生化分离技术
第08章生化分离高级纯化技术
杂质分子则直接流出。变换通过层析柱的溶液组成，促使配基
与亲合物（目的物）解离，即可获得纯化目的产物。
目标产物
杂蛋白
亲和层析操作示意图
三、亲和层析介质
A、亲和配基：
酶抑制剂：
生物体内蛋白酶的抑制剂可与蛋白酶的活性部位结合，
抑制酶的活性。
抗体：
利用抗体为配基的亲和层析又称免疫亲和层析 （Immunoaffinity chromatography），抗原与抗体之间 具有高度特异性结合能力。
（1）求出标准蛋白质分子量与洗脱体积的关系
标准蛋白质 蓝色葡聚糖 牛血清蛋白 胃蛋白酶 Cytc 分子量 20000 67000 36000 13000 lgM 5.301 4.826 4.556 4.114 Ve 20 37 44 50
（2）绘制标准蛋白质分子量与洗脱体积标准曲线图
Ve
lgM
（3）根据未知蛋白质洗脱体积求出相对分子量
6、料液流向： 轴向流层析 径向流层析
三、适用于大规模生物分子纯化的层析方法
分离方法 凝胶过滤 分离原理 分子大小 特 点 应 用 分辨率为中等，但对脱盐效果 优良；流速较低，容量受样本 体积的限制 大规模纯化的最后步骤，任 一阶段可脱盐，尤其适用于 两种缓冲液交替
离子交换
电
荷
分辨率高，流速快，容量很高， 最适用于大量样品处理的前 体积不受限制 阶段
凝胶体积（Vm）：凝胶颗粒基质本身所占的体积； 在限定的层析条件下，Vt和V0都恒定值，而Ve随水分离
物分子质量的变化而变化。
讨论：
（1） Kav ＝0时，则Ve＝ V0 ，洗脱体积等于孔隙体积，完 全 排阻（组分Ⅰ） ； （2） Kav＝1时，则Ve＝ V0 ＋Vi ，洗脱体积等于孔隙体积 和内水体积之和，小分子完全进入凝胶内部（组分Ⅲ）； （3）0＜ Kav ＜1，内水体积只有一部分被组分利用，扩散 渗透 （组分Ⅱ）。
生物化学中的常用分离技术
生物化学中的常用分离技术生物化学是研究生命体内分子组成、结构与功能的学科，其中分离技术是非常重要的一环。
生物化学中的常用分离技术包括离心、层析、电泳等方法。
离心是最常见的分离技术之一，它是利用离心机的高速旋转原理来实现样品中分子成分的分离。
离心机通常将样品置于高速旋转的离心轮之中，离心轮旋转时会为样品造成一个向外的离心力，使得样品中具有不同密度的分子成分向离心轮的不同位置沉降，达到分离的目的。
离心常常被用于分离细胞和其它生物样品中的非溶解性颗粒物和蛋白质等生物大分子。
层析法是一种基于固体相和液相之间的亲和性差异来实现分离的技术。
它通过将样品混合于一种固定相（比如色谱柱中的色谱填料）的流动相中，让样品中的分子成分以不同的速率与固相中的填料相互作用并分离。
这就需要依据出不同物质分子的化学性质来选择合适的填料（比如离子交换柱、亲和素柱、凝胶柱等）。
层析法是一种非常重要的分离技术，广泛应用于生物制药、生化分析、分子诊断等领域。
电泳法是利用电磁场将分子分离的分离技术。
它利用电泳原理，即在电磁场作用下，带电粒子（如样品中的DNA、蛋白质等生物大分子）在电场力和电阻力的作用下运动。
电泳技术主要包括聚丙烯酰胺凝胶电泳、蒸汽泄压调控电泳（SDS-PAGE）、凝胶过滤电泳、等电聚焦电泳等等。
与离心、层析相比，电泳技术可以更为准确地分离出特定的蛋白质或DNA分子，具有非常重要的研究价值。
总之，生物化学的常用分离技术虽然各具特色，但它们依据不同的物理、化学作用原理实现了生物大分子的分离。
这些技术在研究领域、医疗临床、药品开发等生物制药行业都有广泛应用。
它们的出现不仅促进了科学技术进步，也对我们对于生命体的理解有着非常积极的意义。
生化分离原理与技术
生化分离原理与技术
生化分离原理与技术是用于分离和纯化生物大分子（如蛋白质、核酸等）或小分子的一种方法。
下面将介绍几种常见的生化分离原理与技术。
1. 凝胶电泳：凝胶电泳是一种将生物大分子按照大小和电荷分开的方法。
常见的凝胶电泳包括琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳。
在凝胶中施加电场后，生物分子会在凝胶中进行迁移，并形成不同的带状图案，进而实现分离。
2. 超速离心：超速离心是利用离心力的巨大差异来分离生物大分子的技术。
