pull down流程和结果模板
pull down 实验方法
.；.Pull Down实验流程1. 混合两种预测相互作用的蛋白。
（Protein-A-GST & Protein-B-HIS，下面实验用GST 树脂IP，用Western Blot检测HIS；反之亦然。
如果是纯化后的蛋白，需要进行偷袭或者使用超滤离心管为蛋白更换溶液，之后才能继续Pull Down。
）2. 加入1 mL Binding Buffer。
Binding Buffer：50 mM Tris.HCl （pH7.50.）100 mM NaCl0.25% Triton-X 10035 mM β-Me（巯基乙醇）3. 将混合蛋白在4℃条件下旋转结合2-4 h。
4. 加入20-30 μL GST-Bind TM Resin结合2-4 h。
5. 4 ℃，150-200 g 离心2 min，吸弃上清（小心！不要吸弃底部沉淀）。
第一次弃去的上清样品记为Washing- Protein-A/ Protein-B，用于SDS-PAGE电泳时的对照。
6. 加入1 mL Binding Buffer，4 ℃条件下旋转混匀5-10 min，4 ℃，150-200 g 离心2 min，吸弃上清。
7. 重复步骤6，用1 mL Binding Buffer 清洗5-6次。
8. 最后一次清洗后留有20-30 μL 液体，加入适量的Loading Buffer，95℃金属浴5-10 min，150-200 g 离心5 min，样品记为上样跑SDS-PAGE电泳。
电泳样品顺序：Marker，Protein-A-GST，Protein-B-HIS，Washing- Protein-A/ Protein-B，Pull Down- Protein-A/ Protein-B此次电泳的目的，一是初步检测两个蛋白是否互作，二是可以为后面正式实验所需蛋白量提供参考。
用于正式检测两个蛋白是否互作电泳顺序如下：（input，蛋白量为后两者的1/10）Marker，Protein-B-HIS ，GST+ Protein-B-HIS，Protein-A-GST+ Protein-B-HISMarker，Protein-A-GST ，HIS+ Protein-A-GST，Protein-B-HIS+ Protein-B-GST9. 转PVDF膜，350 mA 恒流，2 h 左右。
pull-down蛋白质鉴定流程
pull-down蛋白质鉴定流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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pulldown实验原理
pulldown实验原理Pulldown实验是一种常用的分子生物学实验技术，用于研究蛋白质与DNA或RNA之间的相互作用。
该实验原理基于核酸的亲和性纯化技术。
在Pulldown实验中，我们需要准备两种重要的试剂：目的蛋白和亲和填料。
目的蛋白是我们想要研究的蛋白质，而亲和填料则是用于显示目的蛋白与核酸相互作用的亲和性表位。
通常，亲和填料有两种类型：固定填料和亲和标记填料。
固定填料是通过共价键结合到固定材料上，如琼脂糖珠。
而亲和标记填料则是具有荧光或放射性同位素等标记，以便于后续的蛋白质分析。
Pulldown实验的步骤如下：1.准备目的蛋白：我们首先需要克隆目的蛋白的基因，并将其表达在适当的表达系统中，如大肠杆菌。
通过分析蛋白质序列，我们可以知道目的蛋白背后的结构和功能。
2.准备亲和填料：根据目的蛋白的特性，选择适当的亲和填料。
例如，如果目的蛋白是DNA结合蛋白，我们可以使用DNA纯化填料，如聚腺酸。
如果目的蛋白是RNA结合蛋白，我们可以使用RNA纯化填料。
3.将目的蛋白和亲和填料结合：将目的蛋白与亲和填料一起孵育，以使它们发生特异性的相互作用。
这可以通过混合目的蛋白和亲和填料，在适当的缓冲液中进行几个小时的孵育来完成。
4.固定亲和复合物：使用试剂将亲和复合物固定在固定剂上，如琼脂糖珠。
这可以通过将珠子加入到反应中，然后对混合物进行旋转和洗涤来完成。
5.洗涤亲和复合物：通过多次洗涤琼脂糖珠，去除非特异性结合的蛋白质和其他杂质。
这可以通过多次旋转珠子和加入适当的洗涤缓冲液来完成。
6. 蛋白质分析：现在我们已经得到了特异性的目的蛋白-亲和填料复合物。
我们可以通过热变性、SDS-、Western blotting等方法对复合物进行分析和检测。
