基因操作原理
基因的工作原理
基因的工作原理
基因是生物体中的遗传物质，决定了生物体的遗传特征和功能。
基因的工作原理主要涉及DNA、RNA和蛋白质的相互作用。
首先，基因是由DNA分子组成的。
DNA是一个双螺旋的大分子，由两条互相缠绕的链组成。
每条链上的碱基序列编码了生物体合成蛋白质所需的信息。
基因的工作始于转录过程。
转录是指DNA链上的一个片段被
复制成为mRNA（信使RNA）。
在细胞核中，特定的酶能够
识别并结合到基因上，使其中的DNA链解开。
然后，一个名
为RNA聚合酶的酶会沿着DNA链合成RNA链，根据DNA
的碱基序列合成互补的mRNA链。
这个过程中，腺嘌呤（A）、鸟嘌呤（G）、胸腺嘧啶（T）和胞嘧啶（C）碱基按
照特定的规则进行配对。
接下来，mRNA会离开细胞核，进入细胞质。
在细胞质中，mRNA将作为模板，被一个名为核糖体的细胞器所识别和结合。
核糖体会沿着mRNA链上“读取”信息，并根据mRNA上
的密码子来选择和组装对应的氨基酸。
氨基酸的顺序由mRNA上的密码子决定，这一顺序编码了特
定的蛋白质序列。
当核糖体组装完整个蛋白质链之后，蛋白质会通过细胞质中的其他细胞器进行后续的折叠、修饰和定位。
最终，形成的蛋白质会根据其自身的功能被运输到细胞中不同的位置，并参与到各种生物过程中。
这些过程包括细胞代谢、
信号传导、细胞结构的维持和功能的实现等。
总而言之，基因的工作原理涉及到DNA的转录、mRNA的翻
译和蛋白质的产生。
这一过程是生物体遗传特征和功能的基础，也是生命活动的关键。
基因工程原理
基因工程原理内容提要1.基因工程又称基因操作、重组DNA技术, 是P. Berg等于1972年创建的。
基因工程技术涉及的基本过程包括“切、连、转、选”。
该技术有两个基本的特点∶分子水平上的操作和细胞水平上的表达。
2.基因工程中使用多种工具酶，包括限制性内切核酸酶、DNA连接酶和其他一些参与DNA合成与修饰的酶类。
3.限制性内切核酸酶是基因工程中最重要的工具酶，属于水解酶类。
根据限制性内切核酸酶的作用特点，被分为三大类。
Ⅱ类限制性内切核酸酶是基因工程中最常用的酶，该类酶的分子量小，专一性强,切割的方式有平切和交错切, 作用时需要Mg++作辅助因子, 但不需要ATP和SAM。
第一个被分离的Ⅱ类酶是Hind Ⅱ。
4.连接酶是一类用于核酸分子连接形成磷酸二酯键的核酸酶，有DNA连接酶和RNA连接酶之分。
基因工程中使用的连接酶来自于原核生物，有两种类型的DNA连接酶∶连接酶和T4-DNA连接酶。
基因工程中使用的主要是T4DNA 连接酶，它是从T4噬菌体感染的中分离的一种单链多肽酶，既能进行粘性末端连接又能进行平末端连接。
5.载体是能将分离或合成的基因导入细胞的DNA分子，有三种主要类型∶质粒DNA、病毒DNA、科斯质粒，在这三种类型的基础上，根据不同的目的，出现了各种类型的改造载体。
6.DNA重组连接的方法大致分为四种: 粘性末端连接、平末端连接、同聚物接尾连接、接头连接法。
粘性末端连接法是最常用的DNA连接方法,是指具有相同粘性末端的两个双链DNA分子在DNA连接酶的作用下, 连接成为一个杂合双链DNA。
平末端连接是指在T4 DNA连接酶的作用下, 将两个具有平末端的双链DNA分子连接成杂种DNA分子。
同聚物加尾连接就是利用末端转移酶在载体及外源双链DNA的3'端各加上一段寡聚核苷酸, 制成人工粘性末端, 外源DNA和载体DNA分子要分别加上不同的寡聚核苷酸,如dA(dG)和dT(dC), 然后在DNA连接酶的作用下, 连接成为重组的DNA。
基因操作原理名词解释
第一章1. Gene manipulation基因操作。
将在细胞外产生的核酸（物质）分子插入到病毒，质粒或其它载体系统中，再整合到特定的宿主中，从而形成一种新的可连续繁殖的有机体。
2. Interrupted genes间断基因。
序列中间插入有与氨基酸编码无关的DNA 间隔区，使一个基因分隔成不连续的若干区段。
我们称这种编码序列不连续的基因为间断基因。
