新配考马斯亮蓝标准曲线
考马斯亮蓝法
考马斯亮蓝G－250法测定蛋白质含量一、目的蛋白质是细胞中最重要的含氮生物大分子之一，承担着各种生物功能。
蛋白质的定量分析是蛋白质构造分析的基础，也是农牧产品品质分析、食品营养价值比较、生化育种、临床诊断等的重要手段。
根据蛋白质的理化性质，提出多种蛋白质定量方法。
考马斯亮蓝G－250法是比色法与色素法相结合的复合方法，简便快捷，灵敏度高，稳定性好，是一种较好的常用方法。
通过本实验学习考马斯亮蓝G－250法测定蛋白质含量的原理，了解分光光度计的结构、原理和在比色法中的应用。
二、原理考马斯亮蓝G-250（Coomassie brilliant blue G-250）测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。
考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色，最大光吸收在488nm；当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-色素结合物在595nm波长下有最大光吸收。
其光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。
蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速；其结合物在室温下1h内保持稳定。
该法是1976年Bradford建立，试剂配制简单，操作简便快捷，反应非常灵敏，灵敏度比Lowry 法还高4倍，测定蛋白质浓度范围为0～1 000μg／mL，是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。
三、仪器、试剂和材料1．仪器（1）分析天平（2）具塞刻度试管10ml×8（3）吸管0.lml×I，lml×Z，5ml×I（4）研钵（5）漏斗（6）离心管10ml（7）容量瓶10ml（8）离心机（9）721型分光光度计2．试剂（1）标准蛋白质溶液称取10mg牛血清白蛋白，溶于蒸馏水并定容至100ml，制成100 pg／ml的原液。
（2）考马斯亮蓝G－250蛋白试剂称取100mg考马斯亮蓝G－250，溶于50ml 90％乙醇中，加入85％（m／v）的磷酸100ml，最后用蒸馏水定容到1000ml。
标准曲线制作
标准曲线制作—考马斯亮蓝法测蛋白质含量一、标准曲线一般用分光光度法测物质的含量，先要制作标准曲线，然后根据标准曲线查出所测物质的含量。
因此，制作标准曲线是生物检测分析的一项基本技术。
二、蛋白质含量测定方法1、凯氏定氮法2、双缩脲法3、Folin-酚试剂法4、紫外吸收法5、考马斯亮蓝法三、考马斯亮蓝法测定蛋白质含量—标准曲线制作（一）、试剂：1、考马斯亮蓝试剂：考马斯亮蓝G—250 100mg溶于50ml 95%乙醇，加入100ml 85% H3PO4，雍蒸馏水稀释至1000ml,滤纸过滤。
最终试剂中含0.01%（W/V）考马斯亮蓝G—250,4.7%（W/V）乙醇，8.5%（W/V）H3PO4。
2、标准蛋白质溶液：纯的牛血清血蛋白，预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，根据其纯度同0.15mol/LNaCl配制成100ug/ml蛋白溶液。
（二）、器材：1、722S型分光光度计使用及原理（）。
2、移液管使用（）。
（三）、标准曲线制作：试管编号0 1 2 3 4 5 6100ug/ml标准蛋白（ml）0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.60.15mol/L NaCl （ml）1 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4考马斯亮蓝试剂（ml） 5 5 5 5 5 5 5摇匀，1h内以1号管为空白对照,在595nm处比色A595nm12、以A595nm为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标（六个点为10ug、20 ug、30 ug、40 ug、50 ug、60 ug），在坐标轴上绘制标准曲线。
1）、利用标准曲线查出回归方程。
2）、用公式计算回归方程。
3）、或用origin作图，测出回归线性方程。
即A595nm=a×X( )+6一般相关系数应过0.999以上，至少2个9以上。
4）、绘图时近两使点在一条直线上，在直线上的点应该在直线两侧。
