人颗粒溶素与EGFP基因融合表达载体的构建及其在鼠巨噬细胞RAW264.7中的表达
EBF3与EGFP融合蛋白表达载体的构建及其在HepG2中的表达
EBF3与EGFP融合蛋白表达载体的构建及其在HepG2中的表达作者：毛丽萍王惠民, 王跃国, 汪晓莺【摘要】目的: 构建早期B细胞因子3（EBF3）与增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的融合基因真核表达载体pEGFP/EBF3, 使EBF3EGFP 融合蛋白在人肝癌细胞株HepG2中得到表达。
方法: 采用RT PCR 技术, 从人胎盘组织总RNA中逆转录并扩增出EBF3全长编码基因, 构建EBF3与EGFP的融合基因真核表达载体pEGFP/EBF3, 用脂质体转染技术将pEGFP/EBF3导入HepG2, 使EBF3EGFP融合蛋白得到表达。
结果: 经转化细菌、抽提质粒、酶切鉴定和DNA序列分析证实, EBF3基因已正确插入pEGFP N1中EGFP基因的上游, 获得融合基因表达载体pEGFP/EBF3。
将pEGFP/EBF3导入HepG2细胞24 h后, 在倒置荧光显微镜下可观察到EBF3EGFP融合蛋白主要表达于核内, 转染pEGFP/EBF3和pEGFP N1后48 h的转染效率分别为52%和59%。
Western blot证实转染pEGFP/EBF3后24 h和48 h细胞质和细胞核中均检出相对分子质量（Mr）为87 000的EBF3EGFP融合蛋白, 转染pEGFP/EBF3后48 h和72 h, S期细胞比例均明显高于pEGFP N1转染细胞组和未转染细胞组, 表明EBF3基因的导入可诱导细胞从G1期向G2期发展, 从而促进细胞增殖。
结论: 成功构建了真核表达载体pEGFP/EBF3, 并在HepG2细胞中进行了表达, 为进一步研究EBF3的功能提供实验基础。
【关键词】早期B细胞因子3; 融合蛋白; 增强型绿色荧光蛋白; HepG2细胞［Abstract］ AIM: To construct the eukaryotic expression vector for early human B cell factor 3(EBF3) fused with the enhanced green fluorescent protein (EGFP) and express the fusion protein EBF3EGFP in HepG2 cells. METHODS: The intact EBF3 gene was amplified from RNA isolated from the placental tissue by RT PCR. Then it was inserted into the pEGFP N1 vector to construct the recombinant eukaryotic expression vector pEGFP/EBF3. The fusion protein EBF3EGFP was expressed in HepG2 cells by the transfection of pEGFP/EBF3 into the cells. RESULTS: The pEGFP/EBF3 recombinant expression vector was constructed and confirmed by DNA sequencing, enzymatic digestion and PCR identification. 24 h after the fusion protein EBF3EGFP was transfected wiht pEGFP/EBF3, it was observed mainly in the cellular nucleus under the inverted fluorescence microscope. Both pEGFP/EBF3 and pEGFP N1 were transfected into human HepG2 cells. 24 h after the transfection, the proportion of transfection was about 52% and 59%, respectively. Western blot analysis confirmed that the EBF3EGFP fusion proteins ofMr 87 000 were detected in the cytoplasmic and nuclear protein of HepG2 transfected with pEGFP/EBF3 for 24 h or 48 h. The cell proportion in S phase increased in HepG2 cells transfected with pEGFP/EBF3 in comparison with HepG2 cells transfected with pEGFPN1 or untransfected. These findings suggested that the transfection of EBF3 gene into HepG2 induced the cell proliferation from G1 phase to G2 phase by increasing the number of cells. CONCLUSION: The construction of pEGFP/EBF3 eukaryotic expression vector and the expression of EBF3EGFP fusion protein in HepG2 cells lay a foundation for further study of the relationship between EBF3 and its growth and the proliferation of tumor cells.［Keywords］early B cell factor 3; recombinant fusion protein; EGFP; HepG2 cell［摘要］目的: 构建早期B细胞因子3（EBF3）与增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的融合基因真核表达载体pEGFP/EBF3, 使EBF3 EGFP融合蛋白在人肝癌细胞株HepG2中得到表达。
人颗粒溶素在小鼠巨噬细胞中的表达及其致细胞损伤与诱导凋亡的作用
