融合蛋白表达载体的构建
拟南芥转录因子TDF1的原核表达及多克隆抗体制备
拟南芥转录因子TDF1的原核表达及多克隆抗体制备周茜;曹志林;俞俞;杨仲南【摘要】在拟南芥花药发育过程中,MYB家族转录因子TDF1在调控绒毡层发育及后期功能上起到关键的作用.利用PCR方法扩增TDF1基因并克隆到原核表达载体pET-32a.将表达载体TDF1-pET32a转入大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG成功诱导表达了分子量约为56KD的TDF1融合蛋白.该融合蛋白主要以包涵体形式存在,分离出包涵体后进行可溶性处理作为抗原免疫家兔.制备出的多克隆抗血清经ELISA 测定效价为1∶2560,Western blot检测表明该抗血清与TDF1融合蛋白识别良好.TDF1抗体的制备有助于进一步从生化水平上研究TDF1在花药发育中的功能.【期刊名称】《上海师范大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2010(039)002【总页数】6页(P175-180)【关键词】原核表达;拟南芥;转录因子;TDF1;融合蛋白;多克隆抗体【作者】周茜;曹志林;俞俞;杨仲南【作者单位】上海师范大学,生命与环境科学学院,上海,200234;河南工程学院,资源与环境学院,郑州,451191;上海师范大学,生命与环境科学学院,上海,200234;上海师范大学,生命与环境科学学院,上海,200234【正文语种】中文【中图分类】Q511转录因子是指与靶基因启动子中的顺式作用元件发生特异性相互作用，并对转录过程起激活或抑制作用的DNA结合蛋白.MYB家族转录因子以保守的DNA结合域为共同特征，是植物最大的转录因子家族之一，R2R3-MYB转录因子是植物中数目最多的一类MYB蛋白，其N-端都含有包含2个重复的螺旋-转角-螺旋的R2R3 DNA结合结构域［1，2］.花药是植物的雄性生殖器官，是花粉发育的场所.绒毡层在花药发育过程中起着至关重要的作用，它释放酶复合物降解胼胝质，提供花粉发育所必需的营养物质，并参与调控花粉外壁的形成［3］.TDF1基因编码了一个拟南芥细胞核定位的R2R3-MYB家族转录因子.在花药发育早期，该转录因子特异性地在绒毡层，花粉母细胞和小孢子中高效表达.该基因突变，绒毡层发育异常，其功能出现紊乱，导致花粉不能形成，突变体呈雄性不育表型［4］.但是在生化水平上，TDF1在花药发育中的具体功能还不清楚.抗体的制备是在生化水平上研究蛋白质功能的一个重要途径.根据制备的原理和方法，抗体可分为多克隆抗体，单克隆抗体和基因工程抗体，其中多克隆抗体的制备方法比较成熟，过程简单，因此被广泛应用.由于一种抗原有多个不同的抗原决定簇，B淋巴细胞克隆可以识别每一个抗原决定簇，并产生出针对它们的抗体，因此这种异种免疫血清中含有的抗体是多克隆抗体［5］.利用原核表达的蛋白免疫动物来制备多克隆抗体是一种十分有效的方法.在本研究中，克隆获得TDF1基因，并构建了原核表达载体TDF1-pET32a，将其转入大肠杆菌BL21（DE3），经IPTG 诱导后在原核细胞中成功表达了这个蛋白.