（四）、蛋白质含量的测定：样品即所测蛋白质含量样品（含量应处理在所测范围内），依照操作步骤1操作，测出样品的A595nm，然后利用标准曲线或回归方程求出样品蛋白质含量。
考马斯亮蓝G-250
本次蛋白质含量对比评测中，我们运用可溶性蛋白质含量测定的方法：《考马斯亮蓝G -250法(刘延林等，1998)》来进行两种样品的对比标准曲线的制作：以牛血清白蛋白(BSA)为标准蛋白质。
称50mg考马斯亮蓝G-250溶于25mL 95%乙醇和50 mL 85%(w/v)的磷酸混合液中，用蒸馏水定容至500mL，快速滤纸过滤后储存于棕色瓶中备用。
称取100mg BSA，溶于蒸馏水中，定容至100mL，则其浓度为1000μg/mL。
按表在6支具塞试管中分别加入BSA溶液和蒸馏水，配制成0～100μg/ml牛血清蛋白溶液各1ml，混匀后加入5mL考马斯亮蓝G-250溶液，盖塞、混匀，室温静置2min，用分光光度计在5 95nm处检测吸光度。
以测得的吸光值为纵坐标，表中各管蛋白浓度为横坐标，做标准曲线。
蛋白质标准曲线溶液配制表吸取待测样品1～5ml，放入具塞试管中，加入5ml考马斯亮蓝G-250蛋白试剂，充分混合，放置2分钟后用10mm光径比色杯在595nm下比色，记录其消光值，并通过标准曲线得到每毫升溶液中的蛋白质含量。
样品蛋白质含量(mg/L)=标准曲线上求得的蛋白质含量(μg)/测定取样体积(ml)实验结果：1 ，标准曲线与回归方程2 ，样品测定(稀释250倍)计算后得出灭菌奶的蛋白值含量比值是：伊利金典/蒙牛特仑苏＝1. 2. 1溶液的配制标准蛋白溶液的配制:精确称取牛血清白蛋白100 mg,用蒸馏水定容至100 mL,配成110 mg/mol的标准溶液。
考马斯亮蓝G - 250溶液的配制:精确称取考马斯亮蓝G - 250 100 mg,溶于50 mL 95%的乙醇,再加入120 mL 85%的磷酸,稀释定容至1 000 mL备用。
1. 2. 2乳制品中蛋白质含量的测定分别准确移取一定量的乳与乳制品样品于试管中,加入410 mL 考马斯亮蓝G - 250溶液,用蒸馏水定容至510 mL,摇匀,在室温下反应5 min,以空白(不加乳制品) 溶液作参比溶液, 分光光度计595 nm波长处测定样品组的吸光度。
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二、试剂与器材
1. 试剂：
（1）考马斯亮蓝试剂： 考马斯亮蓝G—250 100mg溶于50ml 95%乙醇，加入100ml
85% H3PO4，用蒸馏水稀释至1000ml, 滤纸过滤。最终试 剂中含0.01%（W/V）考马斯亮蓝G—250, 4.7%（W/V）乙 醇，8.5%（W/V）H3PO4。
（2）标准蛋白质溶液： 纯的牛血清血蛋白，根据其纯度同0.15mol/L NaCl配制成100
考马斯亮蓝试剂 （ml） 5 5 5 5 5 5 5
摇匀，1h内以0号管为空白对照,在595nm处比色
A595nm
以A595nm为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标（六个点为10ug、20 ug、30 ug、40 ug、50 ug、60 ug），在坐标轴上绘制标准曲线。
2、样品中蛋白质含量的测定
另取两支干净的试管（做一重复），加入合适浓度的 待测样品，使其测定值在标准曲线的范围内，测定方法同 上，由样品液的吸光度查标准曲线即可求出含量。
双缩脲反应；磷 钼酸－磷钨酸试 剂 被 Tyr 和 Phe 还 原
非蛋白氮（可 用三氯乙酸沉 淀蛋白质而分 离）
硫酸铵； Tris缓冲液； 某些氨基酸
各种嘌吟和嘧 啶； 各种核苷酸
硫酸铵； Tris缓冲液； 甘氨酸； 各种硫醇
用于标准蛋白质 含量的准确测定； 干扰少；费时太 长
用于快速测定， 但不太灵敏；不 同蛋白质显色相 似
2缺点四bradford法的优缺点1由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同因此bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差在制作标准曲线时最好选用球蛋白为标准蛋白质以减少这方面的偏差
考马斯亮蓝法——完整版
一、基本原理
酸性溶液两者结合，使染料溶液 的最大吸收峰的位置，由465nm变 为595nm，溶液的颜色也由棕黑色 变为兰色。
最新[牛血清蛋白标准曲线]考马斯亮蓝法标准曲线