人 颗 粒 溶 素 在 小 鼠 巨噬 细 胞 中 的 表 达 及 其 致 细 胞 损 伤 与 诱 导 凋 亡 的 作 用
伊正君 ， 朱道银 ， 李俊明 ， 杨 健， 何永林 ，曾 伟 ， 李 娜 （ 蕈吠 科大学微生物学与免疫学教研室， 重庆 ４０ １） ００６
（ ｓ质 亚 克隆 入 ｐ ｕ ＣＡ． 真 核 表 达 载 体 中 ，鉴 定 正 确 后 Ｉ Ｂｄ Ｆ １ 转 染 不 种 系来 源 的 小 鼠 瞧 腔 巨 噬 细 胞 采 片 Ｒ —Ｃ 及 免 ＿ ＴＰ Ｒ 】
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疫 细 胞 化学 染 色 法 检测 Ｇ Ｓ的表 达 ：通 过 测 定 转 染 细 胞 培 养 Ｌ
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小鼠Ipr1基因与EGFP基因融合表达载体的构建及其在鼠巨噬细胞中的表达
论著文章编号:1007-8738(2008)03-0231-04小鼠Ipr1基因与EGFP 基因融合表达载体的构建及其在鼠巨噬细胞中的表达李 娜,朱道银3,帖儒修,王瑜伟(重庆医科大学免疫学教研室,重庆400016)收稿日期; 接受日期3作者简介李 娜(),女,山东滨州人,助教,博士生T 3268865;2f _@633,2z y@C o n str uct i on of a fusi o n gene expr essi on vector con ta i n i n g m ou se Ipr 1and EGFP and i ts expr essi o n i n m ur i n e ma crophageL I N a,ZHU D ao 2yin 3,T I E Ru 2xiu,WA N G Y u 2weiDepa rt m ent of I mm unol og y,Chongqing University of M edical Sci 2ence s,Chongqing 400016,China[Abstra ct]A I M :T o con struc t an e uka ryo tic e xp re ssi onve c to r con ta i n i ng t he fu si on gene o f mo use I p r1a nd EGFP a nd t o study i ts expre ssi on i n m uri ne m ac ropha ge RA W264.7.M ETHODS:The cod i ng se que nce o f I p r1ge ne wa s am p li 2fi e d from the to ta l RNA of C57BL /6J m ouse thy m u s by R T 2PC R.The ge ne wa s c l o ne d i n t o pEGFP 2C1a nd the re com 2b i nan t p la sm i d wa s i de nti fi e d by PC R ,re s tri c t e ndonuc l e a se d i ge s ti on a nd se quenc i ng.Then the p EGFP 2I p r1w a s tra ns i 2e ntl y tra nsfe c te d i n t o RA W 264.7.The e xp re ssi on of I p r1ge ne a nd fus i o n p ro te in wa s de tec te d by R T 2PC R a nd l a se r sc a nni ng confoc a l m i c ro scop y .RESU L TS:The w ho l e cod 2i ng se que nc e o f I p r1w a s succe ssfu ll y am p li fi e d .The re com 2b i nan t p la sm i d wa s i de nti fi e d by PC R ,re s tri c t e ndonuc l e a se d i ge s ti on a nd se que nc ing .The fus i on p r o te i n w a s succe ss 2fu ll y exp re sse d i n the ta rge te d ce l ls a nd its l o ca li za ti on w a s i n nuc l e us .CO NCL US I O N:The euka ryo ti c e xp re ssi on ve c 2t o r pEGFP 2I p r1ha s be e n suc ce ssfu l ly co ns truc te d .The fu 2si on p r o t e i n ca n be e x p re s se di n m u ri ne m a c rop ha geRAW264.7a nd l oc a te d in nuc l e u s .[Keywor d s]I p r1ge ne;tube rc ul o sis;pEGFP 2C1;l oc a ti o n[摘要] 目的:构建小鼠胞内病原体抗性基因1(I pr1)基因与EG FP 基因融合表达载体,观察小鼠I p r1基因在小鼠巨噬细胞株RA W26417中的表达。
pEGFP_N3_t_PA真核表达质粒的构建及其在成纤维细胞中的表达
3山东省优秀中青年科学家科研奖励基金资助项目(2004BS01012); 33通讯作者:E -mail :grli66bethesda @ 收稿日期:2008-06-20pEGFP -N3-t -PA 真核表达质粒的构建及其在成纤维细胞中的表达3王 栋 何成强 杨桂文 李国荣33(山东师范大学生命科学学院动物抗性生物学重点实验室,250014,济南∥第一作者24岁,男,硕士生)摘要 目的 利用基因工程技术克隆人组织纤溶酶原激活物(t -PA )基因并构建一种能高效、安全表达t -PA 的pEG FP -N3-t -PA 真核表达重组质粒,为进一步研制转基因动物奠定基础.方法 采用高效T riz ol 试剂快速从黑色素瘤细胞中提取总RNA ,RT -PCR 获得t -PA cDNA ,并将真核表达质粒pEG FP -N3和t -PA 基因片段分别双酶切,将回收的pEG FP -N3大片段(4.7kb )与t -PA 基因片段(1.1kb )重组.对pEG FP -N3-t -PA 质粒进行酶切鉴定和基因测序鉴定.