该融合蛋白主要以不溶的包涵体形式表达，以洗涤纯化溶解后的包涵体作为抗原免疫家兔，制备出了效价较高，特异性较强的多克隆抗体，这些工作为进一步用生化手段研究该转录因子的DNA结合位点和下游基因奠定了基础.1.1 试剂和材料1.1.1 质粒与菌株pMD18-T载体购自大连宝生物工程（TaKaRa）有限公司；原核表达载体pET-32a（+）购自北京鼎国生物技术有限公司；大肠杆菌感受态菌株DH5α及BL21（DE3）由本实验室提供.1.1.2 生物学试剂T4 DNA连接酶、限制性内切酶Sac I、Xho I和Prjmestar DNA聚合酶购自大连宝生物工程（TaKaRa）有限公司；福氏完全佐剂、福氏不完全佐剂、dNTPs、PCR产物回收试剂盒、Trjs、SDS、TEMED及IPTG等常用分子生物学试剂购自北京鼎国生物技术有限公司；辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗兔IgG、ECL化学发光检测试剂盒、PVDF膜购自艾比玛特生物医药（上海）有限公司；引物由Invjtrogen公司合成.1.2 方法1.2.1 TDF1基因的克隆参照GenBank中序列设计用于扩增TDF1基因的引物.上游引物序列为TDF1F∶5′-AAGAGCTCATGGGAAGACCTCCTTGTTG-3′，含有Sac I位点；下游引物序列为TDF1R∶5′-AACTCGAGATAATCGAAATCATTCAAGAGTTGA-3′，含有Xho I位点.以实验室现有的含TDF1基因的质粒［4］作为PCR模板.PCR反应体系为∶10×buffer 5×10-6L，dNTP Mjxture 5×10-6L（0.0025 mol/L），引物各1.5×10-6L（0.01 mol/L），模板1×10-6L，Prjmestar DNA聚合酶1×10-6L，去离子水补充体积至5×10-5L，反应条件为2步法∶94℃变性30 s，62℃退火及延伸1 mjn，35个循环；72℃10mjn.经琼脂糖凝胶电泳后，回收扩增产物，连接到pMD18-T载体（步骤参照TaKaRa公司说明书），转化至E.coli DH5α中，涂布于含氨苄青霉素（100 mg/L）的LB固体培养基上，37℃培养过夜.筛选出克隆后，挑取单菌落，提取质粒，用Sac I、Xho I限制性内切酶进行双酶切鉴定，将鉴定正确的克隆进行测序（上海桑尼公司）.1.2.2 原核表达载体TDF1-pET32a的构建上述重组质粒TDF1-T用Sac I，Xho I于37℃消化5 h，经琼脂糖凝胶电泳，回收的TDF1片段与同样用Sac I，Xho I酶切的pET-32a载体进行连接，转化入感受态E.coli DH5α中，涂布于含氨苄青霉素（100 mg/L）的LB固体培养基上.挑取单菌落培养后抽提质粒，进行PCR和双酶切鉴定，保存重组质粒.1.2.3 融合蛋白的诱导表达及可溶性分析鉴定正确的TDF1-pET32a质粒与空载体pET32a（阴性对照）分别转化表达菌株E.coli BL21（DE3）感受态，涂在含有氨苄青霉素的LB平板上，37℃培养过夜.挑取TDF1-pET32a和pET32a各一个单菌落分别于1 mL含氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜.各取5×10-5L菌液转至5 mL含氨苄青霉素的LB液体培养基中，置37℃振荡培养2～4 h，至0D600为0.5～1.0，各取1 mL菌液放入离心管中，高速离心1 mjn，收集细菌沉淀（未经IPTG诱导）.剩余的菌液加入IPTG，至终浓度为0.001 mol/L进行蛋白诱导，在1 h，2 h，3.5 h，5 h 分别收集1 mL菌液，并测定其0D值，高速离心1 mjn，收集细菌沉淀.每管细菌沉淀按0D值大小加入适量的1×SDS蛋白加样缓冲液，置于100℃煮沸3 mjn，离心后取上清于12%聚丙烯酰胺凝胶进行电泳［6］.