EBF3与EGFP融合蛋白表达载体的构建及其在HepG2中的表达
人颗粒溶素与EGFP基因融合表达载体的构建及其在鼠巨噬细胞RAW264.7中的表达
人颗粒溶素与EGFP基因融合表达载体的构建及其在鼠巨噬细胞RAW264.7中的表达作者：伊正君，朱道银，李俊明，何永林，杨健，李娜【关键词】巨噬细胞Construction of a fusion gene expression vector containing human granulysin and green fluorescent protein gene and its expression in murine macrophage RAW264.7【Abstract】 AIM: To clone the human granulysin from activated cytotoxic Tlymphocytes (CTL), construct an eukaryotic expression vector containing the fusion gene of granulysin (GLS) and green fluorescent protein reporter and observe its expression in murine macrophage RAW264.7 strain. METHODS: The coding sequence of the granulysin was amplified from the total RNA of human CTL activated by allogenic antigen after reverse transcription by NestedPCR, inserted into pEGFPC1 plasmid and then transfected RAW264.7 cells. The expression of the fusion protein and GLS was detected by fluorescence microscope and RTPCR. The immunoreactive of the product was confirmed by immunocytochemistry method. RESULTS: The whole coding sequenceof GLS was successfully amplified as expected. The accurate open reading frame (ORF) of the fusion protein recon was confirmed by PCR, endonuclease digestion and sequencing. The fusion protein that was immunoreactive was successfully expressed in the targeted cells. CONCLUSION: Human granulysin can be expressed in murine macrophage RAW264.7 strain in a fusion protein pattern and retain its immunoreactivity.【Keywords】 granulysin； green fluorescent protein；macrophage； nestedPCR；immunoreactivity【摘要】目的: 克隆人天然颗粒溶素(granulysin，GLS)的编码序列并构建与绿色荧光蛋白(EGFP)基因融合的真核表达载体，观察人GLS在鼠巨噬细胞株RAW264.7中的表达. 方法: 提取培养并经同种异型抗原激活的人细胞毒性T淋巴细胞(CTL)细胞总RNA，经逆转录后以套式PCR方法扩增出GLS的编码序列，插入pEGFPC1质粒，鉴定正确后转染RAW264.7细胞，采用荧光显微镜及RTPCR法检测融合蛋白及GLS的表达，采用免疫细胞化学法确证表达产物的免疫反应性. 结果: 成功扩增出了人GLS完整编码序列的cDNA，经PCR及酶切、测序鉴定证明得到了读码框正确的融合蛋白重组子并在靶细胞中得到了成功表达，表达产物具有良好的免疫反应性.结论:人天然GLS能够在鼠巨噬细胞株RAW264.7中以融合蛋白的形式表达，其表达产物具有良好的免疫反应性.