脂质体介导pEG FP -N3-t -PA 转染成纤维细胞(NIH 3T 3),并用RT -PCR 法从mRNA 水平检测t -PA 的表达情况,用倒置荧光显微镜检测、分析其在NIH 3T 3细胞中的表达.结果 成功地从黑色素瘤细胞中克隆了t -PA 基因,并构建了以pEG FP -N3为载体的真核表达质粒载体,并能在真核细胞中表达、分泌t -PA.结论 含t -PA 基因真核表达质粒构建成功.关键词 组织纤溶酶原激活物; 真核表达质粒载体; 基因克隆; 成纤维细胞中图分类号 Q 344.13组织型纤溶酶原激活剂(tissue -type plasminogen activator ,t -PA )是一种丝氨酸蛋白酶,在体内广泛分布于血管内皮细胞、脑、成熟的卵母细胞、输卵管、胰腺等组织[1].它是由527个氨基酸组成的单链丝氨酸蛋白酶,具有选择性地在纤维蛋白表面活化纤溶酶原的性质,除参与机体凝血和纤溶的平衡调控外,还具有高效、特异的溶栓作用,是目前防治血栓性疾病最有效的药物之一[3,4].本研究用逆转录-聚合酶链式反应(Reverse T ranscriptase RT -PCR )技术,成功地从黑色素瘤细胞中克隆了人t -PA cDNA ,构建了含t -PA 基因的pEG FP -N3-t -PA 真核表达重组质粒载体,以期为探讨基因防治、以及转基因动物的研究奠定基础[1,2].1 材料与方法1.1 主要试剂 pEG FP -N3真核表达质粒由本实验室保存,总RNA 提取试剂盒,质粒提取试剂盒,RT -PCR 试剂盒,大肠杆菌菌株E .coli DH5α由天根生化公司提供,限制性内切酶,T 4DNA 连接酶,Ex T aq 酶、pM D18-T 载体由大连宝生生物公司提供;Lipofectamine 2000购于Invitrogen ;黑色素瘤细胞,成纤维细胞系(NIH 3T 3)由本实验室保存.其余试剂为电泳纯或分析纯.1.2 t -PA 基因引物设计 从G enBank 中查找下载人的t -PA 基因序列,由MEG A 4.0分析软件对t -PA 序列进行分析,阅读其框架,选取其具有功能的1060bp 的片段,根据引物设计原则设计一对引物,其5′端引物引入Hind Ⅲ酶切位点,3′端引物引入BamH I 酶切位点,并分别在上、下游引物的5′端引入4个保护碱基.上游引物是:5′-CG AT CG AAG CTT CG ATG T CTT AT C AGGG AAAC AG TG ACTG CT -3′(Hind Ⅲ);下游引物是:5′-C ATG ACGG AT CCCGG T CG C ATG TTG T C ACG-3′(BamH I ).1.3 t -PA 基因cDNA 克隆 依据T rizol 试剂盒说明,从人黑色素瘤细胞中提取总RNA ,按逆转录试剂盒使用说明进行RT -PCR 反应合成cDNA 第一链,然后以其为模板进行PCR 反应.取逆转录产物1μl ,加入5μl 10×Reaction Bu ffer ,4μl dNTP 混合物(2.5mm ol ΠL ),1μl Pyrobest DNA 聚合酶(2U Πμl ),t -PA 上游引物、下游引物各1μl ,加ddH 2O 至总体积50μl.将反应体系置于PCR 仪中,94℃预变性5min ,94℃30s ,56℃45s ,72℃1min ,31个循环后72℃延伸10min.1.0%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物,并按回收试剂盒说明对RT -PCR 产物快速纯化回收.1.4 PCR 扩增产物的克隆和鉴定 PCR 产物回收后,在T 4DNA 连接酶的作用下,与pM D18-T 载体连接,16℃水浴4h ,连接产物转化入E .coli DH5α感受态细胞.37℃培养过夜,挑取转化生长的阳性菌落,应用质粒提取试剂盒提取重组质粒,分别用PCR 和双酶切对重组质粒进行鉴定.并送菌种至华大基因科技公司对阳性克隆片段进行双向测序分析.9012008年12月第23卷 第4期山东师范大学学报(自然科学版)Journal of Shandong N ormal University (Natural Science )Dec.2008V ol.23N o.41.5 pEG FP -N3-t -PA 真核表达重组质粒的构建[5] 用Hind Ⅲ和BamH I 双酶切回收的t -PA 片段定向插入用同法酶切的pEG FP -N3载体启动子下游,得到重组质粒pEG FP -N3-t -PA.构建过程见图1.1.6 pEG FP -N3-t -PA 重组质粒的鉴定 用构建的pEG FP -N3-t -PA 重组质粒转化E .coli DH5α感受态细胞,筛选阳性克隆,扩增,提取并纯化重组质粒DNA ;将重组质粒用双酶切(Hind Ⅲ和BamH I )鉴定.1.7 pEG FP -N3-t -PA 真核表达重组质粒转染成纤维细胞 将NIH 3T 3细胞培养至对数生长期,接种于6孔板,待细胞密度为70%～80%时,用Lipofectamine 2000转染试剂盒进行转染,转染方法按说明书进行.重组质粒量为2μg Π孔.加入转染试剂和质粒后,细胞放置37℃5%C O 2孵育箱孵育4h ,去除转染复合物并加入含10%小牛血清的新鲜培养液,培养24～48h ,荧光显微镜下观察.1.8 RT -PCR 法检测质粒转染成纤维细胞后t -PA 基因的mRNA 表达 收集培养的成纤维细胞(1.5×106个Πm l ),按T rizol 试剂盒说明书提取总RNA ,并以它为模板进行RT -PCR ,扩增t -PA cDNA ,其程序同前.图1 pEG FP -N3-t -PA 构建图图2 人黑色素瘤细胞中t -PA 基因的RT -PCR 产物1.DNA M arker D L2000;2、3、4、5.t -PA 基因RT -PCR 扩增产物.图3 pM D18-T -t -PA 重组质粒的鉴定结果1.重组质粒pM D18-T -t -P A 经PCR 扩增t -P A 基因产物;2.质粒pM D18-T -t -PA ;3.重组pM D18-T -t -PA 经Hind Ⅲ和BamH I 双酶切;4.DNA M ark D L2000plus.2 结 果2.1 t -PA 基因片段的扩增 用所设计的引物,对人黑色素瘤细胞中的t -PA 进行RT -PCR 扩增,其扩增的基因片段大约为1.1kb ,其中含酶切位点、起始密码子和终止密码子,结果见图2.2.2 t -PA 基因片段与pM D18-T 质粒连接和重组质粒的鉴定 纯化的PCR 产物经T 4DNA 连接酶与pM D18-T 质粒连接后,转化DH5α,随机挑选出阳性重组子菌落进行扩增培养,用PCR 法扩增出约1.1kb 的t -PA 基因片段;同样用Hind Ⅲ和BamH I 双酶切重组质粒也可分离到1.1kb 的基因片段和开环质粒pM D18-T (2.6kb ).