融合蛋白可溶性分析∶1 mL诱导菌液离心后，加入5×10-5L PBS重悬菌体，然后用液氮反复冻融十次，离心后分别收集上清跟沉淀，沉淀再以5×10-5L PBS重悬，进行SDS-PAGE电泳，分析融合蛋白是以包涵体还是可溶蛋白形式存在.1.2.4 包涵体蛋白的可溶性处理及抗原制备包涵体蛋白的可溶性处理参照Kjrubakaran等［7］的方法，将包涵体用3倍体积的洗涤缓冲液（0.01 mol/L Trjs-HCl，pH 7.5，0.3 mol/L NaCl，0.001 mol/L EDTA，1%Trjton X-100和1 mol/L urea）清洗三次，每次4℃10000转离心10 mjn，然后包涵体沉淀溶解于10倍体积的溶解缓冲液（0.05 mol/L Trjs-HCl，pH 7.8；0.005 mol/L MgCl2；0.0025 mol/L 2-mercaptoethanol；0.1%（w/v）Tween 20；8 mol/L urea），在室温下孵育1 h.抗原制备∶纯化溶解后的包涵体上样进行SDS-PAGE电泳，PAGE胶用考马斯亮兰染色液染20 mjn后，再用脱色液脱色干净.用刀片切下56KD处的目的条带，放在干净的离心管中，加适量的PBS溶液，用磨棒碾碎备用.1.2.5 多克隆抗体制备及效价鉴定抗体制备∶取1 mL碾碎的包含抗原的PAGE胶与1 mL弗氏完全佐剂混匀后对成年健康家兔进行背部多点皮下注射，10 d后用相同的碾碎的样品与1 mL弗氏不完全佐剂混匀，注射家兔.相同的实验再重复两次（后两次不加弗氏不完全佐剂），每次间隔10 d.最后一次注射一周后，对被免疫的兔子进行心脏取血，血液放37℃温育1 h，然后放4℃过夜，析出的血清加叠氮钠，分装后-20℃保存.用酶联免疫吸附实验（ELISA）检测抗体效价，免疫后的兔抗血清用PBS逐一按2倍稀释分别加入已包被抗原的反应孔中，以PBS做为阴性对照，二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体（1∶5000），用底物TMB显色，2 mol/L H2S04终止反应.用酶标仪在A450测定吸光值.1.2.6 Western blot检测Western blot检测∶将样品蛋白进行SDS-PAGE电泳后，经电转仪转移到PVDF 膜上.将膜用含5%脱脂奶粉的TBST溶液封闭1.5 h，清洗后加入按1∶200稀释于TBST中的兔多克隆抗体，在摇床放置1 h，以TBST清洗一抗1 h，每15 mjn 换一次清洗液.再加稀释于TBST中的HRP标记的羊抗兔IgG（1∶10000），在摇床放置1 h，TBST清洗二抗1 h，每15mjn换一次清洗液.洗膜后加ECL工作液，在可见光下室温孵育膜数分钟，将印迹膜用保鲜膜包被粘贴固定于X光片曝光暗盒.然后转入暗室将X光胶片压在膜上曝光数秒，显影定影于X光胶片上.2.1 TDF1融合蛋白表达载体的构建以前期工作中构建的含有TDF1基因的质粒［4］为模板，利用上述引物，在高保真PrjmeStar聚合酶的作用下经PCR扩增得到大小为951 bp的TDF1基因（图1-A）.随后，将获得的TDF1基因克隆到pMD18-T载体，得到过渡载体TDF1-T.经限制性内切酶Sac I/Xho I消化后，电泳结果表明TDF1已成功克隆入pMD18-T（图1-B）.利用T载体上的M13通用引物进行测序分析，结果表明目的片段序列与Genbank数据库序列吻合.为了获得大量的TDF1蛋白，采用了原核表达的载体pET-32a（+）进行蛋白表达实验.