【关键词】颗粒溶素；绿色荧光蛋白；巨噬细胞；套式PCR；免疫反应性0引言颗粒溶素（granulysin，GLS）对细菌、真菌、原虫、肿瘤细胞等具有很强的广谱杀伤活性，因此对其免疫杀伤作用机制的研究对于开发天然、低毒、高效的新一代杀菌制剂以及研究人体的天然免疫过程具有重要意义. 为此我们直接从激活后的人外周血单个核细胞（PBMC）总RNA中扩增出GLS的cDNA编码序列并构建了与绿色荧光蛋白报告基因融合的真核表达载体，转染到鼠巨噬细胞株RAW264.7中进行了表达.1材料和方法1.1材料E.coli Top10, Clontech公司质粒载体pEGFPC1为本室保存;小鼠巨噬细胞株RAW264.7购自第三军医大学药理学教研室. 人外周血单个核细胞(PBMC)分离液及植物血凝素（PHA）购自第三军医大学试剂服务中心；质粒小量抽提试剂盒、PCR产物及凝胶回收试剂盒均购自上海华舜公司；限制性核酸内切酶BsPE I，BamH I购自NEB公司；小量组织/细胞总RNA抽提试剂盒、正常熔点琼脂糖（NMA）,高保真ProbestTaq酶、T4 DNA连接酶、逆转录试剂盒（Ver.3.0）、DNAMarker DL2000等均购自大连宝生物公司； GenePorter 2真核转染试剂为美国GTS公司产品；山羊抗人GLS抗体购自基因公司；即用型免疫细胞化学试剂盒购自武汉博士德；RPMI 1640培养液购自Gibco公司；小牛血清为杭州四季青公司产品.1.2方法根据GeneBank中人GLS的cDNA序列，共设计合成了4条引物：PG1: 5′GCGCTAGCGTATCTGTGGTAAACCCAGTG3′; PG2: 5′GCGGTACCCTTGCTTGACACTTTATTCTCG3′; PGE1: 5′GCTCCGGAAAGCTTCATATGAACCCAGGTCTGGTCTTCTC3′; PGE2: 5′TAGGATCCGTCGACGAGCTCTCAGAGGGGACCTGTAGAAG3′; 全部由大连宝生物公司合成. 由于表达产物定位于巨噬细胞胞质内表达，因此在PGE1引物设计中去除了GLS的分泌肽编码序列. 首先用PHA活化外周血单个核细胞，然后用同种异型抗原诱导、刺激其中的CTL细胞和NK细胞活化，从而启动GLS基因的转录. 方法是，无菌采集2份健康人静脉血各6 mL，肝素抗凝. 1500 r/min离心10 min，分别吸出上层血浆及白细胞层，然后用PBS缓冲液1∶1稀释白细胞，再按PBMC分离液说明，常规分离外周血单个核细胞. 取其中一份PBMC样本洗涤2次后以含100 mL/L自体血浆的完全RPMI 1640培养液重悬，调节细胞浓度为2×106/L，加入PHA使其终浓度为200 mg/L，置37℃，50 mL/L CO2培养箱中，培养24 h后加入另一份样本（此样本PBMC经灭活处理后以含100 mL/L灭活小牛血清的完全RPMI 1640培养液重悬）共同培养48 h后收获细胞.1.2.1GLS cDNA的扩增、克隆与测序抽提细胞总RNA，逆转录后调适相应的缓冲液，用高保真ProbestTaq酶取代试剂盒自带的HSTaq, 用引物PG1，PG2进行PCR扩增25个循环，获得包含目标序列在内的GLScDNA全长片段. 然后取产物2 μL为模板，以引物PGE1与PGE2进行套式扩增，反应条件为：94℃ 4 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，30个循环； 72℃延伸8 min. 10 g/L琼脂糖凝胶电泳进行检测. 纯化后以BsPE I，BamH I双酶切、回收，与同样处理的pEGFPC1载体大片段在16℃连接1 h，转化大肠杆菌TOP10，涂布于含30 mg/L卡那霉素LB平板上培养，次日挑取卡那霉素抗性单菌落，进行PCR鉴定，阳性克隆置3 mL含30 mg/L卡那霉素LB培养基中振摇增菌，小量抽提质粒，用BsPE I与BamH I进行双酶切鉴定，送上海博亚公司测序.1.2.2细胞转染及表达产物的检测RAW264.7细胞在含100 mL/L小牛血清的RPMI 1640培养基中，以24孔板置37℃，50 mL/L CO2培养，常规方法制作RAW264.7细胞爬片，至80%~90%汇片后按转染试剂盒说明进行转染，以pEGFPC1空质粒转染的RAW264.7细胞作为对照.