结果见图3.2.3 测序结果及比对分析 将华大公司测序结果与G ene Bank 中的t -PA cDNA 序列进行比对,结果完全一致,见图4.2.4 t -PA 基因片段与pEG FP -N3质粒连接和重组质粒的鉴定 纯化的PCR 产物经T 4DNA 连接酶与pEG FP -N3质粒连接后,转化DH5α,随机挑选出阳性重组子菌落进行扩增培养,用PCR 法扩增出约1.1kb 的t -PA 基因片段;同样用Hind Ⅲ和BamH I 双酶切重组质粒也可分离到1.1kb 的基因片段和开环质粒pEG FP -N3(4.7kb ),结果见图5.2.5 pEG FP -N3-t -PA 质粒转染NIH 3T 3细胞后融合蛋白的表达 采用脂质体法将pEG FP -N3-t -PA 质粒转染NIH 3T 3细胞24h 后,倒置荧光显微镜下观察,见转染后的NIH 3T 3细胞发出的绿色荧光,说明质粒转染NIH 3T 3细胞后有融合蛋白的表达,见图6.2.6 RT -PCR 法检测t -PA 基因转染成纤维细胞后t -PA mRNA 表达水平 经对pEG FP -N3-t -PA 转染的细胞总RNA 进行扩增,结果转染重组质粒组扩增出约1.1kb 左右的cDNA 片段,见图7.11第23卷山东师范大学学报(自然科学版)第4期 图4 DNAstar 将测得序列与G enBank中已知序列E01466比对结果图5 pEG FP -N3-t -PA 重组质粒的鉴定结果1.D N A M ark D L2000plus ;2.重组质粒pEG FP -N3-t -P A 经H indⅢ和BamH I 双酶切后产物;3.质粒pEG FP -N3-t -PA ;4.重组质粒pEG FP -N3-t -P A 经PCR 扩增t -P A 基因产物.图6 pEG FP -N3-t -PA 质粒转染 NIH 3T 3细胞后融合蛋白的表达图7 t -PA 转染NIH 3T 3RT -PCR 结果1.DNA M arker D L2000;2.重组质粒pEG FP -N3-t -PA 转染NIH 3T 3细胞后t -PA 基因RT -PCR 扩增产物;3.重组质粒pEG FP -N3-t -PA 经PCR 扩增t -PA 基因产物;4.未转染质粒的NIH 3T 3细胞t -PA 基因RT -PCR 扩增产物.3 讨 论人组织型纤溶酶原激活剂(t -PA )由于对血栓具有较好的特异性亲和作用,溶栓效果好,溶栓后再出血的发生率低,在心肌梗塞症状发作后的短时间内给药效果明显,安全性高已经成为治疗血栓性疾病的首选药[5].但是其半衰期短,需持续用药,费用极为昂贵又使其大规模应用于临床受到了限制,因此将外源性t -PA基因导入体细胞,使之在局部持续分泌出活性较高的基因产物,以防治血栓形成的方法,具有良好的应用前景[6,7].用质粒携带目的基因转染靶细胞可以获得良好的目的基因表达,并且质粒制备简单,成本低,较少产生抗原性,重复使用性好,安全性高,适合临床应用[8].我们选用的真核质粒pEG FP -N3是一种新型真核表达载体,能在大多数哺乳动物细胞内高效表达,该载体除保留有能在多种细胞中促进重组蛋白高表达的人巨细胞病毒(C M V )增强启动子及易于插入外源基因片段的多克隆位点外,还含有EG FP 报告分子,当其和目的基因一起融合表达时,无需加任何底物、荧光性质稳定、对细胞无毒性、使用方便.这为我们后期转基因动物的鉴定及基因表达位置的确定奠定了基础.本研究通过应用基因重组技术,成功构建了pEG FP -N3-t -PA 真核表达载体;将该载体转染NIH 3T 3细胞,荧光显微镜下观察证实该载体在真核细胞内可成功表达t -PA -EG FP 融合蛋白,这为今后血栓相关性疾病的t -PA 基因治疗研究奠定了坚实的基础,也进一步为利用显微注射法制备转基因动物铺平道路.111第4期王 栋,等:pEG FP -N3-t -PA 真核表达质粒的构建及其在成纤维细胞细胞中的表达第23卷 第23卷山东师范大学学报(自然科学版)第4期 4 参考文献[1] H oylaerts M,Rijken D C,Iijnen H R,et al.K inetics of the activation of plasm inogen by human tissue plasm inogen activator[J].J Biol Chem,1981,(257):2912[2] 张永忠.转基因动物的应用与展望[J].山东师范大学学报(自然科学版),2001,16(1):83～87[3] C ollen D.On the regulation and control of fibrionlysis[J].Thromb Haem ostasis,1980,43(1):77[4] Bell L D.Chem ical synthesis,cloning and expression in mammalian cells of a gene coding for human tissue-type plam inogen activator[J].G ene,1998,63(4):155[5] 萨姆布鲁克J,拉塞尔D W.分子克隆实验指南第三版[M].黄培堂等译.北京:科学出版社,2002.45～105[6] W augh J M,K attash M,Li J.et al.G ene therapy to prom ote thromboresistance:Local overexpression of tissue plasm inogen activator to prevent arterialthrombosis in an in viv o rabbit m odel[J].Proc Natc Acad Sci US A.1999,96(3):1065～1070[7] 张会亮,王建英,等.tPA特性及其利用转基因乳腺生物反应器生产研究进展[J].山东医药,2008,48(1):143～144[8] 庄文忠.动植物生物技术的交叉渗透及展望[J].