3 .Promotor启动子。
DNA 分子可以与RNA 聚合酶特异结合的部位，也就是使转录开始的部位。
4. Subcloning亚克隆。
当初始克隆中的外源DNA 片段较长，含有许多目的基因以外的DNA 片段时，在诸如表达、序列分析和突变等操作中不便进行，将目的基因所对应的一小段DNA 找出来，这个过程叫“亚克隆”。
第二章1.Restriction and modification限制和修饰。
宿主特异性地降解外源遗传物质（DNA）的现象称为限制。
外源遗传物质通过甲基化等作用避免宿主的限制作用称为修饰。
2. Matched ends匹配末端。
识别位点为回文对称结构的序列，经限制酶切割后，产生的相同的，互补的末端称为匹配粘端，亦即粘性末端（cohesive end）。
3. Blunt ends平末端。
在回文对称轴上同时切割DNA 的两条链，产生的没有碱基突出的末端称为平末端。
4. Isoschizomer ：同裂酶。
识别相同序列的限制酶称同裂酶，但它们的切割位点可能不同。
5. Isocaudiners ：同尾酶。
来源不同、识别序列不同，•但产生相同粘性末端的酶。
6.Site preferences ：位点偏爱。
某些限制酶对同一介质中的不同位置的同一个识别序列表现出不同的切割效率的现象称为位点偏爱。
7.Star activity 星星活性。
在极端非标准条件下，限制酶能切割与识别序列相似的序列，这个改变的特殊性称星星活性。
8. Nicking enzyme 切口酶。
基因工程的原理和技术
基因工程的基本原理：
让人们感兴趣的基因（即目的基因）在宿主细 胞中稳定和高效的表达。根据不同的实验目的，目 的基因可以有很多种，如抗虫基因、抗病基因、抗 除草剂基因、人胰岛素基因和人干扰素基因等。因 此表达的产物各不相同。通过基因工程的基本操作 ，就能实现目标。
二、基因操作的基本步骤
第三步：将目的基因导入受体细胞
选择的关键是分析基因工程的最终目的，按转基因的目的来选择：
基因工程的 最终目的
得到大量特 殊蛋白质
得到转基因动物 得到转基因植物
常用的受 体细胞
大肠杆菌 等微生物
受精卵 植物体细胞
导入的方法
Ca2＋处理法 显微注射法 农杆菌转化法
将目的基因导入微生物细胞
常选细菌 作受体细胞的原因：它 们繁殖力极强，生长速 度很快，短期内就会产 生大量后代，所以把目 的基因转入这些细菌， 就能在短时间内得到大 量的目的基因产物。
细菌的检测：
将每个受体细胞单独培养形成菌落，检测菌落中 是否有目的基因的表达产物。淘汰无表达产物的 菌落，保留有表达产物的进一步培养、研究。
无表达产物
无表达产物
有表达产物
无表达产物
多细胞生物的检测： 将每个受体细胞单独培养并诱导发育成完整个体， 检测这些个体是否表现出相应的性状。
例：抗虫棉检测
用棉铃饲喂棉铃虫，如虫吃后不 出现中毒症状，说明未摄入目的基 因或摄入目的基因未表达。
例：下列有关基因表达载体的构建说法正确的是( C ) A．限制性核酸内切酶的功能是切割各种DNA分子 B．基因工程中经常用到的酶只有DNA连接酶和限制性 核酸内切酶 C．将目的基因与载体结合的过程，实际上就是不同来 源的DNA重新组合的过程 D．具有粘性末端的目的基因片段插入质粒的切口处， 先形成磷酸二酯键，再形成氢键
基因操作原理和方法
克隆和重组技术的应用
克隆和重组技术广泛应 用于基因工程、生物制 药、农业和医学等领域 。
在基因工程中，克隆和 重组技术用于生产重组 蛋白、疫苗和抗体等生 物制品。
在农业中，克隆和重组 技术用于改良作物品种 和提高农作物的抗逆性 和产量。
生物科学研究
基因敲除和敲入技术可用于研究基因功能、细胞信 号转导、药物筛选等生物科学研究领域，有助于深 入了解生命活动的本质。
生物制药
基因敲除和敲入技术可用于生产基因工程药物，通 过改造或增强微生物、细胞或动物细胞中的基因表 达，生产具有特定功能的药物。
敲除和敲入技术的限制和挑战
80%
技术难度高