转染72 h后分别收集实验孔及对照孔的细胞:①取出爬片进行荧光检测，观察融合蛋白的表达及分布；②以RTPCR法对GLS基因进行转录水平上的检测：抽提细胞总RNA逆转录，以PGE1, PGE2为引物，按上述条件进行扩增；③GLS表达产物的免疫学活性检测：取出爬片进行免疫细胞化学检测，具体方法是：PBS洗，40 g/L多聚甲醛固定，PBS洗，30 mL/L H2O2灭活内源性过氧化物酶10 min； PBS洗，滴加血清封闭液，室温20 min；滴加1∶300稀释的山羊抗人GLS抗体，4℃过夜；PBS洗，滴加生物素化的兔抗山羊抗体，室温20 min；PBS洗，滴加链酶亲和素生物素酶复合物（SABC）液，室温20 min；PBS洗，DAB避光显色20 min；苏木素复染，盐酸乙醇分化，脱水，透明，封片，观察. 2结果2.1GLS cDNA的套式PCR扩增两次PCR产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳后，分别在433，754 bp处见到一特异性目的片段，与理论预测的GLS全长cDNA序列大小相符(Fig 1).2.2重组质粒的PCR及酶切鉴定插入正确片段的重组菌落经PCR扩增后，电泳可见到与目的片段大小一致的PCR产物条带. 分别抽提质粒双酶切后琼脂糖凝胶电泳表明,酶切后产生一线性空载体条带及一条与理论预测值一致的目的片段(Fig 2).2.3GLS转录产物的RTPCR检测转染72 h后抽提细胞总RNA 以原引物作RTPCR重新扩增出目的片段为433 bp，与理论预测值完全相符(Fig 3).2.4GLS与EGFP融合蛋白的荧光检测转染72 h后融合蛋白表达产物主要定位于细胞质(Fig 4).2.5GLS表达产物的免疫细胞化学以山羊抗人GLS抗体为一抗，生物素化的兔抗山羊抗体为二抗，DAB显色可见GLS呈强阳性表达(Fig 5).3讨论一般认为清除结核杆菌等胞内寄生菌的感染主要依赖人体的细胞免疫反应，可以运用结核杆菌的单一［1］或融合形式［2］的保护性抗原构建基因疫苗激发人体的Th1型细胞免疫反应来防治结核病. 在这一过程中，细胞毒性淋巴细胞起着关键作用. 激活的CTL细胞和NK细胞产生的GLS是一种细胞毒性免疫效应分子. Ogawa等［3］认为血清GLS的水平是评价机体细胞免疫功能状态的新指标. Kida等［4］利用拉氏无胆支原体（Acholeplasma laidlawii）刺激人单核细胞来源的THP1细胞株，在其中检测到了GLS mRNA的表达，并认为特定刺激在巨噬细胞中诱导产生GLS可能是机体一种有效的抗微生物入侵的保护机制. 利用真核表达载体（如pcDNA3.1）已经在多种真核细胞株如YT，HuT78，COS7（非洲绿猴肾细胞）中表达出了具有生物学活性的GLS［5］. 绿色荧光蛋白是目前公认较为优良的一种标记基因，与目的基因融合后不会影响表达产物的生物学活性，新近Hanson等［6］采用绿色荧光蛋白作为报告基因与GLS作C端融合，也在YT细胞中得到了成功表达，但GLS在鼠巨噬细胞中的表达迄今为止未见报道. 我们利用套式RTPCR的方法从激活的人外周血PBMC中直接扩增出了GLS 的cDNA编码序列并构建了与绿色荧光蛋白的融合表达载体，在体外从细胞水平检测到了其转录与表达，这说明人GLS是能够定位在小鼠巨噬细胞胞质中进行表达的，从而为后续在活体动物模型中的应用及研究其免疫杀伤机制奠定了基础.【参考文献】［1］骆旭东, 朱道银, 陈全, 等. 结核分枝杆菌Ag85B和MPT64基因疫苗免疫原性的比较［J］.第四军医大学学报,2003; 24（17）:1630-1631.Luo XD, Zhu DY,Chen Q, et parison of immunogenicity of DNA vaccine encoding Mycobacterium tuberculosis Ag85B and MPT64［J］. J Fourth Mil Med Univ, 2003; 24（17）:1630-1631.［2］江山, 朱道银,蒋英,等.结核分枝杆菌Ag85BAg85A双抗原融合真核表达质粒的构建及表达［J］. 第四军医大学学报,2003;24（21）:1973-1975.Jiang S, Zhu DY, Jiang Y, et al.Construction of fused eukaryotic expression vector of Mycobacterium tuberculosis Ag85B and Ag85A antigens and its expression［J］. J Fourth Mil Med Univ, 2003;24（21）:1973-1975.