davidson等[17]发现,在毕赤酵母N 糖基化改造中,通过敲除甘露糖基转移酶(ALG3)基因,可以得到和引入甘露糖苷酶!基因同样的效果。