这些分析方法可以帮助我们确定目的蛋白质与DNA或RNA的相互作用。
通过Pulldown实验，我们可以研究蛋白质与DNA或RNA之间的相互作用，从而深入了解生物分子的功能和结构。
细胞pulldown实验的详细步骤及详细说明
细胞pulldown实验的详细步骤及详细说明利用重组技术将探针蛋白与GST（Glutathione S transferase）融合，融合蛋白通过GST与固相化在载体上的GTH（Glutathione）亲和结合。
因此，当与融合蛋白有相互作用的蛋白通过层析柱时或与此固相复合物混合时就可被吸附而分离。
GST-pulldown主要包括以下三个部分：①利用基因重组技术构建带有GST标签的原核表达载体；②通过原核表达系统表达带有GST标签的融合蛋白；③利用GST亲和纯化柱进行蛋白纯化获得高纯度的融合蛋白，再利用GST亲和纯化柱进行蛋白间的相互作用检测。
细胞蛋白裂解液，洗脱液：PBS及PBS+1%Triton-100PBS （1L）NaCl： 8gKCl：0.2gNa2HPO4： 1.44gKH2PO4：0.24g加入800ml蒸馏水，用HCl调节溶液的pH值至7.4，最后加蒸馏水定容至1L 即可，高温高压灭菌,4℃保存备用。
PMSF（苯甲基磺酰氟）MW:174.19 工作浓度0.1-1mM，这里使用1mM，储存浓度100mM，将0.174g PMSF溶于10ml无水乙醇混匀即可。
保持于-20℃或者4℃。
（以下流程仅供研究已知原核蛋白A和真核过表达蛋白B相互作用）1、原核融合蛋白A的获得（1）将编码蛋白A与GST的重组质粒化转BL21（DE3）菌株（2）挑取单个克隆到含有5mlLB（+100ug/mlAmp）的10ml试管里，37℃培养过夜（3）将培养菌液转移到含有500ml LB（+100ug/mlAmp）的1L锥形瓶中，37℃，225rpm培养至OD600≈1.0-1.5左右，加入适当浓度的IPTG，在适当温度下培养适当时间（诱导条件需要根据不同的蛋白做调整），6000g，10分钟，4℃离心收集细菌，去尽上清，将菌体至于-20℃放置O/N（4）室温冻融菌体，马上置于冰上，每500ml培养液加入10-20ml细菌裂解液（PBS+1%Triton-100+PMSF），吹打混匀（5）冰上超声破碎，开2秒，停9秒，总40-60分钟。
pull-down方法步骤汇总
pull-down⽅法步骤汇总GST-Pull down:1) 利⽤纯化好的蛋⽩进⾏GST-Pull down 实验操作。
2) 实验设置2 个组合，第⼀个是实验组(90 µl BP-His +90 µl BRM(689-952aa)-GST)，第⼆个是负对照组(90 µl BP-His + 10 µl GST)，分别在1.5 ml 的离⼼管中混合均匀。
3) 加⼊1 ml binding buffer，充分混合均匀，冰箱内30 rpm 旋转⾄少2h。
4) 加⼊30 µl GST-Bind TM Resin，冰箱内30 rpm 旋转⾄少2 h。
，100 g 离⼼ 2 min，弃去上清。
6) 加⼊1 ml binding buffer，冰箱内30 rpm 旋转5 min 进⾏洗涤，然后，100 g 离⼼ 2 min，弃去上清。
重复 5 次。
7) 加⼊40 µl 5×SDS-PAGE loading buffer，煮沸5 min，12000 g，离⼼30 sec，吸取上清点样进⾏SDS-PAGE 电泳。
8) 12 %的SDS-PAGE 胶，120 V 电泳90 min。
9) 转膜，使⽤PVDF 膜，使⽤前⽤甲醇浸泡10 min，350 mA 电流转膜2h。
10) ⽤5 %的脱脂⽜奶封闭膜，60 rpm，1 h。
11) 加⼊⼀抗(20 ml 5 %的脱脂⽜奶+5 µl anti-His)，60 rpm，1 h。
12) 倒掉⼀抗，加⼊10 ml western blotting wash buffer，60 rpm，10 min，重复3 次。
13) 加⼊⼆抗(20 ml 5 %的脱脂⽜奶+5 µl Goat anti- mouse IgG(H+L) HRP conjugate)，60 rpm，1 h。
14) 倒掉⼆抗，加⼊10 ml western blotting wash buffer，60 rpm，10 min，重复3 次。
pull-down试验方法（自己总结）