［3］ Ogawa K, Takamori Y, Suzuki K, et al. Granulysin in human serum as a marker of cellmediated immunity［J］. Eur J Immunol, 2003; 33(7):1925-1933.［4］ Kida Y, Shimizu T, Kuwano K. Opposing roles of activator protein1 and CCAAT/enhancer binding protein beta in the regulation of inducible granulysin gene expression in a human monocytic cell line,THP1［J］. Immunology, 2002；107(4):507-516.［5］Hanson DA, Kaspar AA, Poulain FR, et al. Biosynthesis of granulysin, a novel cytolytic molecule［J］. MolImmunol， 1999； 36(7):413-422.［6］ Hanson DA, Ziegler SF. Fusion of green fluorescent protein to the Cterminus of granulysin alters its intracellular localization in comparison to the native molecule［J］. J Negat Results Biomed, 2004;3(1):2.（注：可编辑下载，若有不当之处，请指正，谢谢!）。
蛋白质egfp融合蛋白
蛋白质egfp融合蛋白蛋白质EGFP融合蛋白（EGFP-fusion protein）是由一种绿色荧光蛋白（Enhanced Green Fluorescent Protein，EGFP）与其他蛋白质序列融合而成的蛋白质复合体。
EGFP是一种由Aequorea victoria水母产生的蛋白质，具有独特的荧光特性，能够在外源激发光源的作用下自发发出绿色荧光。
EGFP-fusion protein在生命科学研究中被广泛应用，可以通过显微镜观察该融合蛋白的在细胞和组织中的分布和定位，从而研究该蛋白质的生物学功能和调控机制。
本文将介绍EGFP-fusion protein的构建步骤、应用领域以及存在的挑战和未来发展方向。
首先，构建EGFP-fusion protein需要克隆目标蛋白质的编码区域，通常使用基因克隆技术将EGFP序列与目标蛋白质的编码序列进行连接。
常用的方法是PCR扩增目标蛋白质的编码序列，并在其N或C端引入适当的限制酶切位点，然后将PCR产物与EGFP载体进行双酶切和连接。
连接产物可经过测序验证，进一步进行细胞转染或转基因模型构建等应用。
在应用方面，EGFP-fusion protein可以用于研究蛋白质在细胞内的定位和分布，例如可以用EGFP-actin融合蛋白来研究细胞骨架的重组和功能。
此外，EGFP-fusion protein还可以用于蛋白质相互作用的研究，通过融合EGFP和其他蛋白质的序列，可以观察到这些蛋白质在细胞内的共定位情况，从而推测它们之间可能发生的相互作用。
然而，构建并应用EGFP-fusion protein也面临一些挑战。
首先，蛋白质的融合可能对其原有的结构和功能产生影响，因此需要对融合蛋白进行验证，确保其具备正常的生物学活性。
其次，EGFP的荧光特性可能会受到融合蛋白的结构和环境的影响，从而导致荧光信号强度和彩色性能的改变。
最后，EGFP的表达可能会受到细胞毒性和光毒性的影响，因此需要合理选择表达系统和实验条件，以确保实验的准确性和稳定性。
融合蛋白表达载体MK-EGFP的构建及其在不同肿瘤细胞中的定位
融合蛋白表达载体MK-EGFP的构建及其在不同肿瘤细胞中
的定位
单筠;俞研迎;龚建光;毛克秋
【期刊名称】《浙江预防医学》
【年(卷),期】2009(021)007
【摘要】@@ MK(Midkine)是一种肝素结合性生长因子,最初发现与细胞生长、迁移和存活有关,随后的研究发现它在多种人源恶性肿瘤中高表达[1-2].