通过离心机的高速旋转，离心力会将不同大小和密度的生物分子分层沉淀，从而实现分离。
3. 液相色谱：液相色谱（Liquid Chromatography，简称LC）
是一种基于生物分子在固定相和流动相中的相互作用力差异进行分离的方法。
常见的液相色谱包括反相液相色谱、离子交换液相色谱等。
生物分子会在固定相表面与流动相相互作用，从而实现分离。
4. 亲和层析：亲和层析是利用配体和目标生物分子之间的高特异性结合来实现分离和纯化的方法。
将具有亲和性的配体固定在固定相上，目标生物分子在流动相中与配体结合，而其他非特异性结合的分子则被洗脱出来，以实现分离和纯化。
5. 薄层层析：薄层层析是一种将混合物中的生物分子通过涂覆在薄层质地的固定相上进行分离的方法。
在薄层质地上施加溶
剂后，生物分子会因为在固定相上的不同亲和力而移动，从而实现分离。
这些生化分离原理与技术在生物科学研究和生物制药工业中起着重要的作用，能够帮助研究人员分离和纯化生物大分子，进而深入了解其结构和功能。
生化分离技术原理及应用
生化分离技术原理及应用一、引言生化分离技术是一种将混合物中的生物大分子（如蛋白质、核酸等）与其他组分进行有效分离的方法。
它在生物医学研究、制药工业、食品安全等领域具有广泛的应用。
本文将详细介绍生化分离技术的原理及其在不同领域的应用。
二、生化分离技术的原理生化分离技术主要基于生物大分子的特性，通过利用分子间的相互作用力，将目标分子与其他组分分离开来。
以下是几种常用的生化分离技术及其原理：1. 离心分离离心分离是一种利用离心力将混合物中的组分分离的方法。
离心力可以使不同密度的组分在离心管中分层，从而实现分离。
这种方法常用于细胞分离、蛋白质纯化等。
2. 色谱分离色谱分离是一种基于分子在固定相和流动相之间相互作用力的差异，将混合物中的组分分离的方法。
常见的色谱分离方法包括气相色谱、液相色谱等。
3. 电泳分离电泳分离是一种利用电场将混合物中的带电分子分离的方法。
不同带电分子在电场中会受到不同的迁移速度，从而实现分离。
电泳分离常用于核酸分离、蛋白质分离等。
4. 过滤分离过滤分离是一种利用孔径大小将混合物中的组分分离的方法。
通过选择合适的滤膜孔径，可以实现对不同大小的生物大分子的分离。
这种方法常用于细胞分离、颗粒物质分离等。
三、生化分离技术的应用1. 生物医学研究生化分离技术在生物医学研究中起着重要作用。
通过分离纯化蛋白质、核酸等生物大分子，可以进一步研究其结构、功能及相互作用机制。
此外，生化分离技术还可以用于筛选药物靶点、疾病诊断等。
2. 制药工业制药工业中常常需要从复杂的混合物中提取纯化药物活性成分。
生化分离技术可以帮助提高药物的纯度和产量，确保药物的质量和安全性。
同时，生化分离技术还可以用于药物代谢动力学研究、药物相互作用研究等。
3. 食品安全生化分离技术在食品安全领域也有广泛的应用。
通过分离纯化食品中的有害物质（如农药残留、重金属等），可以保障食品的安全性。
此外，生化分离技术还可以用于食品中添加剂的检测、食品成分分析等。
生化分离工程
错流过滤 研 磨 错流过滤 超 滤 吸 附 喷 干
憎 水 结晶
电泳
基本定义
生化分离工程的定义：
为提取生物产品时所需的原理、方法、技术及相 关硬件设备的总称，指从发酵液、动植物细胞培 养液、酶反应液和动植物组织细胞与体液等中提 取、分离纯化、富集生物产品的过程 (Downstream Processing)。
1）、在设计前，首先要掌握的产物物化性质，主要包括：
(1)、溶解度及影响因素，包括温度、pH值、有机溶剂和盐等； (2)、分子量和分子形状。对于高分子物质非常有意义； (3)、沸点和蒸汽压。对于热稳定的小分子物质非常有意义； (4)、极性大小； (5)、分子电荷及影响因素，包括pH值和盐等； (6)、功能团。功能团为萃取剂和特异性吸附的选择提供依据； (7)、免疫原性。设计亲和色谱； (8)、稳定性及其影响因素，包括温度、pH值、毒性试剂等(如青霉素
6)、提供产品竞争力的关键技术之一。WTO，降低生产成本、 提高产品标准。
7)、环境污染的治理（慢性铅中毒）
作业：检阅文献，谈谈分离科学的作用
刊原：