pull-down试验方法（自己总结）pull-down试验方法(自己总结)12、GST蛋白的表达和纯化12、1 GST蛋白的表达（1)将表达GST融合蛋白的质粒转入BL21大肠杆菌菌株中。
（2) 挑单克隆于3ml LA(LB+Amp)培养基中，37℃摇菌过夜，获得种子液。
（3)将种子液稀释于50ml2XYTA(YTG+Amp)培养基中，使起始OD600为0、1。
（4)28℃,220rpm摇菌培养2小时。
（5)加入50μl100mM IPTG,16～27℃摇菌培养1～8小时。
（6)收菌，将菌液倒入大离心管，2管/50ml菌液，4℃5krpmx5min离心，弃上清。
（7)加入10ml PBS/管，重悬细胞,5krpm离心5min，弃上清。
（8) 加入2ml PBS/管，重悬细胞。
转移至5ml离心管。
（9)超声破壁破壁前，在细胞悬液中加20μl10mg/ml PMSF,80μl 蛋白酶抑制剂(100x)。
破壁参数：Frequency:100～200w 60s，pause 20s run40s,5cycles破至菌体由浑浊变为澄清。
加100μl20%TritonX－100，冰上放置30min。
（10)将裂解液分入1、5ml离心管中，4℃离心12krpm10min，取上清。
（11)吸取少量上清，加入蛋白电泳上样缓冲液，在沸水中煮3min。
离心（12krpm,1min），取上清作SDS-PAGE电泳，检测表达情况。
12、2 准备50%GST Sepharose4Bslurry（1)将原75%Glutathione Sepharose4B的slurry弹至混匀。
（2) 取677μl原液/管，3krpm离心5min，弃上清。
（3)加500μl PBS，颠倒混匀，3krpm离心5min，弃上清。
反复5次。
（4)加500μl PBS，颠倒混匀，配成50%Glutathione Sepharose4B 备用。
12、3 GST融合蛋白的纯化（1)在新鲜制备的细胞裂解液上清中加入20μl50%Glutathione Sepharose4B，4℃，摇床上摇，反应30min～60min。
PullDown实验具体步骤及详细方法
PullDown实验详细步骤及详细方法实验目的：体外检测蛋白质与蛋白质之间互相作用。
用于验证两个蛋白的互相作用，或者挑选与蛋白互相作用的未知蛋白。
实验原理：利用重组技术将探针蛋白与GST〔Glutathione S transferase〕交融，交融蛋白通过GST与固相化在载体上的GTH〔Glutathione〕亲和结合。
因此，当与交融蛋白有互相作用的蛋白通过层析柱时或与此固相复合物混合时就可被吸附而别离。
试剂：NaCl， KCl，Na2HPO4，KH2PO4，Triton-100，IPTG(Merck分装)，PMSF 〔Amersco〕，Cocktaier〔Merck 539134〕，Immobilized Glutathione 〔PIERCE 15160〕实验操作程序：材料及试剂探针蛋白与GST交融的原核蛋白，裂解的细胞蛋白，或者组织蛋白提取物细胞蛋白裂解液，洗脱液：PBS及PBS+1%Triton-100PBS (1L)NaCl： 8gKCl： 0.2gNa2HPO4： 1.44gKH2PO4： 0.24g参加800ml蒸馏水，用HCl调节溶液的pH值至7.4，最后加蒸馏水定容至1L 即可，高温高压灭菌！4℃保存备用！PMSF(苯甲基磺酰氟) MW:174.19 工作浓度0.1-1mM，这里使用1mM，储存浓度100mM，将0.174g PMSF溶于10ml无水乙醇混匀即可！保持于-20℃或者4℃〔以下流程仅供研究原核蛋白A和真核过表达蛋白B互相作用〕1：原核交融蛋白A的获得1.1：将编码蛋白A与GST的重组质粒化转BL21(DE3)菌株1.2：挑取单个克隆到含有5mlLB(+100ug/mlAmp)的10ml试管里，37℃培养过夜1.3：将培养菌液转移到含有500ml LB(+100ug/mlAmp)的1L锥形瓶中，37℃，225rpm培养至OD600≈1.0-1.5左右，参加适当浓度的IPTG，在适当温度下培养适当时间〔诱导条件需要根据不同的蛋白做调整〕，6000g，10分钟，4℃离心搜集细菌，去尽上清，将菌体至于-20℃放置O/N1.4：室温冻融菌体，马上置于冰上，每500ml培养液参加10-20ml细菌裂解液〔PBS+1%Triton-100+PMSF〕，吹打混匀1.5：冰上超声破碎，开2秒，停9秒，总40-60分钟。
pull down 蛋白表达