【总页数】2页(P93-94)
【作者】单筠;俞研迎;龚建光;毛克秋
【作者单位】浙江大学医学院附属第一医院,浙江,杭州,310003;浙江大学医学院附属第一医院,浙江,杭州,310003;浙江大学医学院附属第一医院,浙江,杭州,310003;浙江省血液中心
【正文语种】中文
【中图分类】R392.11;R73-3
【相关文献】
1.MK-EGFP融合蛋白在人肝癌细胞Hep-G2中的核定位 [J], 赵宁
2.重组EGFP-aquaporin-4融合蛋白真核表达载体的构建及其在FRT细胞中的表达和定位 [J], 李凤娥;郝峰;藏雨轩;马睿泽;孔繁利;刘磊;李艳
3.白蛋白融合蛋白表达载体的构建及其在细胞中的表达和定位 [J], 刘承武;陈登宇;胡水旺;刘靖华;姜勇
4.鹦鹉热嗜衣原体CPSIT_0018融合蛋白原核表达载体的构建、表达及其在Hela 细胞中的定位 [J], 贺庆芝;曾怀才;陆春雪;胡艳群;陈芝喜;王川;吴移谋
5.鹦鹉热嗜衣原体CPSIT_0018融合蛋白原核表达载体的构建、表达及其在Hela 细胞中的定位 [J], 贺庆芝;曾怀才;陆春雪;胡艳群;陈芝喜;王川;吴移谋;
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人NIRF基因真核表达质粒的构建及其在HepG2_2_15细胞中的表达
NIRF （Np95ICBP90-like RING Finger ）基因是日本福岛医科大学Kochi 教授于2002年发现的，该基因位于9P24.1，编码由802个氨基酸残基组成的蛋白质［1~3］。
NIRF 基因有一个PHD （Plant homeo do －main ）结构域，一个YDG ／SRA 结构域，Rb 结合位点以及一个RINGfinger 区。
已有研究表明，含RING finger 结构域的蛋白往往具有泛素化功能，在细胞内充当E3的角色［1~3］。
根据这一理论，我们推测NIRF 应该具有E3功能。
已有研究证明，NIRF 不仅能与P53结合，而且能对P53进行泛素化降解［4］。
据报道，在人类48%以上的肿瘤组织中，存在NIRF 基因突变［5］。
本研究构建了人NIRF 基因真核表达质粒，并在HepG2.2.15细胞中表达了NIRF 蛋白，为进一步研究其在肿瘤组织中的功能奠定了基础。
1.材料与方法1.1细胞、质粒及菌株HeLa 细胞和pIRES2-EGFP 载体均为本室保存；HepG2.2.15细胞由重庆医科大学传染病实验室陈颖老师惠赠；感受态E.coli DH5α购自北京天为时代科技有限公司。
1.2主要试剂DMEM 培养基和胎牛血清（FCS ）均为HyClone 公司产品；OligodT 购自TaKaRa 公司；T4Ligase 、琼脂糖、核酸内切酶Sac I 、Sma I 、pfu 聚合酶、dNTP 、10×Buffer 、质粒提取试剂盒和琼脂糖凝胶DNA 回收试剂盒均购自Promega 公司；DNA marker BM15000购自北京博迈德公司；Trizol 试剂盒、Superscript Ⅱ反转录酶和Lipofectamine TM 2000均购自Invitrogen 公司；转染稀释液（Opti -MEM Ⅰ）为GIBCO 公司产品；兔抗人NIRF 多克隆抗体购自Abcam 公司；其他试剂均为国产或进口分析纯。