基因敲除和敲入技术需要精确的 操作和设计，对技术和实验条件 要求较高，且存在一定的失败率 和不确定性。
05
基因编辑新技术
CRISPR-Cas9系统
总结词
CRISPR-Cas9系统是一种高效、简单、低成本的基因编辑技术，通过向导RNA和Cas9 蛋白的引导，实现对特定DNA序列的切割和修复。
详细描述
CRISPR-Cas9系统利用向导RNA与目标DNA序列的特异性结合，将Cas9蛋白引导至目 标位置，通过切割DNA双链形成缺口，启动细胞内的DNA修复机制。在修复过程中， 插入、删除或替换特定DNA序列成为可能，从而实现基因敲除、敲入和点突变等基因
基因操作的历史与发展
基因操作技术的起源可以追溯到20 世纪70年代，当时科学家开始探索 限制性内切酶和DNA连接酶等工具 的应用。
随着技术的不断发展，基因操作逐渐 成为现代生物学和医学研究的重要手 段，广泛应用于基因克隆、基因治疗 、基因工程等领域。
基因提取的实验原理是什么
基因提取的实验原理是什么基因提取是一种实验方法，用于从细胞中分离和纯化DNA分子。
它涉及到一系列步骤，包括细胞破碎、去除杂质、DNA溶解和纯化等。
基因提取的实验原理主要分为以下几个步骤：1. 细胞破碎：首先需要将细胞破碎以释放DNA分子。
这可以通过物理或化学方法实现。
物理方法包括振荡、摇床或超声波等，用于破坏细胞膜和壁。
化学方法则是采用细胞裂解缓冲液，其中含有蛋白酶或表面活性剂等，可以破坏细胞结构。
2. 去除杂质：细胞的破碎会释放许多非DNA的组分，如蛋白质、RNA、多余的盐和酶等。
这些杂质会影响DNA的提取和分析，因此需要通过凝胶电泳、离心沉淀或其他分离技术来除去。
一种常用的方法是通过protease K 酶处理混合物，使DNA不受蛋白质的干扰。
3. DNA溶解：细胞溶解后，DNA被释放到溶液中。
DNA在水溶液中具有一定的稳定性，但在高温、酸碱等环境条件下会降解。
因此，为了保护DNA的完整性，需要在溶解过程中加入一定的缓冲液，如Tris-HCl缓冲液或TE缓冲液（Tris-EDTA缓冲液），以维持适宜的pH值和离子强度。
4. DNA纯化：DNA溶液中仍然存在其他杂质，如RNA、酶、无机盐等。
这些杂质会干扰DNA的后续分析。
因此，需要利用分子生物学中的各种技术来纯化DNA，如甲醇沉淀、有机溶剂提取（如酚/氯仿或酒精/马尾酚方法），或者利用商用的DNA提取试剂盒进行纯化。
总体来说，基因提取的实验原理是通过破碎细胞、去除杂质、溶解DNA和纯化DNA等步骤来获得纯净的DNA样品。
这种纯化后的DNA可以用于许多后续实验，如PCR、酶切、DNA序列测定等。
基因提取是分子生物学和遗传学等领域中的关键步骤，对于研究基因功能、诊断疾病、进行基因工程等有着重要的意义。
基因操作原理知识点总结
基因操作原理知识点总结基因操作是一种在生物体内对基因进行修改或操作的技术，它的出现为生物学、医学和农业等领域带来了革命性的变革。
通过基因操作技术，科学家们可以改变生物体的一些性状，使得其具有更好的抗病性、生长速度、产量等特性，从而为人类生活和生产带来了巨大的便利和利益。
在这篇文章中，我将从基因操作的原理、技术、应用和风险等方面进行详细的介绍和讨论。
基因操作的原则基因操作的基本原理是对生物体的基因进行修改或操作，使得其具有某些特定的性状。
这是通过DNA重组技术来实现的，DNA重组技术是一种利用酶的作用或化学方法，将DNA片段进行切割、粘接、合成等操作，从而实现对基因的改变或移植。
利用这一技术，科学家们可以将某种物种的基因转移到另一种物种中，或者通过改变某个基因的表达方式来使得生物体产生一些新的性状。
基因操作的技术基因操作技术主要包括DNA重组技术、基因克隆技术、基因敲除技术、基因编辑技术等。
其中，DNA重组技术是最基本的技术，它通过切割、粘接、重组DNA片段来改变基因的结构和表达方式；基因克隆技术是一种通过细胞培养和分裂来复制基因的方法，可以用于大规模生产具有某些特定性状的生物体；基因敲除技术是一种通过干扰某个基因的表达来观察该基因在生物体中的功能和作用；基因编辑技术是一种通过精确的操纵基因序列来实现对基因的改变和操作。
