病毒的结构

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病毒纯化的原理
病毒纯化的原理主要基于病毒本身的两个性质： 1. 绝大多数的病毒的外壳都是由蛋白质构成的， 因此病毒体就具有普通蛋白质的性质。 2. 病毒具有一定大小、形态和密度。
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差速离心
• 大小和质量有差别 • 低速和高速的交替循环离心 • 不同的病毒，所选择的低速和高速离心 速率有所不同
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表3-1 部分病毒的基本组成
病 腺病毒2型和4型 苜蓿花叶病毒 禽类成髓细胞白血病病毒 蚕豆斑驳病毒 蚕豆真花叶病毒 雀麦花叶病毒 大肠杆菌噬菌体f1，fd，M13 大肠杆菌噬菌体T2，T4，T6 大肠杆菌噬菌体f2，fr，M12，MS2， R17，Q 脊髓灰白质炎病毒 小鼠K病毒 30 26 19 2 22 35 21 79 12 55 88 40 70 74 93 返回 5 毒 RNA ％ DNA ％ 13 蛋白质 ％ 87 81 62 78 65 35 1 脂质 ％ 非核酸糖 ％
以RNA携带全部遗传信息
• 病毒RNA是生物界中以RNA携带全部遗 传信息的唯一独特现象。 • 在生命本质和生命起源的研究中具有很 重要的参考意义。
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分段基因组
• 在RNA病毒中，有一部分病毒的基因组 不是一分子，而是由数个不同的核酸片 段构成，各段核酸均具有一定的功能。
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环状RNA
• 绝大部分病毒基因组RNA都是线状分子。 • σ肝炎病毒：ssRNA的高度碱基配对区 与单链环相间的共价闭合环状分子 • 布尼亚病毒和沙粒病毒：倒转末端重复 序列存在，可形成链柄状的环状分子。
病毒的核酸含量
• 病毒核酸的含量是因病毒种类的不同而不同
– – – – 流感病毒所含有的核酸仅占整个病毒粒子质量的1% 新城鸡瘟病毒的核酸含量也只占整个病毒颗粒质量的1% T偶数噬菌体的核酸含量则占整个病毒粒子质量的50%以上 类病毒则因整个病毒粒子无蛋白质，核酸占100%
• 植物病毒中
– 球状植物病毒的核酸含量在15~45%之间 – 具有螺旋结构的杆状病毒，其核酸含量都在5%左右 – 具有包膜的杆状病毒的核酸含量均为1%左右
– 植物病毒：TMV – 动物病毒：细小RNA病毒，披盖病毒 – 噬菌体：RNA噬菌体
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单一分子的非侵染性线状负链 RNA基因组（-ssRNA）
• 单链线状的单一RNA分子 • 从病毒体中提取出来的完整RNA分子不 具有感染性。 • 携带有转录酶，与其mRNA的极性相反 （即只能以该RNA的互补链作为mRNA） • 分布范围
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5’端共价结合蛋白
• 某些动物病毒和植物病毒的基因组单链 RNA的5’端共价结合有一低分子量的蛋 白质。
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病毒RNA末端具有帽子结构
• 帽子结构（mGpppNmpNp） – 部分病毒RNA的5’－末端具有一个以5’－5’结合的7 －甲基化鸟苷酸残基封闭的结构 – 且RNA链的第一个核苷酸2’－OH位置被甲基化 • 对脾脏磷酸二酯酶等有一定抗性 • 蛋白质合成速率加快，病毒的活性不易丧失。
– 呼肠孤病毒：其帽子结构中含有40S核蛋白体结合位点，如果 帽子结构与40S核蛋白体结合，那么80~100%的5’端就可以免 受RNase的降解；mRNA的蛋白质合成率差20倍。
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3’末端有一个多聚腺苷酸结构
• 动物病毒和某些植物病毒的基因组RNA • 多聚腺苷酸结构（PolyA）：
– 3’端 – 100~200个残基的腺嘌呤 – 豇豆花叶病毒，劳氏肉瘤病毒，水泡性口炎病毒等
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单一分子的双链RNA
• 真菌病毒中 • 只含有一个dsRNA分子 • 不分段 • 分子量为3.0~5.7×106d • RNA也无mRNA活性，也无感染性
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单一分子的侵染性线状正链RNA （+ssRNA）
• • • • • • • 单链 无碱基配对现象 线状 大多数具有mRNA活性 RNA分子不分段 基因组能与细胞核蛋白体结合 分布范围
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等电点沉淀
• 大多数病毒的等电点在pH 4.0~5.5之间。 • 病毒体表面电荷被中和，相互之间的排 斥力减弱而聚集沉淀。 • 分辨力不好，须与其它方法配合使用。
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有机溶剂沉淀
• 有机溶剂能降低溶液的介电常数，增加病毒颗粒表面不同 电荷之间的引力，导致其溶解度降低。 • 有机溶剂与水作用，可破坏病毒颗粒表面蛋白质分子的水 化膜。 • 常用的有机溶剂有乙醚、甲醇、乙醇、正丁醇、氯仿和某 些碳氟化合物等。 • 有机溶剂沉淀法优缺点：
– 分辩力比盐析法好，溶剂也易除去。 – 高浓度的有机溶剂易使病毒的表面蛋白质变性，从而使病毒失活。 – 有包膜病毒不宜用脂溶剂进行纯化。
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酶处理
• 病毒体的蛋白质外壳中，蛋白质分子之 间以大量的化学键互相结合形成一稳定 结构。 • 病毒体的核酸等受蛋白质外壳保护。
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吸附法