EST3-EGFP融合蛋白重组体的构建和表达
ｔ ｅ Ｉ ｒ （ ｉ ｄ ｃ ｄ Ｒｏ ｅ ｔ （ ３） Ｌａ １ｗａ ｂ ｅ ｖ ｄ ｔ ｍ ｉ ｇ ｅ ｎ ｆ ｏ ｅ ｃ ｎ ｅ Ｃｏ ｄｕ ｉ ｎ ＥＳ 一 ＧＦ ｕ ｉｎ ｐ ｏ ｅ ｎ ｅ — ｈ Ｆ ｒ 、 ｎ ｕ ｅ ｓ ｔａ Ｄｅ ｐ ｃ ｓ ｏ ｓ ｒ ｅ ｏ ｅ ｔ ｒ ｅ ｌ ｒ ｓ ｅ ｃ ． ｒ ｕ ｎ ｓｏ Ｔ３ Ｂ Ｐ ｆ ｓｏ ｒ ｔｉ ｘ ｐ ｅ ｓｎ ｈ ｔｌ ｖ ｃ ｏ ｓ ｓ ｃ ｅ ｓ ｕ ｌ ｏ ｓ ｒ ｃ ｅ ｎ ｎ ｕ ｔ ｎ ｗａ ｉ ｈ ｙ ｅ ｆ ｉ ｎ ｎ Ｒｏ ｅ ｔ （ ３） Ｌａ Ｉ Ｂ ｏ ｃｉ ｉ ｆ ｒ ｓ ｉ ｇ ｓ ｕ ｔ ｅ ｔ ｒｗａ ｕ ｃ ｓ ｆ ｌ ｃ ｎ ｔ ｕ ｔｄ ａ ｄ ｉ ｄ ｃｉ ｓ ｈ ｇ ｌ ｆｉ ｅ ｔ ｉ ｓ ｔ ｅ ｙ ｏ ｃ ａ Ｄｅ ｐ ｃ ． ｉ ａ ｔ ｔ ｏ ｖｙ ＥＳ ｎ ＧＦ ｎ ｔ ｉ ｆ ｓｏ ｒ ｔｉ ｓｉ ｔ ｃ ． Ｔ３ ａ ｄ Ｅ Ｐ ｉ ｈ ｓ ｕ ｉ ｎ ｐ ｏ ｅ ｎ ｉ ｎ ａ ｔ
LMP3-EGFP融合蛋白真核表达载体的构建及其在HEK293细胞中的表达
摘
要
为构建人 Ｌ Ｐ ．Ｇ Ｐ融合蛋 白 Ｍ３ Ｆ Ｅ 真核表达 载体 ， 测其 在 Ｈ Ｋ９ 细胞 中的表 达及 定位， 并检 Ｅ ２３ 通过基 因重组 的方法构建
究发现的具有成骨诱导活性 的细胞 内蛋 白， ３ 有 种 不同的差 异 剪 切 体， 分别 命 名 为 Ｌ Ｐ 、 Ｍ ２和 Ｍ １Ｌ Ｐ Ｌ Ｐ 。Ｌ Ｐ Ｍ３ Ｍ ３由 １４个氨基 酸残基构成 ， ５ 氨基末
端含有一个 Ｐ Ｚ作用域。研究表明 Ｌ Ｐ Ｄ Ｍ ３在体外培
养时可促进 Ｂ Ｐ２ Ｏ Ｘ ｕ Ｘ Ｍ －、 Ｓ 、Ｒ ｎ２及碱性磷 酸酶等 骨组织特异性基因的表达， 并可在体 内诱导异位成
中 Ｃ
维普资讯
６ 期 １ ２ 方 法 ．
张大伟， ：Ｍ ３Ｅ Ｆ 等 Ｌ Ｐ 一Ｇ Ｐ融合蛋白真核表达载体的构建及其在 Ｈ Ｋ ９ Ｅ ２３细胞 中的表达
９３ ７
件 下 培养 ６ｈ， 含 １％ 胎 牛血清 的 Ｄ Ｍ 培 养液 ， 换 ０ ＭＥ
２ ０ Ｓ ｉ ｅｈ Ｅ ｇｇ ０ ７ ｃ．Ｔ ｃ ． ｎｎ ．
生物科学
Ｌ ３Ｅ Ｆ ＭＰ － Ｇ Ｐ融合蛋 白真核表达载体 的构 建及其在 ＨＥ ２ ３细 胞中的表达 Ｋ９
张大伟 胡蕴玉 李 立文 白文 涛 杨香 菊。 李文献 白建 萍
（ 四军医大学西 京医院全军骨科研究所 ， 第 西安 ７ ０ ３ ； 大学生命科学 院生物科学 系 ， １０ ２ 西北 西安 ７ ０ ６ ； １０９
１ ２ １ Ｌ ＇ 因获取 ． ． Ｍ１ ３基
继续培养 ４ ， ８ｈ 吸去培养液 ， Ｐ Ｓ冲洗细胞后倒 用 Ｂ
早期B细胞因子3对HepG2细胞周期的影响