基因操作的应用基因操作技术在农业、医学、生物工程等领域都有着广泛的应用。
在农业领域，基因操作技术可以用来改良作物的产量、抗病性、品质等性状，从而为农业生产提供更多的选择和可能；在医学领域，基因操作技术可以用来治疗或预防一些遗传疾病，为人类健康带来更多的希望和机会；在生物工程领域，基因操作技术可以用来生产某些特定的物质或药物，从而为生产和生活提供更多的可能性。
基因操作的风险尽管基因操作技术为人类带来了巨大的利益和希望，但是它可能也会带来一些潜在的风险和问题。
其中，最主要的风险包括对环境的影响和对人类健康的影响。
基因工程的原理
基因工程的原理
基因工程是指通过改变、插入或删除生物体内的基因来改变其特性的技术。
基因工程的原理是利用基因的特性，将特定的基因插入到生物体内，使其产生新的特性或改变原有的特性。
基因工程的原理包括以下几个方面：
DNA分子的结构和功能：DNA是生命活动的基本单位，它负责储存和传递遗传信息。
DNA分子是由若干条碱基链组成，每条碱基链由若干种碱基构成，碱基之间通过碱基对键来连接。
基因的插入和表达：基因工程的基本原理是将特定的基因插入到生物体内，使其产生新的特性或改变原有的特性。
这通常需要使用含有目标基因的质粒，并利用载体将其插入到生物体内。
插入后，基因可能会被表达，即转录成 RNA 并翻译成蛋白质。
遗传工程技术：遗传工程技术是指在基因工程实验中使用的一系列技术，包括 DNA 合成、PCR 技术、DNA 酶切割和修饰技术、基因转换技术等。
这些技术可以
帮助研究人员操纵基因，使其能够被插入到生物体内。
载体技术：载体技术是指利用载体将目标基因插入到生物体内的技术。
载体可以是质粒、噬菌体、病毒等，它们可以在生物体内复制并传播目标基因。
载体技术是基因工程的重要组成部分，可以帮助研究人员将目标基因插入到特定的生物体内，并控制基因的表达。
染色体工程：染色体工程是指对生物体染色体的操作，包括插入、删除或改变染色体的基因。
染色体工程可以帮助研究人员了解染色体的结构和功能，并使用基因工程技术改变染色体的基因组成。
基因工程在医学、农业、生物制药等领域有广泛的应用，可以帮助研究人员改变生物体的特性，为解决各种问题提供新的思路和方法。
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Separation Range Vs. % Agarose
Low Geling Agarose 4-6
0.02-0.4
用已知分子量的标准DNA对DNA片断大小的估算
Sample Well
25 ng 1 kb ladder 0.8% Agarose
Agarose Gel Electrophoresis
Reps
Cycle1 Cycle2—30
Cycle31*
1min 1min 1min
1min 1min 1min
1min 1min 10min
1× 29× 1×
*This cycle is normally included in a PCR assay in order to allow any “unfinished” product from previous amplification to achieve its full length
10个碱基作引物
用随机引物扩增出的PCR产物，经琼脂糖 电泳后所呈现的带型，反映着用作模板 的DNA分子的总体结构特征。
核酸分子杂交（DNA/DNA or DNA/RNA）技术
核酸分子杂交技术，是在1968年由华盛顿卡 内基学院（Cavnegie Institute of Washington） 的Roy Britten及其同事发明的。所依据的原理是， 带有互补的特定核苷酸序列的单链DNA或RNA，当 它们混合在一起时，其相应的同源区段将会退火 形成双链的结构。