1)、纯分离分析期刊：Bioassay(IF = 6.227); Anal. Chem.(IF = 4.650); Separ. Purif Method(IF = 3.600); Electrophoresis(IF = 3.465); Adv. Chromatogr (IF = 3.067); J Chromatogr A(IF = 2.768); LC GC-Mag Sep Sci(IF = 2.393); J Chromatogr B(IF = 1.867)。调研论文数/月、本学科国际发展的速度
1）、凝胶 2）、亲和色谱 3）、离子交换
生化分离技术与原理
生化分离技术与原理
生化分离技术是一种重要的实验室技术，被广泛应用于生物医学研究、生物制药和生物工程等领域。
其原理是通过物理或化学方法将混合的生物分子或细胞分离出来，以便进一步研究它们的结构、功能和相互作用。
生化分离技术包括很多种方法，其中最常用的有凝胶过滤、离心、层析、电泳和光学分离等。
这些方法可以根据分离原理和分离效果的不同来选择使用。
凝胶过滤是一种分子尺寸分离的方法，将混合物通过一层凝胶，分子会根据分子大小的不同而被筛选分离。
离心是利用高速旋转离心机的离心力将混合物分离开来，其中不同密度的细胞或分子可以被分离出来。
层析是利用不同材料的吸附性质或分子大小的差异来分离混合物的方法，通常用于纯化蛋白质等大分子化合物。
电泳是利用电场力将带电粒子沿电场方向移动的方法，可以根据分子大小、电荷和形状等性质来分离混合物。
光学分离是利用激光束对细胞或分子产生作用力，将混合物分离开来的方法，通常用于单细胞分离和分析。
生化分离技术的应用非常广泛，例如可以用于分离和纯化蛋白质、核酸、肽类等生物分子，还可以用于筛选药物和疫苗。
随着科技的不断发展，生化分离技术也在不断更新和改进，为生命科学研究和医学诊疗提供了更多的可能。
- 1 -。
生化分离技术
一、名词解释（3分×5＝15分）⒈生化分离技术:从含有目标产物的发酵液、酶反应液或动植物细胞培养液中，提取精制并加工制成高纯度的、符合规定要求的各种产品技术，又称为下游加工技术⒉包涵体：蛋白质分子本身及与其周围的杂蛋白、核酸等形成不溶性的无活性的聚集体，其中大部分是克隆表达的目标产物蛋白。
⒊结晶：固体物质以晶体状态从气相或液相中析出的过程，是相态变化过程，通过结晶最终实现相态的平衡⒋凝胶色谱：又称体积排阻色谱、分子筛色谱。
是利用凝胶粒子为固定相，根据料液中溶质相对分子质量的差别进行分离的液相色谱。
⒌絮凝作用：利用带有许多活性官能团的高分子线状化合物吸附多少个微粒的能力，通过架桥作用讲许多微粒聚集在一起，形成粗大松散絮团的过程。
⒍蒸发：溶液中的溶剂会啊进入气相中的过程。
其实质是溶液中的溶剂由液态变成气态，进而与溶液中溶质实现分离过程。
⒎浓差极化:在膜分离过程中，由于水和小分子溶质透过膜，大分子溶质被截留在膜表面出聚积，使得膜表面上被截留大分子溶质浓度增大，高于主体中大分子溶质浓度，这种现象称为浓差极化⒏晶习：指在一定环境中，晶体的外部形态。
⒐分离度：相邻两色谱峰保留值之差与两组分色谱峰峰底宽度的比值。
⒑干燥：通过气化而使湿物料中水分除去的方法。
四、问答题（30分）⒈青霉素发酵液预处理的目的是什么？生产中采用哪些方法？（10分）答：①除去无极离子或蛋白质②鼓式真空过滤机⒉简述薄层层析板的制备方法及薄层层析操作方法。
（10分）答：①制备：调浆、涂布、取洁静的干燥载玻片均匀涂层干燥、将载玻片水平放置，室温子下自然晾干活化70烘干30min。
切断电源，带载玻片面温度下降至不烫手时取出。
②在大小适当的玻璃板上，均匀涂上吸附剂，厚度在一毫米以内，然后在距底边1。
5厘米处点上样品溶液，形成一个小点，称为“原点”。
再将薄层板置于盛有动相溶剂的玻缸内（此溶剂称为“展开溶剂”，玻缸称为“展开槽”）。
当溶剂沿薄层扩散到距原点以上一定距离时（一般10—12厘米），取出薄层板，记录展开溶剂扩展前沿距原点的距离A。
生化分离工程的一般工艺流程
生化分离工程的一般工艺流程生化分离工程是一种利用不同物质的化学或生物特性差异进行分离的工程技术。
它主要应用于制药、食品、化工等领域，用于提取、分离和纯化目标物质。
下面将介绍一般的生化分离工艺流程。