用限制性内切酶Sac I和Xho I将过渡载体中TDF1片段切下后，将其克隆入pET-32a（+），转化E.coli DH5α感受态后的重组质粒用限制性酶切鉴定可以看到一条大约951 bp的条带（图1-C），测序结果表明目的基因TDF1位于正确的读码框中，获得了原核表达质粒TDF1-pET32a.将构建好的TDF1-pET32a及作为阴性对照的pET32a空载体转化入表达菌株E.coli BL21（DE3）感受态中，PCR鉴定显示TDF1-pET32a含有目的基因片段（图1-D）.2.2 TDF1融合蛋白的原核表达预期的TDF1蛋白分子量为35.8KD［4］，pET32a质粒所带标签蛋白（Trx-Tag，Hjs-Tag及S-Tag）分子量为20.4KD（图2 B2），所以表达的TDF1与标签蛋白融合后分子量约为56.2KD.按照材料与方法中所述步骤进行蛋白诱导表达实验，SDS-PAGE电泳结果显示，诱导1 h，2 h，3.5 h及5 h后，在56.2KD处可见TDF1重组蛋白的条带（图2 A2～A5）.此外，TDF1的蛋白表达量随诱导时间延长而逐渐增加（图2 A2～A5），表明TDF1重组蛋白能够在原核中稳定表达.2.3 融合蛋白可溶性分析SDS-PAGE电泳结果显示，诱导菌经液氮反复冻融后，上清液里几乎没有目的融合蛋白，而融合蛋白大部分都存在沉淀中，故诱导表达的TDF1重组蛋白主要是以不溶的包涵体形式表达（图3-3，3-4）.对包涵体进行洗涤纯化和溶解后，可以看到大部分的杂蛋白已被去除（图3-5），切胶富集融合蛋白包涵体后用于抗体制备.2.4 抗体的制备与检测溶解后的融合蛋白包涵体进行SDSPAGE电泳，切下的含有目的蛋白的PAGE胶碾碎后分4次注射家兔后，对家兔进行心脏取血，血液经37℃温育后，低温放置过夜析出多克隆抗血清.多抗经ELISA实验测定效价，因底物是TMB，故用酶标仪在A450测定吸光值.计算样本0D值与对照0D值的比值P，P大于等于2.1为阳性，小于2.1大于1.6为可疑，小于1.6为阴性.实验数据见表1，当抗血清稀释至2560倍的时候，P值为2.6，为阳性，稀释到5120倍的时候，P值为1.6，结果不可信，而稀释到更高倍数时，P值小于1.6了，表现为阴性.故实验结果表明抗血清效价为1∶2560.为了进一步分析获得的抗体对TDF1蛋白的识别，用Western blot技术检测抗体.杂交后经HRP标记的羊抗兔显色试剂盒显色，用X光胶片显影，在胶片上可在目的蛋白56.2KD处看到清晰的条带，这表明多克隆抗体与目的蛋白识别良好（图4）.本研究利用分子生物学技术克隆了TDF1基因，并逐步构建到原核表达载体pET32a中.诱导表达结果显示，构建的原核表达载体TDF1-pET32a经IPTG诱导后，TDF1融合蛋白以包涵体的形式得到了高效稳定的表达.产生的包涵体是高密度，不溶性的蛋白表达产物，它的形成使目的蛋白的分离纯化变得更为容易.先前的研究表明，包涵体经过洗涤后可以去除可溶的，粘附的细菌蛋白.多数情况下，调整洗涤的条件可使包涵体中外源蛋白的纯度达到90%以上，从中提取的蛋白可以直接用作抗原［6］.故而在本实验中将包涵体先用含1 mol/L尿素的缓冲液清洗多次，尽可能除去菌液中含有的可溶性的杂蛋白，清洗后的包涵体再用含8 mol/L浓度尿素的缓冲液在室温下溶解，这样处理后的包涵体内外源蛋白被溶解，离心后存在于上清里.经SDSPAGE电泳后可以看到大部分杂蛋白已经被去除，用刀片切下56KD左右的目的蛋白可以做为抗原免疫家兔.对获得的多克隆抗血清经Western blot技术检测，结果显示制备的抗体与目的蛋白识别良好.R2R3-MYB转录因子广泛参与植物次生代谢调控、激素和环境因子的应答，并对细胞分化、器官的形成、植物叶片的形态建成及抗病具有重要的调节作用［8］.