早期B细胞因子3对HepG2细胞周期的影响王跃国;王惠民;鞠少卿;汪晓莺;毛丽萍【期刊名称】《中国免疫学杂志》【年(卷),期】2009(025)006【摘要】目的:克隆人早期B细胞因子3 (EBF3)基因,构建真核表达载体pEGFP/EBF3,研究人EBF3对肝癌细胞株HepG2细胞周期的影响.方法:提取人胎盘组织总RNA,采用RT-PCR技术克隆人EBF3基因,并将其克隆到真核表达载体pEGFP-N1,重组质粒双酶切鉴定,并进行序列测定.将重组质粒转染HepG2细胞,Western blot确证EBF3-EGFP融合蛋白的表达及亚细胞定位,流式细胞术分析转染细胞周期.结果:成功获得全长人EBF3基因,经双酶切和序列测定鉴定,真核表达质粒pEGFP/EBF3构建正确,将pEGFP /EBF3导入HepG2细胞24小时后,在倒置荧光显微镜下可观察到EBF3-EGFP融合蛋白主要表达于核内.Western blot证实转染pEGFP/EBF3后24小时和48小时细胞质和细胞核中均检出相对分子质量(Mr)为87 000的EBF3-EGFP融合蛋白.转染pEGFP/EBF3后48小时和72小时,S期细胞比例均明显高于pEGFP-N1转染细胞组,表明EBF3基因的导入可诱导细胞从G1期向G2期发展,从而促进细胞增殖.结论:成功构建了真核表达质粒pEGFP/EBF3,pEGFP /EBF3转染组S期细胞比例高于pEGFP-N1转染组,提示EBF3对人肝癌细胞株HepG2细胞有促进增殖作用.【总页数】5页(P491-495)【作者】王跃国;王惠民;鞠少卿;汪晓莺;毛丽萍【作者单位】南通大学附属医院检验医学中心,南通,226001;南通大学附属医院检验医学中心,南通,226001;南通大学附属医院检验医学中心,南通,226001;南通大学医学院免疫教研室,南通,226001;南通大学附属南通第三医院,南通,226006【正文语种】中文【中图分类】R730.23【相关文献】1.CIAPIN1对HepG2细胞增殖和细胞周期的影响 [J], 欧志涛;詹远京;郭家伟;罗铎2.罗格列酮对肝癌HepG2细胞周期和凋亡的影响 [J], 康燕;魏玲;王永霞;王立云3.miR-21对HepG2细胞增殖、凋亡和细胞周期的影响 [J], 张小三;张一鸣;杨树军;戚春辉;刘凯;赵燕4.芹菜素联合阿霉素对肝癌HepG2细胞增殖、凋亡及细胞周期的影响 [J], 邸金霖;单万亭;赵娇;鞠爱霞;李秋红5.细胞因子组合对受照射脐带血AC133^+细胞周期和早期凋亡的影响 [J], 刘玉龙;戴宏;姜忠;周丽英;郭晓葵;周剑影;胡勤芳因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
抗TfR-scFv-EGFP融合蛋白的构建与表达