一、前处理前处理是生化分离工程的第一步，主要目的是将原料进行预处理，以去除杂质、减少影响分离效果的物质，为后续的分离步骤做好准备。
前处理的具体步骤包括物料破碎、浸泡、搅拌等。
二、提取提取是生化分离工程的核心步骤，它是将目标物质从原料中提取出来的过程。
提取方法多种多样，常用的方法包括溶剂提取、超临界流体提取、浸提等。
在提取过程中，需要控制好提取的时间、温度、pH值等因素，以提高提取效率和提取纯度。
三、分离分离是将提取得到的混合物中的目标物质与其他物质进行分离的过程。
常用的分离方法有蒸馏、结晶、萃取、吸附、离心、膜分离等。
分离的选择要根据目标物质的特性以及产品的要求来确定。
四、纯化纯化是将分离得到的目标物质进一步提纯的过程。
纯化的方法有很多种，常用的方法有晶体生长、再结晶、色谱层析、电泳等。
纯化的目的是提高产品的纯度和质量。
五、精制精制是对纯化后的物质进行进一步处理，以达到更高的纯度和质量要求。
精制的方法包括洗涤、溶解、过滤、干燥等。
在精制过程中，需要注意控制操作的条件，防止杂质的污染。
六、成品制备成品制备是将精制后的物质进行最终的加工和包装，以获得成品产品。
成品制备的步骤包括配制、混合、包装等。
在成品制备过程中，需要严格控制生产工艺，确保产品的质量和安全性。
七、检测与分析检测与分析是生化分离工程的重要环节，它用于检验产品的质量和性能。
常用的检测与分析方法包括色谱分析、质谱分析、核磁共振等。
通过检测与分析，可以对产品进行定性和定量的分析，为产品的质量控制提供依据。
八、工艺优化与改进工艺优化与改进是生化分离工程的持续改进过程。
通过对工艺流程的优化和改进，可以提高产品的产率、纯度和质量，降低生产成本，提高经济效益。
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核酸提取的历史
核酸是1869年 米歇尔 (F.Miescher)在 脓液 白细胞中 发现的，他当时 称之为核素。阿 尔特曼 (R.Altmann)于 1889年认识其 酸性后，定名为 核 酸。核酸分 为核糖核酸 (RNA)和脱氧核 糖核酸(DNA)两 大类。
核酸提取的历史
质粒(Plasmid)是一种染色体外的稳定遗传因子， 大小从1-200 kb不等，为双链、闭环的DNA分子，并 以超螺旋状态存在于宿主细胞中。 质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌等细胞中，它 具有自主复制和转录能力，能在子代细胞中保持恒定的 拷贝数，并表达所携带的遗传信息。
核酸传统提取方法——CTAB法 CTAB法实验流程
植物材料 抽提
离心洗涤
液氮研磨
上层溶液
干燥溶解
细胞裂解
方法——EB-CsCl密度梯度离心法 EB-CsCl密度梯度离心法
在过量EB存在的条件下，各种不同密度的物 质经离心平衡后得以分开。
蛋白质由于密度小而浮于液面
RNA密度大而沉于管底
亲水性，因此向水层移动。
核酸传统提取方法——TRIzol法
TRIzol试剂中的主要成分为异硫氰酸胍和苯酚，其 中异硫氰酸胍可裂解细胞，促使核蛋白体的解离，使 RNA与蛋白质分离，并将RNA释放到溶液中。当加入氯 仿时，它可抽提酸性的苯酚，而酸性苯酚可促使RNA进
入水相，离心后可形成水相层和有机层，这样RNA与仍
阴离子交 换材料
二氧化 硅基质 法
核酸固相提 取方法
各种DNA密度介于蛋白质与RNA之间，处于 中部
核酸传统提取方法——EB-CsCl密度梯度离心法
核酸传统提取方法——EB-CsCl密度梯度离心法
不同分子构型的DNA与EB的结合能力不同，密度下降也不同，因 而可将它们有效分离开。 染色体DNA、开环质粒DNA等可嵌入更多的EB，因而密度下降较 多 闭环质粒DNA为超螺旋三级结构，EB不易插入而结合量少，密度 下降较少
核酸传统提取方法——oligo(dT)-纤维素柱层析法
oligo(dT)-纤维素柱层析法