山东师范大学学报(自然科学版),2002,17(1):79～80CLONING OF THE t-PA GENE AN D CONSTRUCTION OFpEGFP-N3-t-PA EXPRESSION VECTORWang D ong He Chengqiang Y ang G uiwen Li G uorong(C ollege of Life Science,K ey Laboratory for Animal Anti-S tress,Shangdong N ormal University,250014,Jinan,China)Abstract Objective T o construct a recombinant eukary otic expressing vector pEG FP-N3-t-PA including functional region of human tissue-type plasminogen activator(t-PA)gene to provide a basis for further study on the research of transgenic animals.Methods The t-PA cDNA was obtained from melanoma cell with RT-PCR and inserted into the Hind III and BamH I site of the plasmid pEG FP-N3,then,pEG FP-N3-t-PA was trans fected into NIH 3T3mediated by Lipfectin2000T M.The recombinant plasmid was proved success ful by restriction enzyme digestion and DNA sequencing.The expression of the chimeric protein was con firmed by fluorescent microscope and the t-PA expression level was tested by RT-PCR.The t-PA gene was cloned and the pEG FP-N3-t-PA vector was constructed.The t-PA expression in the eukary otic cell could be detected in the group with trans fected t-PA gene.The recombinant eukary otic expression plasmid is success fully constructed.K ey w ords T issue-type plasminogen activator; Eukary otic expression plasmid; gene cloning; NIH3T3 211。
小鼠Ipr1基因与EGFP基因融合表达载体的构建及其在鼠巨噬细胞中的表达
小鼠Ipr1基因与EGFP基因融合表达载体的构建及其在鼠巨噬细胞中的表达作者：李娜, 朱道银, 帖儒修, 王瑜伟【摘要】目的: 构建小鼠胞内病原体抗性基因1（Ipr1）基因与EGFP基因融合表达载体, 观察小鼠Ipr1基因在小鼠巨噬细胞株中的表达。
方法: 从C57BL/6J小鼠胸腺组织提取总RNA, 以RT PCR法调取Ipr1基因编码序列, 克隆至pEGFP C1载体中, 筛选阳性克隆作PCR、酶切及测序鉴定后得到pEGFP Ipr1, 脂质体瞬时转染小鼠巨噬细胞株, 以空质粒pEGFP C1转染组作为对照。
采用RT PCR法检测Ipr1的RNA水平表达及用激光共聚焦显微镜观察融合蛋白的表达及细胞内定位。
结果: 扩增出小鼠Ipr1基因编码序列, 经PCR、酶切及测序鉴定证明得到正确的重组质粒pEGFP Ipr1, 脂质体瞬时转染小鼠巨噬细胞株得到了成功表达, Ipr1基因表达产物定位于细胞核内。
结论: 成功地调取小鼠Ipr1基因, 构建了小鼠Ipr1基因与EGFP基因融合表达载体并在小鼠巨噬细胞株得到了成功表达。
Ipr1编码蛋白定位于细胞核内, 提示其是一种调节蛋白。
【关键词】 Ipr1基因结核病绿色荧光蛋白定位[Abstract]AIM: To construct an eukaryotic expression vector containing the fusion gene of mouse Ipr1 and EGFP andto study its expression in murine macrophage . METHODS: The coding sequence of Ipr1 gene was amplified from the total RNA of C57BL/6J mouse thymus by RT PCR. The gene was cloned into pEGFP C1 and the recombinant plasmid was identified by PCR, restrict endonuclease digestion and sequencing. Then the pEGFP Ipr1 was transiently transfected into . The expression of Ipr1 gene and fusion protein was detected by RT PCR and laser scanning confocal microscopy. RESULTS: The whole coding sequence of Ipr1 was successfully amplified. The recombinant plasmid was identified by PCR, restrict endonuclease digestion and sequencing. The fusion protein was successfully expressed in the targeted cells and its localization was in nucleus. CONCLUSION: The eukaryotic expression vector pEGFP Ipr1 has been successfully constructed. The fusion protein can be expressed in murine macrophage and located in nucleus.[Keywords]Ipr1 gene; tuberculosis; pEGFP C1; location结核病位居单一病原体引起患者死亡的传染病之首, 全球每年死亡200余万人。
人骨保护素哺乳类表达载体的构建及初步表达
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（ ｈ ｎ ｄ ｅ ｃ ｌＣ ｌｅ ｅ Ｃ ｅ ｇ ｅ Ｍ ｄｉａ ｏ ｌｇ ・Ｃｈ ｎ ｅ ０ ７ ０ ・ Ｒ． ｈ ｎ ） ｅ ｇｄ ６ ０ ０ Ｐ． Ｃ ｉ ａ