• 吸附病毒颗粒 • 吸附杂质 • 新型吸附剂(离子交换树脂、羧甲基纤维 素、二乙基氨基纤维素等） • 主要缺点：
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速率区带离心
• 速率区带离心也叫做梯度差速离心，这是因为在离心 时间和重力场大小方面都与前面所讲的差速离心中的 高速离心相同。两种离心的差别主要表现在颗粒沉降 的位置不同。 • 病毒悬液最初加入在已成梯度介质的顶层，在离心时， 各种颗粒根据各自的沉降速率以区带形式集中在梯度 柱中的一定部位，并可以抵抗对流的干扰而保持稳定。 • 速率区带离心的优点
– 能把病毒颗粒与难以用其它方法分开的寄主组分分离开来 – 病毒不会沉降至离心管底部结成硬块而受到损失
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平衡区带离心
• • • • 含有梯度的抗对流介质 较长的时间的离心 沉降到与它们自身密度相等的介质层中 介质的密度梯度在离心前形成，也可以事先把介质和 病毒悬液混合，然后在离心过程中才形成密度梯度。 • 氯化铯、氯化铷或溴化钾等无机盐 • 区别小于0.001克/厘米3的密度差别
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• •
病毒基因组的结构特征
病毒的核酸存在四种主要类型，即dsDNA、ssDNA、 dsRNA和ssRNA。 分析病毒核酸的碱基组成和含量，可以确定病毒核酸 的类型。 单链RNA病毒核酸能按它们的极性或意义来进行定义： ¾ 正链RNA：病毒ssRNA可以作为mRNA，即具有翻 译模板的活性 ¾ 负链RNA：病毒ssRNA的核苷酸序列与其mRNA的 核苷酸序列互补 ¾ 病毒的dsRNA仅有一条链转录，因此称转录链为负 链，非转录链为正链 返回
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病毒RNA的类型
9种结构类型：
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病毒RNA分段基因组
• 分段基因组 • 具有分段基因组的病毒的特点
– 侵染率低 – 容易发生变异
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分段的dsRNA
• 分布范围：脊椎动物、植物、昆虫和真菌的病 毒等。 • 呼肠孤病毒：RNA，双链，核酸分段，具有10 个RNA片段，在被感染的细胞中编码大小相应 的10个多肽（每个RNA片段都是单顺反子的， 编码一个简单多肽）。 • 伤瘤病毒：RNA，12个RNA片段 • 玉米粗缩病毒：RNA，10个RNA片段
返106 ~108d之间，相 当于3~300个基因。
– ΦX174噬菌体：1.7×106d ；T偶数噬菌体： 1.1×108d；痘病毒：1.6×108d
• 病毒RNA的分子量在0.3×106d~7×106d （约900~2300个核苷酸）的范围内。
– 病毒RNA的分子量变化幅度不是很大。
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密度梯度离心
• 主要是在一个无对流的介质中，病毒颗粒因其 自身特有的密度而能在离心场中与其他杂质区 分开来。 • 一些沉降速率与病毒相差无几的杂质，很难用 差速离心的方法将它们与病毒分离开来，使用 这种离心方法即可有效地将病毒与这类杂质分 开。 • 密度梯度离心主要有两种形式，速率区带离心 和平衡（或等比重）密度离心。
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分段的侵染性线状正链RNA
• 分段的侵染性线状正链RNA • 特点：病毒的分段基因组的各个核酸片 段是被包被在几种不同的壳体内
– 二分体病毒 – 三分体病毒 – 多分体病毒
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两分体病毒
• 两段分子量不同的RNA • 烟草胞裂病毒（TRV）
– 长颗粒：170nm，RNA分子量为2.5×106d，只用长 颗粒感染植物，只形成不稳定型的病斑。控制自身 的长度，具有两种杆状颗粒的核酸复制的遗传信息， 在某些植物上引起病症。 – 短颗粒：50nm， RNA分子量为0.6~1.3×106d，单 独短颗粒感染植物，则不引起感染。控制自身的长 度，具有编码两种颗粒壳体蛋白的遗传信息。
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病毒核酸的碱基组成
• • 病毒核苷酸所含的碱基也与细胞核酸。 病毒DNA还含有一些异常碱基。 – 枯草杆菌噬菌体PBS1和P08：胸腺嘧啶分别被尿嘧啶和5－羟 甲基尿嘧啶所取代 – T4大肠杆菌噬菌体的DNA中的胞嘧啶被5－羟甲基胞嘧啶所取 代 病毒RNA的碱基中，未发现有异常碱基的存在。 病毒核酸的各种碱基对的含量因病毒种类不同而不同 – DNA中G+C对的含量30% －72% – 病毒双链DNA的稳定性有关 – G+C含量是病毒鉴定的一个指标
– 动物病毒：主要 – 植物病毒：弹状病毒
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逆转录病毒的RNA
• 基因组RNA为正链RNA • 病毒体携带有逆转录酶 • 逆转录产生双链DNA中间体 • 没有侵染性。
感染性
• 纯化的病毒制备物应保持感染性 • 纯化过程可能给病毒活性造成的影响
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均一性
• 纯化的病毒制备物应具有均一性
– 病毒体是病毒核酸与蛋白质非共价装配建成 – 理化性质均一(大小、形态、密度、化学性 质、分子量及抗原性质等)
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病毒均一性的检测方法
1. 电镜观察：纯化的病毒制备物在电镜下表现为大小、 形态均一的颗粒。不应有异常的颗粒存在。 2. 超速离心：纯化的病毒制备物在超速离心时所有的颗 粒沉降速率和密度应表现一致，只出现一条沉降带。 3. 电泳：纯化的病毒制备物中的颗粒大小及表面电荷应 当均一，再一定强度的电场中只形成一条电泳带。 4. 免疫学方法：纯化的病毒制备物应有特异性的抗原反 应，用免疫法检测不含有非病毒的抗原成分。