然而对于MYB转录因子TDF1作用位点及下游基因的研究并不清楚.虽然可以采用CASTjng的策略寻找转录因子的DNA结合位点［9，10］，染色质免疫共沉淀（Chromatjn Immunoprecjpjtatjon，ChIp）的方法可以用来在体内鉴定转录因子直接调控的下游基因.但是这些方法都需要特异性很高的蛋白抗体［11］.本研究制备的抗体与目的融合蛋白TDF1特异性较强，可用于TDF1作用位点及其直接调控的下游基因功能的研究，有助于生化水平上深入研究TDF1在花药发育中的分子机理.【相关文献】［1］ R0MER0 I，FUERTESA，BENIT0 M J，et al.More than 80 R2R3-MYB regulatory genes jn the genome of Arabjdopsjs thaljana［J］.Plant 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蛋白融合表达
蛋白融合表达全文共四篇示例，供读者参考第一篇示例：蛋白融合表达（Protein Fusion Expression）是生物技术领域中一种常用的蛋白表达技术，通过将不同蛋白基因序列进行融合，使其能够在目标宿主细胞中表达出含有多个功能区域的融合蛋白。
蛋白融合表达技术是从基因水平上控制蛋白质的结构和功能，为蛋白质的生物学功能研究、药物研发和生物制药等领域提供了有效的手段。
一、蛋白融合表达的原理蛋白融合表达技术是利用基因工程技术将两个或多个蛋白基因的编码序列连接在一起，形成一个新的融合蛋白基因，然后通过转染或转化等手段将其导入目标宿主细胞中，使其表达出融合蛋白。
蛋白融合表达的基本原理是将两个或多个不同功能的蛋白通过融合技术合并在一起，达到协同作用或增强某一功能的效果。
蛋白融合表达可通过多种途径实现，常见的方法包括直接连接两个蛋白的编码序列、利用核酶切割和PCR等技术进行DNA重组，以及通过载体和质粒等载体介导融合蛋白的表达。
不同的蛋白融合表达技术具有各自的特点和适用范围，选择合适的融合表达策略可提高蛋白表达效率和提取纯度。
1. 生物学功能研究：蛋白融合表达技术可用于研究蛋白质的结构和功能，通过融合不同功能区域的蛋白进行功能分析和蛋白相互作用研究，揭示蛋白质的生物学特性和作用机制。
2. 药物研发：蛋白融合表达技术在药物研发中具有广泛的应用，可用于合成重组蛋白、多肽和抗体等生物制剂，提高药物的活性和稳定性，开发新型药物和治疗方法。
3. 生物制药：蛋白融合表达技术是生物制药领域中最常用的生产方法之一，可用于大规模生产融合蛋白、重组蛋白和生物药物，提高生产效率和产品质量，满足临床需求。
4. 技术创新：蛋白融合表达技术在生物技术领域具有重要的技术意义，可以用于开发新型蛋白表达系统、优化蛋白表达和纯化工艺、改良蛋白结构和功能等方面，推动生物技术的发展和进步。
1. 提高蛋白表达效率：蛋白融合表达技术可以利用多个功能区域相互作用增强蛋白的稳定性和可溶性，提高蛋白的表达水平和纯度。
gst蛋白纯化原理
gst蛋白纯化原理GST蛋白纯化是一种常用的蛋白质纯化技术，其原理是利用谷胱甘肽-S-转移酶（Glutathione-S-transferase，GST）标签与谷胱甘肽的特异性结合来进行纯化。
GST标签可与谷胱甘肽通过二硫键共价亲和，然后通过GSH交换洗脱的原理进行蛋白纯化。
具体步骤如下：1.构建GST标签融合表达载体：将GST基因的编码序列与目标蛋白的编码序列融合，构建GST-目标蛋白融合表达载体。