1.其长度通常在15~30个核苷酸之间。 2.简并引物 atggctant… 3.嵌套引物
PCR扩增的长度：<2kb
• PCR技术的应用：
1.基因组克隆
突变体的鉴定和在PCR过程中有目的的 添加核算序列。
• 反相PCR(reverse PCR)与染色体步移
• 不对称PCR(asymmertric PCR) 用来制备单链的DNA 特点： 两种引物的浓度不同，低浓度的限制引
• 107bp的DNA大分子。
PFGE can resolve large DNA fragments
• 基因扩增（gene amplification）
主要内容： 1.体外扩增 2.通过体外重组和转化，将目的基因在宿主
细胞进行扩增 3.在环境作用下，生物体内相关基因的扩增。 4.程序基因扩增 5.进化过程中的基因扩增
• 电泳的迁移率取决于核酸分子本身的大 小和构型。分子量较小的DNA分子，比 分子量较大的DNA分子迁移率要快；同 等分子量的不同构型的核酸分子，构型 紧密的比松散型的开环DNA分子或线性 DNA分子迁移率要快
• 凝胶电泳的分辨力：
与凝胶的类型和密度相关 琼脂糖凝胶的分辨力在0.2～50Kb之间; 聚丙烯酰胺的分辨力在1～1000bp之间
水稻（Oryza sativa L.)的叶绿体DNA分别用核酸内切限制酶BglⅡ(AC)、BamHⅠ（D-F）、EcoRⅠ（G-I）、和HindⅢ（J-L）消化，加样在 含有EtBr染料的1%的琼脂糖凝胶电泳中作电泳分离，然后同32P标记的玉 米psbA探针作Southern杂交。X光底片中显现的阳性条带 ，表明含有水 稻的psbA基因序列。
•琼脂糖凝胶电泳
琼脂糖是一种从红色海藻中提取出的 线性多糖聚合物。
分为常熔点的琼脂糖和低熔点（LMP） 琼脂糖。
• LMP琼脂糖 熔点：62～65℃ 熔解后，在37℃ 可保持液态数小时； 在25℃ 可保持液态约10min
• 回收DNA分子 在65℃ 下将LMP琼脂糖凝胶熔化； 加入过量的酚抽提DNA； 离心获得含DNA分子的上清液；
Some DNA Polymerases Used in PCR
Enzyme Microbial Source
Thermotolerance
Klenow Escherichia coli
No
Sequenase T7 bacteriophage
No
Taq
Thermus aquaticus
Yes
BstE
• 直接酶切
• 琼脂糖凝胶电泳的参数：
缓冲液：1× TAE（TBE TPE） 凝胶的含量：根据检测的DNA大小 加DNA样品：<1μg，指示剂 电泳条件：大片断低电压长时间，小片段高电压短 时间
染色和观察：溴化乙锭（ethidium bromide，EB） 染色，在300nm波长的紫外下观察（凝胶成像仪）。 能看到0.05 μg的微量DNA DNA的片断大小与荧光强度成正比
Parameter Concentration
Template pH dNTPs Gelatin Primers Mg2+ oncentration Enzyme Total volume
10 attomoles(~1×106 molecules) 8.4（10mM Tris-Hcl） 200 μM(each one)
印迹转移前的凝胶处理： 分子量不同所需转移的时间不同； 浸泡在0.25M的HCL溶液中脱嘌呤，再进 行碱变性
碱水解，DNA链断裂 单链
（a）
Southern 凝 （b） 胶转移杂交
技术
基因组DNA
DNA限制片段
（c）
（d） 硝酸纤维素滤膜
（e）
同探针同源杂交的 基因DNA片段
X光底片
Southern DNA 印迹杂交之X光显像图片
第二章 基因操作的主要技术原理
• 核酸的凝胶电泳
• 扩增原理 • 分子杂交 • 测序
•核酸的凝胶电泳
它是一种分析鉴定重组DNA分子及 蛋白质与核酸相互作用的重要实验手 段，同时也是分子生物学研究方法的 技术基础。
• 基本原理