pull down 蛋白表达（最新版）目录1.Pull-down 蛋白表达的概念2.Pull-down 蛋白表达的过程3.Pull-down 蛋白表达的应用4.Pull-down 蛋白表达的优缺点正文1.Pull-down 蛋白表达的概念Pull-down 蛋白表达是一种用于研究蛋白质之间相互作用的实验技术。
通过这一技术，可以识别与某个目标蛋白质相互结合的其他蛋白质，从而揭示蛋白质之间的联系。
这种方法主要依赖于亲和色谱法，利用目标蛋白质与某种固相载体上的亲和标签结合，从而将带有目标蛋白质的复合物从溶液中分离出来。
2.Pull-down 蛋白表达的过程Pull-down 蛋白表达的过程主要包括以下几个步骤：（1）制备亲和载体：将固相载体与亲和标签（如 FLAG、HA 等）融合，制备成亲和载体。
（2）表达目标蛋白质：在实验体系中表达带有亲和标签的目标蛋白质。
（3）结合：将表达的目标蛋白质与亲和载体混合，让目标蛋白质与亲和载体上的亲和标签结合。
（4）洗脱：用适当的缓冲液将结合后的复合物从固相载体上洗脱下来。
（5）鉴定：通过 Western Blot 等方法鉴定洗脱下来的蛋白质。
3.Pull-down 蛋白表达的应用Pull-down 蛋白表达技术广泛应用于蛋白质组学研究、蛋白质相互作用网络构建、蛋白质功能研究等领域。
通过这一技术，科学家们可以深入了解蛋白质之间的相互关系，为研究生物过程提供重要线索。
4.Pull-down 蛋白表达的优缺点优点：（1）操作简便，实验周期较短；（2）可识别与目标蛋白质相互作用的蛋白质；（3）可用于研究蛋白质组中的多种蛋白质。
gst pull-down实验流程
GSTPulldown实验流程一、实验准备阶段1.确定实验目的（1）确定进行GSTPulldown实验的目的和研究问题（2）定义所需的实验指标和结果参数2.准备实验材料（1）准备所需的细胞或组织样本（2）提取或购买GST标记的蛋白二、样品处理与制备1.细胞处理（1）处理细胞以获得所需的细胞提取物（2）对细胞提取物进行蛋白浓缩或纯化2.样品制备（1）将GST标记的蛋白与细胞提取物混合（2）进行样品预处理如加入缓冲液等三、GSTPulldown实验1.准备GSH亲和树脂（1）将GSH亲和树脂进行预处理和平衡（2）加入样品到GSH亲和树脂上2.亲和纯化（1）将混合样品与GSH亲和树脂一起孵育（2）清洗亲和树脂以去除非特异性结合物3.Elution（1）使用Elution缓冲液洗脱目标蛋白（2）收集洗脱的蛋白样品并保存四、蛋白分析与检测1.SDSPAGE分析（1）将洗脱的蛋白样品进行SDSPAGE电泳分析（2）观察蛋白条带的大小和清晰度2.Westernblot检测（1）将SDSPAGE分离的蛋白转移至膜上（2）使用特异性抗体进行GST标记蛋白的检测五、数据分析与结果解释1.带图像分析（1）分析SDSPAGE和Westernblot的图像（2）计算目标蛋白的相对含量和表达水平2.结果解释（1）根据实验结果解释GSTPulldown实验的结论（2）分析实验结果与预期结果的一致性和差异六、结果验证与文献探索1.实验验证（1）重复实验以验证结果的可重复性和稳定性（2）进行相关实验以进一步验证结论2.文献探索（1）检索相关文献并对实验结果进行比对和验证（2）吸收和借鉴相关研究的成果，完善研究结论。
pull down 实验流程
pull down 实验流程英文回答：Pull down is a common phrase used in various contexts, and its meaning can vary depending on the specific situation. In general, it refers to the action of bringing something down or lowering it from a higher position. Letme explain it further with some examples.In a physical sense, pulling down can refer tophysically bringing something down. For example, if youwant to remove a poster from a wall, you would pull it down. Similarly, if you want to