这样，在细胞中表达该融合蛋白时，GST标签会紧密结合在目标蛋白的C端或N 端。
2.转染和蛋白表达：将构建好的GST-目标蛋白融合表达载体转染到合适的宿主细胞（如大肠杆菌），使其产生大量的融合蛋白。
3.细胞裂解和融合蛋白的亲和层析：收获融合蛋白的细胞，通过细胞裂解等方法破坏细胞膜，释放融合蛋白。
然后，将溶解的细胞提取物加载到含有谷胱甘肽固定在琼脂糖（或其他载体）上的亲和层析柱中。
GST标签可以特异性地与琼脂糖上的谷胱甘肽结合。
4.洗脱：通过洗脱缓冲液来去除非特异性结合的蛋白质，保留GST-目标蛋白复合物。
洗脱通常使用还原剂（如谷胱甘肽）、低pH 或其他方式进行。
5.目标蛋白的解离：将GST标签从目标蛋白上解离，得到纯化的目标蛋白。
这可以通过特定的酶切位点（如蛋白酶TEV切割位点）和相应的酶进行酶切，使GST和目标蛋白分别释放。
6.纯化分析：对纯化的目标蛋白进行分析，如SDS-PAGE凝胶电泳、Western blot等方法，确认目标蛋白的纯度和完整性。
在进行GST蛋白纯化时，对于融合表达载体的设计和构建、宿主细胞的选择、裂解条件和亲和层析条件的优化等方面都需要合理考虑，以获得高质量的纯化目标蛋白。
补体C3与BPI活性区融合蛋白(CB)的构建与表达
活性 区， 获得 Ｃ ３ 一 Ｂ Ｐ Ｉ 活性 区融合 蛋 白 （ 即Ｃ Ｂ融 合蛋 白） ， 构建 ｃ Ｂ原核表达载体 ｐ Ｅ Ｔ ２ ８ － Ｃ Ｂ ， 在大 肠杆菌 中
＼ ／ ｒ Ｂ Ｐ Ｉ／ ／ Ｈ ｉ ｎ ｄ ｌ ｌ ｌ ＋ Ｘ ｂ ｏ ｌ Ｉ
ｉ 连 接 做 体 、 测 序
｛ ＼ Ｉ Ｃ ３ ￣ ｂ ／ ／
Ｉ 如 ｍ Ｈ Ｉ Ｉ Ｉ
Ｂ ａ ｍ Ｈ ｌ 连接Ｆ 妇 载体
叫
活性位点融合 基因 Ｇ ３ ａ ｂ （ Ｇ ３ ａ ｓ 和Ｇ ３ ｂ ｓ 含有长度 为 １ ８
公 司。
的几乎全部生物活性Ｌ ６ Ｊ 。将 ｃ ３活性位 点基因片段 与
Ｂ Ｐ Ｉ 蛋 白功能区基 因融合 ， 获得重组蛋 白 Ｃ Ｂ， 以期其具 有一定杀菌活性 的 同时 ， 还可 以作为桥 梁分子促 进外 源病原被血细胞、 巨噬细胞等黏附和吞噬。 本实验通过融合 Ｃ ３ 分子补体受体结 合位点与 Ｂ Ｐ Ｉ
进 行 表 达 和蛋 白的 提 取 ， 并初 步验证 Ｃ Ｂ蛋 白活 性 ， 为
其功能和应用奠定基础 。
１ 材 料 和 方 法
１ ． １ 材 料
１ ． １ ． １ 质粒和菌株
大肠杆菌菌 株 Ｄ Ｈ ５ ａ 、 Ｂ Ｌ ２ １ 菌，
分离到的一种阳离子蛋 白， 分子量约 ５ ５ ｋ Ｄ ａ 。大量实验 室及临床前研究表 明， Ｂ Ｐ Ｉ 具有强大的中和脂 多糖 和杀 灭Ｇ 钿 菌 的能力 ， 最近发现 Ｂ Ｐ Ｉ 还具有抑制血管生成 ， 抗真菌如抗荚膜组织包浆菌， 抗原虫 的作用 ［ ５ ｌ ， Ｂ Ｐ Ｉ 蛋
重组IL-33融合表达载体的构建、蛋白表达及纯化
Ｉ 一 ３ ｗ ｓ ｌ ａ ｅ ｔ ｈ ｕ ｉ ｎ ｅ ｐ ｅ ｓｏ ｅ ｔｒ ｐ Ｔ１ ２ Ｄ— ＯＰ ａ ｄ ｔ ｅ ｒ ｎ ｆ ｒ ｄ ｉ ｔ ｓ ｈ ｒｃ ｉ ｏ Ｌ ３ ａ ｉ ｔｄ ｗｉ ｔ ｅ ｆ ｓ ｘ ｒ ｓ ｉｎ ｖ ｃ ｏ Ｅ ０ ／ Ｔ Ｏ。 ｎ ｈ ｎ ｔ ｓ ｍｅ ｎ ｏ Ｅ ｃ ｅ ｉｈ ａ ｃ ｌ ｇ ｈ ｏ ａ ｏ ＢＬ ｏ ｘ ｒ ｓ ｉ ｎ Ｒｅ ｕｔ ： ｈ ｉｅ ｏ ｍｐ ｉ ｅ ＤＮＡ ｏ Ｌ ３ ｓ ａ ｏ ｔ８ ０ ｐ ｆｅ ｎ ｕ ｅ ｘ ｒ ｓ ｉｎ ２１ ｆ ｒｅ ｐ ｅ ｓｏ ． ｓ ｌ Ｔ ｅ ｓ ｆａ ｌ ｄ ｃ ｓ ｚ ｉ ｆ ｆＩ 一 ３ ｗａ ｂ ｕ ０ ｂ ．Ａ ｒ Ｉ ｄ ｃ ｄ ｅ ｐ ｅ ｓｏ ｔ