oligo(dT)-纤维素柱层析法是mRNA制备的一个标 准方法。它是以oligo(dT)-纤维素填充层析柱，加入待 分离的总RNA样品，其中poly(A)+RNA在高盐条件下 ，通过碱基互补，与oligo(dT)-纤维素形成稳定的 RNA-DNA杂交体，洗去未结合的其它RNA，然后在 低盐缓冲液中洗脱并回收poly(A)+RNA。从哺乳动物 细胞提取大量的非放射性RNA 时，oligo(dT)-纤维素 柱层析法是首选方法，回收的poly(A)+RNA量可达总 RNA的1%～10%。但该法分离速度慢，易阻塞，不 适合同时对多个标本的处理，而且很难回收全部的 poly(A)+RNA，故不适合对少量RNA样品的分离。
核酸传统提取方法——SDS法 SDS法实验流程（以动物组织为例）
动物组织
抽提
离心洗涤
液氮研磨 或匀浆
上层溶液
干燥溶解
细胞裂解
酒精沉淀
DNA溶液
核酸传统提取方法——CTAB法 CTAB法原理（植物DNA提取经典方法）
CTAB（hexadecyltrimethylammonium bromide，十六 烷基三甲基溴化铵），是一种阳离子去污剂，可溶解细 胞膜，并与核酸形成复合物。
oligo(dT)纤维素柱 层析法
TRIzol 法
核酸传统提 取方法
EB-CsCl 密度梯度 离心法
SDS法
CTAB 法
核酸传统提取方法——TRIzol法 异硫氰酸胍/苯酚法（TRIzol法）
原理：
核酸在中性条件下，因磷酸基解离而带负电荷，这 一部分由于水化而溶于水。而在酸性条件下，磷酸基的 负电荷消失，水溶性下降。因此，在酸性酚的处理下， DNA向疏水性的酚层移动，而RNA由于有-OH的存在有
该复合物在高盐溶液中（>0.7 mol/L NaCl）是可溶的， 通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加 入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。
核酸传统提取方法——CTAB法
Tris-HCl （pH 8.0）提供一个缓冲环境，防止核酸被破 坏 EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性 NaCl 提供一个高盐环境，使DNP充分溶解，存在于液 相中 CTAB 溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离 β-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免 褐变，使酚容易去除
核酸提取的历史
1869年，瑞士医师弗雷德里希 · 米歇尔首例成功的进行了核酸提取。 起初，他关注于组成白细胞各种蛋 白质，并指出蛋白质是细胞质的主 要成分。但在随后的测试试验中发 现，当加入酸性溶液时溶液中生成 一种沉淀物，再加入碱性溶液时沉 淀继而溶解消失。米歇尔首例提取 出粗糙的DNA，米歇尔成功从细胞 中提取出DNA后，一些研究者纷纷 效仿，并在材料、试剂的应用上进 行了不断的探索，由此发展了许多 核酸的生物分子提取技术。
留在有机相中的蛋白质和DNA便分离开。水相层主要为 RNA，有机层主要为DNA和蛋白质。
核酸传统提取方法——SDS法 SDS法原理
SDS是一种阴离子去垢剂，在高温（55～65℃）条件下 能裂解细胞，使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸；
提高盐(KAc 或NH4Ac) 浓度并降低温度（冰浴），使蛋 白质及多糖杂质沉淀，离心后除去沉淀； 上清液中的DNA用酚/氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉淀 水相中的DNA。
生化分离技术
DNA,RNA和蛋白质的提取
学生：徐泽彬 专业：生物化工 学号：201306032
提要
1 2
生物大分子提取 核酸传统提取法
3
4
核酸固相提取法
蛋白质的提取
生物大分子 • 与化学产品相比，生物大分子的制备有以下 主 要特点： ⑴生物材料的组成极其复杂，有数百种至几千种 化合物。 ⑵生物大分子的含量极微，分离纯化的步骤繁多 ，流程长。 ⑶生物大分子离开了生物体内的环境极易失活， 因此如何防止其失活，就是生物大分子提取制备 最困难之处。 ⑷生物大分子的制备几乎都是在溶液中进行的， 温度、pH值、离子强度等各种参数对溶液中各 种组成的综合影响，很难准确估计和判断。