demolish a building, you wouldpull it down using heavy machinery or other tools. Another example is when you want to close a window blind, you would pull it down to cover the window.In a metaphorical sense, pulling down can refer to reducing or decreasing something. For instance, if you want to lower the volume of the music playing, you would pulldown the volume knob on the stereo. In a similar vein, if you want to decrease the temperature of a room, you would pull down the thermostat setting. This usage can also be applied to financial or economic situations. For example, if the stock market experiences a downturn, it means that the prices of stocks are being pulled down.Furthermore, pull down can also be used to describe the act of bringing someone's reputation or status down. This can happen through spreading negative rumors or engaging in malicious gossip. For instance, if someone spreads false rumors about a celebrity, they are trying to pull downtheir reputation. Similarly, in a competitive environment, people may try to pull down their rivals by spreading negative information about them.中文回答："Pull down"（拉下）是一个常用的短语，其含义可以根据具体情况而有所不同。
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Pull down
一、原理
Pull-down又叫做蛋白质体外结合实验，是在外源条件下检测蛋白质间相互作用的方法。
基本原理：将靶蛋白-GST融合蛋白亲和固化在谷胱甘肽亲和树脂上，充当“诱饵蛋白”，目的蛋白溶液过柱，可从中捕获与之相互作用的结合蛋白，洗脱结合物后通过SDS-PAGE电泳分析，验证两种蛋白间的相互作用或筛选相应的目的蛋白；“诱饵蛋白”一般采用原核表达（也可以通过其他方式）获得，而“捕获蛋白”可以是细胞裂解物、纯化蛋白或表达系统获得的蛋白。
二、实验流程
1、构建带标签的诱饵蛋白原核表达载体（带his或GST标签）；
2、载体转化大肠杆菌，表达诱饵蛋白（这一步比较关键，很多蛋白原核表达会形成包涵体，
极大影响后续实验，我们采用自诱导培养基培养细菌，使得包涵体形成的几率大大降低）；
3、裂解细菌，裂解液过柱子（特异结合his或GST标签）；
4、待测样品裂解，裂解液过柱子，互作蛋白被吸附在柱子；
5、清洗，离心，去除未结合的杂蛋白；
6、洗脱，得到诱饵蛋白及其互作蛋白的复合物；
7、下一步根据实验目的可以去做Western blot或质谱
1）如要验证某个蛋白X与诱饵蛋白互作，则拿上一步的蛋白复合物去孵育X的抗体，做Western blot；
2）如要寻找诱饵蛋白的所存在的可能的互作蛋白，则拿上一步的蛋白复合物去做LC-MS/MS，对照组、实验组的复合物分别做LC-MS/MS；
三、结果
GST：对照；
GST-X：实验；
Y：目的蛋白溶液
图1 pull down验证两个蛋白互作结果
Pull down寻找互作蛋白的结果是两组质谱结果，可参考TAP/MS的结果。