泸 州 医学 院 学 报
２ １ 年 ０１
第３ ４卷
第 ５期
４ ７１
Ｊｕｎ ｌ ｆＬ ｚ ｏ ｄｃ ｌＣ ｌ ｇ Ｖｏ．４ ｏ ｒａ ｕｈ ｕ Ｍｅ ｉａ ｏｌ ｅ ｏ ｅ １ Ｎｏ５ ２ １ ３ ． ０ １
警
重组 ｌ一 ３融合表达载体 的构建 、 白表 达及 纯化 ３ Ｌ 蛋
ｐ ｏｅ ｎ ｅ ｆｃ ｉ ｅｙ ｔ ｒ ｕ ｈ ｔ ｉ ｒ ｄ ｘ ｎ ｆ ｓｏ ｘ ｒ ｓｉ ｎ ｓ ｓｅ ｒ ｔｉ ｆ ｔ ｌ ｈ ｏ ｇ ｈ ｏ ｅ ｏ ｉ ｕ ｉｎ ｅ ｐ ｅ ｓｏ ｙ ｔｍ．Ｍｅ ｈ ｄ ：ＤＮＡ ｏ Ｌ ３ ａ ｍｐ ｉ ｅ ｉ ｈ ｅ ｖ ｔ ｏ ｓｃ ｆＩ 一 ３ ｗ ｓ ａ ｌ ｄ ｗ ｔ ｔ ｅ ｉ ｆ ｈ
待测蛋白与gfp蛋白的融合表达
待测蛋白与gfp蛋白的融合表达待测蛋白与GFP蛋白的融合表达是一项常用的实验技术，可以用来研究蛋白的亚细胞定位、功能性研究以及蛋白的相互作用等。
在本文中，我将以一步一步的方式解释待测蛋白与GFP蛋白的融合表达的过程和原理。
第一步：选择适合的表达载体在进行待测蛋白与GFP蛋白的融合表达之前，首先需要选择合适的表达载体。
常见的表达载体包括质粒和病毒载体。
质粒通常用于体内表达，病毒载体则可以用于体内或体外表达。
选择表达载体时，需要考虑载体的大小、复制起源、选择标记等因素。
在此过程中，一个常用的表达载体是pEGFP-C1，它兼具了高效的GFP蛋白表达和稳定性。
第二步：将待测蛋白与GFP基因连接在将待测蛋白与GFP蛋白融合表达之前，需要将待测蛋白基因与GFP基因连接。
连接的方法有多种，常见的方法包括PCR扩增和限制性内切酶消化连接。
PCR扩增可以利用引物特异性扩增待测蛋白基因和GFP基因的DNA片段，然后通过连接酶将两个PCR产物连接在一起。
限制性内切酶消化连接则需要选择适合的限制性内切酶将待测蛋白基因和GFP基因进行消化，然后通过DNA连接酶将两个消化片段连接在一起。
第三步：转染细胞或注射在融合表达载体构建完成后，下一步是将表达载体导入到细胞中。
有两种常见的方法可以实现这一步骤：细胞转染和动物体内注射。
细胞转染可以通过化学法、电穿孔法或基因枪等技术将表达载体导入到细胞中。
动物体内注射则可以将表达载体注射到实验动物体内，使表达载体进入目标组织或器官。
第四步：蛋白表达检测一旦表达载体成功转染或注射到细胞或动物体内，下一步是检测蛋白的表达情况。
常见的方法包括免疫荧光染色、免疫组织化学、Western blot 等。
免疫荧光染色可以使用抗GFP抗体或待测蛋白特异性抗体与GFP融合蛋白结合，并通过荧光显微镜观察融合蛋白的亚细胞定位。
免疫组织化学可以利用特异性抗体与融合蛋白结合，并使用组织化学染色技术观察蛋白的分布情况。
pTAT-XIAP融合蛋白表达载体的构建
粒， 建 ｐＡ 构 Ｔ Ｔ—ＸＡ Ｉ Ｐ融合 蛋 白表 达 载 体 ， ｐ Ａ 将 Ｔ Ｔ—Ｘ Ａ Ｉ Ｐ质 粒 转 化 至 Ｄ ５ｔ培 养 筛 选 成 功 转 化 子 ， 取 纯 化 质 粒 ， 泳 鉴 定 。 Ｈ ｃ， 提 电 结果 ｐＡ Ｔ Ｔ—Ｘ Ａ Ｉ Ｐ质 粒 在 含 氨 苄 青 霉 素 的 Ｌ Ｂ固 体 培 养 基 上 呈 分 散 菌 落 生 长 ， 无 氨 苄 青 霉 素 的 Ｌ 在 Ｂ固 体 培 养 基 上 成 片 生 长 ，
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MAGE融合疫苗的构建与表达