Ａ ｓ ａｔ Ｏｂｅｔ ｅ ｏｃ ｎｔｕｔｔｅｍ ｍｍａｉ ｖｃｏ ｆ ｈ ｕ ｎｏ ｔ ｐｏｅｅｉ （ Ｇ）ａｄｅ ｐｅｓ ｂｔ ｃ：［ ｊｃｉ ］Ｔ ｏ ｓ ｃ ｈ ａ ｒ ｖ ｒ ｌ ｅｔｒ ｅｈ ｍａ ｓｅ ｒｔｇｒ ＯＰ ａ ｏｔ ｏ ｎ ｎ ｘ ｒｓ ｉ ｐｉ ｒｙｉ Ｃ ７ ｅ１ Ｍｅｈ ｄ ］Ａ ｔｒ ｈ ｏ ｌ ｅｃｄ ｄｇｎ ｆ ｈ ｕ ｎＯＰ Ｄ ａ ｍｐｉｅ ｎ ｔ ｒ ｉ ＯＳ ｌ ｍａ ｌ ｎ ｃ ．［ ｔｏ ｓ ｆ ｅ ｍｐ ｔ ｏ ｅ ｅ ｅｏ ｅ ｍａ Ｇ ｃ ＮＡ ｗ ｓ ｅｔ ｃ ｅ ｔ ｈ ａ ｌｉ ａ ｄ ｆｄ
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ＯＰ 功 能 的 哺 乳类 表 达 载 体 ； 为 高 效 、 Ｇ 此 稳定 表 达 Ｏ Ｇ 的研 究 奠 定 了基 础 。 Ｐ
［ 关键词］ 骨保护素 ； 载体 ； ＯＳ Ｃ ７细胞 ［ 中图分类号］ Ｒ３ ４ ［ 文献标识 码］ Ａ ［ 文章编号］ １０ —６ Ｘ（０ ６ ２—０ ００ ０ ２２６ ２０ ） ９０ ２—３
LMP3-EGFP融合蛋白真核表达载体的构建及其在HEK293细胞中的表达
摘
要
为构建人 Ｌ Ｐ ．Ｇ Ｐ融合蛋 白 Ｍ３ Ｆ Ｅ 真核表达 载体 ， 测其 在 Ｈ Ｋ９ 细胞 中的表 达及 定位， 并检 Ｅ ２３ 通过基 因重组 的方法构建
究发现的具有成骨诱导活性 的细胞 内蛋 白， ３ 有 种 不同的差 异 剪 切 体， 分别 命 名 为 Ｌ Ｐ 、 Ｍ ２和 Ｍ １Ｌ Ｐ Ｌ Ｐ 。Ｌ Ｐ Ｍ３ Ｍ ３由 １４个氨基 酸残基构成 ， ５ 氨基末
端含有一个 Ｐ Ｚ作用域。研究表明 Ｌ Ｐ Ｄ Ｍ ３在体外培
养时可促进 Ｂ Ｐ２ Ｏ Ｘ ｕ Ｘ Ｍ －、 Ｓ 、Ｒ ｎ２及碱性磷 酸酶等 骨组织特异性基因的表达， 并可在体 内诱导异位成
中 Ｃ
维普资讯
６ 期 １ ２ 方 法 ．
张大伟， ：Ｍ ３Ｅ Ｆ 等 Ｌ Ｐ 一Ｇ Ｐ融合蛋白真核表达载体的构建及其在 Ｈ Ｋ ９ Ｅ ２３细胞 中的表达
９３ ７
件 下 培养 ６ｈ， 含 １％ 胎 牛血清 的 Ｄ Ｍ 培 养液 ， 换 ０ ＭＥ
２ ０ Ｓ ｉ ｅｈ Ｅ ｇｇ ０ ７ ｃ．Ｔ ｃ ． ｎｎ ．
生物科学
Ｌ ３Ｅ Ｆ ＭＰ － Ｇ Ｐ融合蛋 白真核表达载体 的构 建及其在 ＨＥ ２ ３细 胞中的表达 Ｋ９
张大伟 胡蕴玉 李 立文 白文 涛 杨香 菊。 李文献 白建 萍
（ 四军医大学西 京医院全军骨科研究所 ， 第 西安 ７ ０ ３ ； 大学生命科学 院生物科学 系 ， １０ ２ 西北 西安 ７ ０ ６ ； １０９
１ ２ １ Ｌ ＇ 因获取 ． ． Ｍ１ ３基
继续培养 ４ ， ８ｈ 吸去培养液 ， Ｐ Ｓ冲洗细胞后倒 用 Ｂ
Zmp1的克隆表达及其对巨噬细胞的影响
Zmp1的克隆表达及其对巨噬细胞的影响目的：构建分枝杆菌锌离子依赖的金属蛋白酶1(zmp1)基因的原核表达载体,在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,对Zmp1重组融合蛋白进行纯化；构建分枝杆菌zmpl基因与增强型的绿色荧光蛋白(EGFP)融合的真核表达载体,验证其在RAW264.7细胞中的表达；探讨Zmpl蛋白对RAW264.7细胞的增殖活性、细胞周期、细胞凋亡以及吞噬体-溶酶体融合的影响。
方法：1.以卡介苗(BCG)基因组DNA为模板,采用PCR法扩增zmp1基因；定向克隆到原核表达载体pET-32a(+)的多克隆位点中,构建重组原核表达载体pET-32a(+)-zmpl；转化入大肠杆菌BL21(DE3)中经IPTG诱导表达,纯化获取Zmpl重组蛋白,表达产物经SDS-PAGE和Westernblot鉴定。
2.以BCG基因组DNA为模板,采用PCR法扩增zmp1基因；定向克隆到真核表达载体pEGFP-N1的多克隆位点中,构建重组真核表达载体p EGFP-N1-zmpl,并转染RAW264.7细胞,荧光显微镜观察绿色荧光蛋白表达,实时定量PCR(qRT-PCR)检测zmpl基因mRNA的表达水平。
3.用Zmpl重组蛋白作用RAW264.7细胞后24h, CCK-8法检测细胞的增殖活力；作用后48 h,流式细胞仪检测细胞的周期和凋亡4.将载体pEGFP-N1-zmpl瞬时转染RAW264.7细胞后24h,CCK-8法检测细胞的增殖活力；转染后48 h,流式细胞仪检测细胞的周期和凋亡。
5.减毒鼠伤寒沙门氏菌(SL7207)感染RAW264.7细胞(已转染载体pEGFP-N1-Zmpl或Zmpl重组蛋白作用),采用沙门氏菌荧光抗体和溶酶体相关膜蛋白标志物荧光抗体双标记,通过荧光显微镜观察Zmpl蛋白阻止吞噬体-溶酶体融合的作用。
结果：1.PCR法扩增出zmp1基因；定向克隆构建的原核表达载体pET一32a(+)-zmpl经双酶切及基因测序鉴定构建正确；经IPTG诱导在大肠杆菌BL21(DE3)中表达出重组Zmpl融合蛋白,相对分子量约为94 kDa,大小与预期融合蛋白相符；Western blot结果显示重组Zmpl融合蛋白可与His标签单克隆抗体特异性结合。
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人颗粒溶素与EGFP基因融合表达载体的构建及其在鼠巨噬细胞RAW264.7中的表达作者：伊正君，朱道银，李俊明，何永林，杨健，李娜【关键词】巨噬细胞Construction of a fusion gene expression vector containing human granulysin and green fluorescent protein gene and its expression in murine macrophage RAW264.7【Abstract】 AIM: To clone the human granulysin from activated cytotoxic Tlymphocytes (CTL), construct an eukaryotic expression vector containing the fusion gene of granulysin (GLS) and green fluorescent protein reporter and observe its expression in murine macrophage RAW264.7 strain. METHODS: The coding sequence of the granulysin was amplified from the total RNA of human CTL activated by allogenic antigen after reverse