带有负电荷的DNA或RNA核苷酸链， 依靠无反应活性的稳定的介质（琼脂糖 凝胶和聚丙烯酰胺凝胶）和缓冲液，在 电场中以一定的迁移率从负极移向正极。 根据核酸分子大小不同、构型或形状的 差异，以及所带电荷的不同，可以通过 电泳将其混合物中的不同成分彼此分开。
150 nucleotides/sec/molecule >50% at 95℃ for 40 min 1.1×10-4 substitutions per cycle
>0.5mM<10mM 5’ to 3’only 5’ adenosines
• PCR引物： 与待扩增的靶DNA区段两端序列互补的 人工合成的寡核苷酸片断。
• 在脉冲电泳中，电场方向是周期变化的，头一 个脉冲电场方向与核酸的移动方向成45 ℃角， 下一个脉冲的电场方向与核酸移动方向在另一 侧成45 ℃角，由于加在琼脂糖凝胶电泳上的 电场方向、电流大小、Байду номын сангаас及作用时间都在交替 地变换着，这就使得DNA分子必须随时调整其 泳动的方向，来适应凝胶孔隙的无规则变化。 与分子量小的DNA分子相比，分子量大的 DNA分子需要较多的次数来更换其构型和方位， 使之能够按新的方向游动，所以迁移率就慢， 从而达到了分离大分子量DNA分子的目的。
1、萨瑟恩DNA印迹杂交
根据毛细管作用的原理，使在电泳凝胶中分离的DNA片段 转移并结合在适当的滤膜上，然后通过同标记的单链DNA或 RNA探针的杂交作用检测这些被转移的DNA片段，这种实验 方法叫做DNA印迹杂交技术。由于它是由E.Southern于1975年 首先设计出来的，故又叫Southern DNA 印迹转移技术。
• 凝胶聚丙烯酰胺：丙稀酰胺/ 亚甲双丙稀 酰胺（29：1）；TEMED和过硫酸铵 （ 10％ ）。
PolyAcrylamide Gels
• 脉冲电场凝胶电泳（PFGE）
• 1984年，D.R.Cantor发明的。分离超大 分子量的DNA分子。
• 在脉冲电泳中，电场方向是周期变化的，头一个脉冲 电场方向与核酸的移动方向成45 ℃角，下一个脉冲的 电场方向与核酸移动方向在另一侧成45 ℃角，由于加 在琼脂糖凝胶电泳上的电场方向、电流大小、以及作 用时间都在交替地变换着，这就使得DNA分子必须随 时调整其泳动的方向，来适应凝胶孔隙的无规则变化。 与分子量小的DNA分子相比，分子量大的DNA分子需 要较多的次数来更换其构型和方位，使之能够按新的 方向游动，所以迁移率就慢，从而达到了分离大分子 量DNA分子的目的。
PCR 反应的每一个温度循环周期都是由DNA变性、引 物退火和反应延伸三个步骤完成的。图中设定的反 应参数是94℃变性1min， 60 ℃退火1min， 72 ℃ 延伸1.5min。如此周而复始，重复进行，直至扩增
产物的数量满足实验需求为止。
Reaction Condition for a Typical PCR Assay
在进行核酸印迹转移的时，
1. 要将以转好的硝酸纤维素膜在80度下 烘烤1～2小时；
2. 紫外线交联法，将DNA分子上的部分 胸腺嘧啶残基同尼龙膜表面的带正电荷 的氨基基团之间进行交联。
kb
12
10 8
EtBr Detection Limit: ~5-10 ng DNA
6
4
2
1
根据标准DNA相对迁移距离推测待测定的DNA片段的大小
Agarose gel electrophoresis
Agarose gel electrophoresis
• 聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 缓冲液：TBE
物和高浓度引物，两者浓度相差约100倍。
获得单链核苷酸的另一种方法是通过固 相支持物作DAN链的特意洗脱。（生物 素—链霉素包裹的磁珠）
• RT－PCR: 在mRNA反转录之后进行的PCR
检测RNA分子； 获取测序模板DNA； 克隆mRNA之cDNA拷贝。
基 因 的 体 外 诱 变
• 基因组的比较研究：
100 g/ml (optional) 0.5 μM(each one);(0.1—1.0μM)