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Ｍｏ ｅｎ Ｏ ｃ ｌ ｙ２ １ ．８ ０ ） １ ０ １ ０ ｄ ｒ ｎ ｏ ｇ ０ ０ １ （ ９ ：７ ５— ７ ７ ｏ
【 摘要】 目的 ： 构建 Ｍ Ｇ １ Ｍ Ｇ ３融合表达载体 ， ＡＥ和 ＡＥ 并获得抗 血清 。方 法 ： 采用分 步交叉亚 克隆方法将 两 个不 同片段连接 于表达载体 ， 组对 照优化表 达条件 ， Ｓ Ｓ—Ｐ Ｇ 分 用 Ｄ Ａ Ｅ和 Ｗｅｔ ｎ—ｂｏ 检测表达 与纯化结果 ， ｓ ｒ ｌｔ ｅ
【 ｂｔ ｃ】 Ｏ ｊ ｔ ｅＴ ｏｓｕｔ ｏ ｂ ａｔ Ａ Ｅ ｎ Ａ Ｅ ｘｒ ｓｎｖｃ ｒ ｎ ｃｕ ｅ ｅｔ ｆａｂ Ａ ｓ ａｔ ｒ ｂｅ ｉ ：ｏｃｎ ｒ ｍ ｉ ｎ Ｍ Ｇ １ ｄＭ Ｇ ３ｅｐ ｓｏ ｅｔ ｄａｑｉｍ ｎ ｏ ｒ ｉ ｃｖ ｔｃｃ ｎ ａ ｅｉ ｏａ ｒ ｂ ｔ
将纯化蛋 白免疫动物后用琼脂双扩 和 Ｅ ＩＡ方法检测抗血清效价 。结果 ： ＬＳ 成功构建 了 ＭＡ Ｅ 一ＭＡ Ｅ Ｇ １ Ｇ ３表达 载体并获得纯化蛋 白； 免疫 动物后获得高效价 的抗血清 。结论 ： 得到纯度高 ， 变性度低 的融合蛋 白。
【 关键 词 】 黑色素瘤 抗原 ； 原核表达 ； 瘤 肿
Ｃ Ｎ Ｌａ ＨＥ ｉｎ—ｈ ｎ ． ｎ ｏ ｇ ＭＡ Ｎｉｇ—ｑａ ｇ Ｗ ＡＮＧ Ｊ ｎ—ｗ ｉＺ ｉｎ ， ｕ ｅ ， ＨＡＮＧ Ｚ ｉ ｅ ｈ —ｐ ｉ Ｔ ｎｄ ｏ ｉ ｌｆＦ ｕｔ ｌａｙＭｅｉ ｌ ｎｖｒｔ， 鲫 ７ ０ ３ ，ｈｎ ． ａ ｇ ｕＨ ｓ ｔ ｏｒ Ｍｉｔｒ ｄ ａ ｉ ｓｙ ｐａ ｏ ｈ ｉ ｃ Ｕ ｅｉ １０ ８ Ｃ ｉ ａ
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融合蛋白表达载体的构建
一、概述
融合蛋白是把一个蛋白与其他物质混合在一起形成新的融合蛋白。
它们可以用于改善药物的药理学性质，广泛用于药物研究，疾病诊断，以及在医学和生物技术领域的应用。
为了有效地进行融合蛋白表达，科学家们需要设计一种质粒，它既能携带融合蛋白的基因信息，又能使表达的融合蛋白具有理想的性质，因此，构建融合蛋白表达载体就成为了研究者们的重要内容。
二、融合蛋白表达载体的构建
1.质粒设计
质粒设计是融合蛋白表达载体的核心部分，它能够携带融合蛋白的基因信息，并控制融合蛋白的表达。
一般而言，融合蛋白表达质粒包括表达调控基因、融合基因、保守克隆基因等几部分，其中表达调控基因以及保守克隆基因部分主要用于控制融合蛋白的表达，而融合基因部分则用于携带融合蛋白的基因信息，使其能够表达出想要获得的性质。
2.质粒的合成
质粒设计完成之后，下一步就是将其合成成一种可用于融合蛋白表达的质粒。
一般而言，此步骤可以通过化学合成或者基因重组技术完成。
化学合成方法可以可靠地合成出想要获得的质粒，而基因重组技术则可以以更快的速度构建出相似的质粒。
3.表达测试
表达测试是质粒构建过程中不可或缺的一部分，它能够检测融合蛋白是否能够正确表达，从而确定质粒是否构建成功并具有较好的表达能力。
表达测试通常包括定量PCR法、流式细胞仪法以及免疫印迹法等几种常见技术，这些技术都可以帮助科学家们及时发现融合蛋白表达存在的问题，从而指导科学家改进构建融合蛋白表达载体的工作。
三、结论
融合蛋白表达载体的构建是科学家们针对融合蛋白表达问题所
付出的努力，它包括质粒设计、质粒合成以及表达测试等几个步骤，有助于融合蛋白表达的安全、稳定和高效，并且可以提供药物及其他生物技术应用的理想基础。