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最新[牛血清蛋白标准曲线]考马斯亮蓝法标准曲线牛血清蛋白表1.Folin酚法定制牛血清蛋白及测定人体血清蛋白加样操作表01234567样1样2试管编号200ug/mL牛血清蛋白标准液（mL）0.000.300.400.500.600.700.800.90 1.001.00 1mol/1000mL人血清蛋白（mL）PH7.4磷酸缓冲液（mL)1.000.700.600.500.400.300.200.100.000.00 Folin酚甲（mL）以上各管均加入1.00mL，振荡均匀后，反应15min Folin酚乙（mL）以上各管均加入4.00mL，振荡均匀后，55℃水浴反应25minA650nm实测OD值0.0000.2380.3020.3650.4210.4850.5210.5730.4730.378 表2.Folin酚法定制牛血清蛋白标准曲线，微机数据处理表0123456试管编号标准牛血清蛋白呈色浓度（ug/mL）0.00A650nm实测OD值回归方程对应OD值线性回归方程斜率a 线性回归方程截距b线性回归方程实验相关性（r）710.0013.3316.6720.0023.3326.6730.000.0000.2380.3020.3 650.4210.4850.5210.5730.0330.2220.2840.3470.4100.4730. 5360.5990.018870.03298y=0.01887x+0.032980.9934 凝血酶原时间标准曲线半定量测定纤维蛋白原含量的方法的临床应用凝血酶原时间标准曲线半定量测定纤维蛋白原含量的方法的临床应用孙彦平1 杨光2(11黑龙江省鸡西市矿业集团总医院,黑龙江鸡西158100;21黑龙江省林业总医院,黑龙江150040)〔文章编号〕1002-2376(2004)02-0017-02 〔中图分类号〕TH773 〔文献标识码〕B 〔摘要〕目的:利用Controlplasma建立一种简便、易于临床实验室开展的半定量纤维蛋白原(FiB)检测方法,并对其初步评价。
考马斯亮蓝法(Bradford法)
考马斯亮蓝法（Bradford法）测定蛋白质浓度一、实验原理双缩脲法（biuret法）和folin—酚试剂法（lowry法）的明显缺点和许多限制，促使科学家们去寻找更好的蛋白质溶液测定的方法。
1976年由bradford建立的考马斯亮兰法（bradford法），是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。
这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点，因而正在得到广泛的应用。
这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。
考马斯亮兰g-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置（lmax），由465nm变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。
经研究认为，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。
在595nm下测定的吸光度值A595，与蛋白质浓度成正比。
bradford法的突出优点是：1. 灵敏度高，据估计比lowry法约高四倍，其最低蛋白质检测量可达1mg。
这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大，蛋白质－染料复合物有更高的消光系数，因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比lowry法要大的多。
2. 测定快速、简便，只需加一种试剂。
完成一个样品的测定，只需要5分钟左右。
由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要2分钟即可完成，其颜色可以在1小时内保持稳定，且在5分钟至20分钟之间，颜色的稳定性最好。
因而完全不用像lowry法那样费时和严格地控制时间。
3. 干扰物质少。
如干扰lowry法的K+、Na+、Mg2+离子、tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、edta等均不干扰此测定法此法的缺点是：1. 由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，在制作标准曲线时通常选用g—球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。