transcription by NestedPCR, inserted into pEGFPC1 plasmid and then transfected RAW264.7 cells. The expression of the fusion protein and GLS was detected by fluorescence microscope and RTPCR. The immunoreactive of the product was confirmed by immunocytochemistry method. RESULTS: The whole coding sequenceof GLS was successfully amplified as expected. The accurate open reading frame (ORF) of the fusion protein recon was confirmed by PCR, endonuclease digestion and sequencing. The fusion protein that was immunoreactive was successfully expressed in the targeted cells. CONCLUSION: Human granulysin can be expressed in murine macrophage RAW264.7 strain in a fusion protein pattern and retain its immunoreactivity.【Keywords】 granulysin； green fluorescent protein；macrophage； nestedPCR；immunoreactivity【摘要】目的: 克隆人天然颗粒溶素(granulysin，GLS)的编码序列并构建与绿色荧光蛋白(EGFP)基因融合的真核表达载体，观察人GLS在鼠巨噬细胞株RAW264.7中的表达. 方法: 提取培养并经同种异型抗原激活的人细胞毒性T淋巴细胞(CTL)细胞总RNA，经逆转录后以套式PCR方法扩增出GLS的编码序列，插入pEGFPC1质粒，鉴定正确后转染RAW264.7细胞，采用荧光显微镜及RTPCR法检测融合蛋白及GLS的表达，采用免疫细胞化学法确证表达产物的免疫反应性. 结果: 成功扩增出了人GLS完整编码序列的cDNA，经PCR及酶切、测序鉴定证明得到了读码框正确的融合蛋白重组子并在靶细胞中得到了成功表达，表达产物具有良好的免疫反应性.结论:人天然GLS能够在鼠巨噬细胞株RAW264.7中以融合蛋白的形式表达，其表达产物具有良好的免疫反应性.【关键词】颗粒溶素；绿色荧光蛋白；巨噬细胞；套式PCR；免疫反应性0引言颗粒溶素（granulysin，GLS）对细菌、真菌、原虫、肿瘤细胞等具有很强的广谱杀伤活性，因此对其免疫杀伤作用机制的研究对于开发天然、低毒、高效的新一代杀菌制剂以及研究人体的天然免疫过程具有重要意义. 为此我们直接从激活后的人外周血单个核细胞（PBMC）总RNA中扩增出GLS的cDNA编码序列并构建了与绿色荧光蛋白报告基因融合的真核表达载体，转染到鼠巨噬细胞株RAW264.7中进行了表达.1材料和方法1.1材料E.coli Top10, Clontech公司质粒载体pEGFPC1为本室保存;小鼠巨噬细胞株RAW264.7购自第三军医大学药理学教研室. 人外周血单个核细胞(PBMC)分离液及植物血凝素（PHA）购自第三军医大学试剂服务中心；质粒小量抽提试剂盒、PCR产物及凝胶回收试剂盒均购自上海华舜公司；限制性核酸内切酶BsPE I，BamH I购自NEB公司；小量组织/细胞总RNA抽提试剂盒、正常熔点琼脂糖（NMA）,高保真ProbestTaq酶、T4 DNA连接酶、逆转录试剂盒（Ver.3.0）、DNAMarker DL2000等均购自大连宝生物公司； GenePorter 2真核转染试剂为美国GTS公司产品；山羊抗人GLS抗体购自基因公司；即用型免疫细胞化学试剂盒购自武汉博士德；RPMI 1640培养液购自Gibco公司；小牛血清为杭州四季青公司产品.1.2方法根据GeneBank中人GLS的cDNA序列，共设计合成了4条引物：PG1: 5′GCGCTAGCGTATCTGTGGTAAACCCAGTG3′; PG2: 5′GCGGTACCCTTGCTTGACACTTTATTCTCG3′; PGE1: 5′GCTCCGGAAAGCTTCATATGAACCCAGGTCTGGTCTTCTC3′; PGE2: 5′TAGGATCCGTCGACGAGCTCTCAGAGGGGACCTGTAGAAG3′; 全部由大连宝生物公司合成. 由于表达产物定位于巨噬细胞胞质内表达，因此在PGE1引物设计中去除了GLS的分泌肽编码序列. 首先用PHA活化外周血单个核细胞，然后用同种异型抗原诱导、刺激其中的CTL细胞和NK细胞活化，从而启动GLS基因的转录. 方法是，无菌采集2份健康人静脉血各6 mL，肝素抗凝. 1500 r/min离心10 min，分别吸出上层血浆及白细胞层，然后用PBS缓冲液1∶1稀释白细胞，再按PBMC分离液说明，常规分离外周血单个核细胞. 取其中一份PBMC样本洗涤2次后以含100 mL/L自体血浆的完全RPMI 1640培养液重悬，调节细胞浓度为2×106/L，加入PHA使其终浓度为200 mg/L，置37℃，50 mL/L CO2培养箱中，培养24 h后加入另一份样本（此样本PBMC经灭活处理后以含100 mL/L灭活小牛血清的完全RPMI 1640培养液重悬）共同培养48 h后收获细胞.1.2.1GLS cDNA的扩增、克隆与测序抽提细胞总RNA，逆转录后调适相应的缓冲液，用高保真ProbestTaq酶取代试剂盒自带的HSTaq, 用引物PG1，PG2进行PCR扩增25个循环，获得包含目标序列在内的GLScDNA全长片段. 然后取产物2 μL为模板，以引物PGE1与PGE2进行套式扩增，反应条件为：94℃ 4 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，30个循环； 72℃延伸8 min. 10 g/L琼脂糖凝胶电泳进行检测. 纯化后以BsPE I，BamH I双酶切、回收，与同样处理的pEGFPC1载体大片段在16℃连接1 h，转化大肠杆菌TOP10，涂布于含30 mg/L卡那霉素LB平板上培养，次日挑取卡那霉素抗性单菌落，进行PCR鉴定，阳性克隆置3 mL含30 mg/L卡那霉素LB培养基中振摇增菌，小量抽提质粒，用BsPE I与BamH I进行双酶切鉴定，送上海博亚公司测序.1.2.2细胞转染及表达产物的检测RAW264.7细胞在含100 mL/L小牛血清的RPMI 1640培养基中，以24孔板置37℃，50 mL/L CO2培养，常规方法制作RAW264.7细胞爬片，至80%~90%汇片后按转染试剂盒说明进行转染，以pEGFPC1空质粒转染的RAW264.7细胞作为对照.