2. 仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质有：去污剂、triton x-100、十二烷基硫酸钠（sds）和0.1n的naoh。
考马斯亮蓝法——完整版
第七页，共9页。
六、思考题
说出你所知道的几种蛋白质定量测定的方 法，并与考马斯亮蓝染色法相比较各有何优 缺点？
第八页，共9页。
五种蛋白质测定方法比较如下：
方法
灵敏度
时间
原理
干扰物质
说明
凯氏定氮法 （Kjedahl法）
灵敏度低，适 用于0.2~ 1.0mg 氮，误差为 2 ％
chenli2缺点四bradford法的优缺点1由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同因此bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差在制作标准曲线时最好选用球蛋白为标准蛋白质以减少这方面的偏差
一、基本原理
酸性溶液两者结合，使染料溶液 的最大吸收峰的位置，由465nm变 为595nm，溶液的颜色也由棕黑色 变为兰色。
第一页，共9页。
二、试剂与器材
1. 试剂：
（1）考马斯亮蓝试剂：
考马斯亮蓝G—250 100mg溶于50ml 95%乙醇，加入100ml 85%
H3PO4，用蒸馏水稀释至1000ml, 滤纸过滤。最终试剂中含0.01% （W/V）考马斯亮蓝G—250, 4.7%（W/V）乙醇，8.5%（W/V） H3PO4。
595nm
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强碱性缓冲液； TritonX-100; SDS
最好的方法； 干扰物质少； 颜色稳定；Leabharlann 颜色深浅随不同蛋 白质变化
（2）测定快速、简便：染料与蛋白质的结合，大约只需2分钟， 结合物的颜色在1小时内是稳定的。
（3）干扰物质少。
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四、Bradford法的优缺点
2、缺点
考马斯亮蓝法制作蛋白质标准曲线
唾液淀粉酶的性质和活力测定目的要求:通过唾液淀粉酶性质的测定，了解酶的专一性和多种因素对对酶促反应的影响，如：底屋的浓度，酶浓度，温度、PH值、激活剂等。
通过对唾液淀粉酶活力的测定，学习酶活力、蛋白质含量的测定方法、及酶活力和比活力的计算方法。
原理：一:考马斯亮法测定蛋白质浓度考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度，是利用蛋白质与染料结合的原理，定量的测定微量蛋白浓度的快速、灵敏的方法。
考马斯亮蓝G―250存在着两种不同的颜色形式，红色和蓝色。
它和蛋白质通过范德华力结合，在一定蛋白质浓度范围内，蛋白质和染料结合符合比尔定律（Beer’s law）。
此染料与蛋白质结合后颜色有红色形式和蓝色形式，最大光吸收465nm变成595nm，通过测定595nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。
二：3，5—二硝基水杨酸比色定糖法3,5----二硝基水杨酸与还原糖共热后被还原成棕红色的氨基化合物，在一定范围内，还原糖的量和反应液的颜色强度呈现比例关系，利用比色法可测知样品的含糖量。
该方法是半微量测糖法，操作简便，快速，杂质干扰较小。
三：研究底物，温度、pH、激活剂及抑制剂对酶促反应速度的影响在其他条件不变的情况下，当酶浓度一定时，增加底物浓度，反应速度随底物浓度而增加，两者成正比关系，即V=kC液。
酶的催化作用受温度的影响很大，一方面与一般化学反应一样，提高温度可以增加酶促反应的速度。
通常温度每升高10摄氏度，反应速度加快一倍左右，最后反应速度达到最大值。
另一方面酶是一种蛋白质，温度过高可引起蛋白质变性，导致酶的失活。
因此，反应速度达到最大值以后，随着温度的升高，反应速度反而逐渐下降，以至完全停止反应。
反应速度达到最大值时的温度称为某种酶作用的最适温度。
高于或低于最适温度时，反应速度逐渐降低。
大多数动物酶的最适温度为37-40摄氏度，植物酶的最适温度为50-60摄氏度。
但是，一种酶的最适温度不是完全固定的，它与作用的时间长短有关，反应时间增长时，最适温度向数值较低的方向移动。