转染72 h后分别收集实验孔及对照孔的细胞:①取出爬片进行荧光检测，观察融合蛋白的表达及分布；②以RTPCR法对GLS基因进行转录水平上的检测：抽提细胞总RNA逆转录，以PGE1, PGE2为引物，按上述条件进行扩增；③GLS表达产物的免疫学活性检测：取出爬片进行免疫细胞化学检测，具体方法是：PBS洗，40 g/L多聚甲醛固定，PBS洗，30 mL/L H2O2灭活内源性过氧化物酶10 min； PBS洗，滴加血清封闭液，室温20 min；滴加1∶300稀释的山羊抗人GLS抗体，4℃过夜；PBS洗，滴加生物素化的兔抗山羊抗体，室温20 min；PBS洗，滴加链酶亲和素生物素酶复合物（SABC）液，室温20 min；PBS洗，DAB避光显色20 min；苏木素复染，盐酸乙醇分化，脱水，透明，封片，观察. 2结果2.1GLS cDNA的套式PCR扩增两次PCR产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳后，分别在433，754 bp处见到一特异性目的片段，与理论预测的GLS全长cDNA序列大小相符(Fig 1).2.2重组质粒的PCR及酶切鉴定插入正确片段的重组菌落经PCR扩增后，电泳可见到与目的片段大小一致的PCR产物条带. 分别抽提质粒双酶切后琼脂糖凝胶电泳表明,酶切后产生一线性空载体条带及一条与理论预测值一致的目的片段(Fig 2).2.3GLS转录产物的RTPCR检测转染72 h后抽提细胞总RNA 以原引物作RTPCR重新扩增出目的片段为433 bp，与理论预测值完全相符(Fig 3).2.4GLS与EGFP融合蛋白的荧光检测转染72 h后融合蛋白表达产物主要定位于细胞质(Fig 4).2.5GLS表达产物的免疫细胞化学以山羊抗人GLS抗体为一抗，生物素化的兔抗山羊抗体为二抗，DAB显色可见GLS呈强阳性表达(Fig 5).3讨论一般认为清除结核杆菌等胞内寄生菌的感染主要依赖人体的细胞免疫反应，可以运用结核杆菌的单一［1］或融合形式［2］的保护性抗原构建基因疫苗激发人体的Th1型细胞免疫反应来防治结核病. 在这一过程中，细胞毒性淋巴细胞起着关键作用. 激活的CTL细胞和NK细胞产生的GLS是一种细胞毒性免疫效应分子. Ogawa等［3］认为血清GLS的水平是评价机体细胞免疫功能状态的新指标. Kida等［4］利用拉氏无胆支原体（Acholeplasma laidlawii）刺激人单核细胞来源的THP1细胞株，在其中检测到了GLS mRNA的表达，并认为特定刺激在巨噬细胞中诱导产生GLS可能是机体一种有效的抗微生物入侵的保护机制. 利用真核表达载体（如pcDNA3.1）已经在多种真核细胞株如YT，HuT78，COS7（非洲绿猴肾细胞）中表达出了具有生物学活性的GLS［5］. 绿色荧光蛋白是目前公认较为优良的一种标记基因，与目的基因融合后不会影响表达产物的生物学活性，新近Hanson等［6］采用绿色荧光蛋白作为报告基因与GLS作C端融合，也在YT细胞中得到了成功表达，但GLS在鼠巨噬细胞中的表达迄今为止未见报道. 我们利用套式RTPCR的方法从激活的人外周血PBMC中直接扩增出了GLS 的cDNA编码序列并构建了与绿色荧光蛋白的融合表达载体，在体外从细胞水平检测到了其转录与表达，这说明人GLS是能够定位在小鼠巨噬细胞胞质中进行表达的，从而为后续在活体动物模型中的应用及研究其免疫杀伤机制奠定了基础.【参考文献】［1］骆旭东, 朱道银, 陈全, 等. 结核分枝杆菌Ag85B和MPT64基因疫苗免疫原性的比较［J］.第四军医大学学报,2003; 24（17）:1630-1631.Luo XD, Zhu DY,Chen Q, et parison of immunogenicity of DNA vaccine encoding Mycobacterium tuberculosis Ag85B and MPT64［J］. J Fourth Mil Med Univ, 2003; 24（17）:1630-1631.［2］江山, 朱道银,蒋英,等.结核分枝杆菌Ag85BAg85A双抗原融合真核表达质粒的构建及表达［J］. 第四军医大学学报,2003;24（21）:1973-1975.Jiang S, Zhu DY, Jiang Y, et al.Construction of fused eukaryotic expression vector of Mycobacterium tuberculosis Ag85B and Ag85A antigens and its expression［J］. J Fourth Mil Med Univ, 2003;24（21）:1973-1975.［3］ Ogawa K, Takamori Y, Suzuki K, et al. Granulysin in human serum as a marker of cellmediated immunity［J］. Eur J Immunol, 2003; 33(7):1925-1933.［4］ Kida Y, Shimizu T, Kuwano K. Opposing roles of activator protein1 and CCAAT/enhancer binding protein beta in the regulation of inducible granulysin gene expression in a human monocytic cell line,THP1［J］. Immunology, 2002；107(4):507-516.［5］Hanson DA, Kaspar AA, Poulain FR, et al. Biosynthesis of granulysin, a novel cytolytic molecule［J］. MolImmunol， 1999； 36(7):413-422.［6］ Hanson DA, Ziegler SF. Fusion of green fluorescent protein to the Cterminus of granulysin alters its intracellular localization in comparison to the native molecule［J］. J Negat Results Biomed, 2004;3(1):2.（注：可编辑下载，若有不当之处，请指正，谢谢!）。