抗TfR-scFv-EGFP融合蛋白的构建与表达代维;刘静;黄鹤;文雪;袁晓梅;雷萍;朱慧芬;沈关心【期刊名称】《中国免疫学杂志》【年(卷),期】2009(025)010【摘要】目的:抗转铁蛋白受体单链抗体(TfR-scFv)-EGFP融合蛋白真核表达载体的构建与表达.方法:设计两对引物引入连接肽(Gly4Ser)3以及酶切位点HindⅢ和BamH Ⅰ,采用重叠延伸PCR扩增与构建具有前导肽的L-VH-Linker-VL单链抗体基因,亚克隆至pEGFP-N1,转染COS-7细胞,倒置相差荧光显微镜下观察荧光蛋白表达,流式细胞术(FCM)检测细胞分泌上清与乳腺癌细胞MCF-7及黑色素瘤细胞A375结合活性.结果:测序表明获得了正确的L-VH-Linker-VL单链抗体基因序列;亚克隆至pEGFP-N1后,表达载体转染COS-7细胞,经荧光显微镜观察转染细胞,及通过流式细胞术(FCM)检测细胞分泌上清,证实抗TfR-scFv-EGFP融合蛋白在转染细胞中分泌性表达,并能够与天然高表达TfR的细胞特异性结合.结论:抗TfR-scFv-EGFP融合蛋白真核表达载体构建成功,其表达产物具有与TfR阳性细胞结合的活性.【总页数】4页(P936-939)【作者】代维;刘静;黄鹤;文雪;袁晓梅;雷萍;朱慧芬;沈关心【作者单位】华中科技大学同济医学院附属同济医院,武汉,430030;华中科技大学同济医学院免疫学系,武汉,430030;华中科技大学同济医学院免疫学系,武汉,430030;华中科技大学同济医学院免疫学系,武汉,430030;华中科技大学同济医学院免疫学系,武汉,430030;华中科技大学同济医学院免疫学系,武汉,430030;华中科技大学同济医学院免疫学系,武汉,430030;华中科技大学同济医学院免疫学系,武汉,430030【正文语种】中文【中图分类】Q816【相关文献】1.抗恶性黑素瘤单链抗体-鱼精蛋白融合蛋白表达载体的构建及评价 [J], 王昊;杨一飞;王炜;管冰;寻萌;张海;王字玲;赵勇2.抗IL-4R单链抗体与蜂毒肽融合蛋白的构建、表达与纯化 [J], 杨光勇;刘茜明;刘莉莉;王文佳;何光志3.抗CD133单链抗体/白喉毒素DAB389融合蛋白的基因构建、表达、纯化及鉴定 [J], 程金章;杨景朴;仲炜;王海涛;赵胤;陈俊俊;王宗贵;牙韩盛4.双靶点抗乳腺癌融合蛋白Del1-9-G129 R-endostatin真核表达载体的设计构建[J], 顾丽;王成华;苏凯丽;王学鑫;苏燕5.抗G7单链抗体-AP融合蛋白的构建、表达与鉴定 [J], 邵艳宏;李天宁;黄伦辉;王文皓;魏琳纳;袁玉华;刘运德因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
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EBF3与EGFP融合蛋白表达载体的构建及其在HepG2中的表达作者：毛丽萍王惠民, 王跃国, 汪晓莺【摘要】目的: 构建早期B细胞因子3（EBF3）与增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的融合基因真核表达载体pEGFP/EBF3, 使EBF3EGFP 融合蛋白在人肝癌细胞株HepG2中得到表达。
方法: 采用RT PCR 技术, 从人胎盘组织总RNA中逆转录并扩增出EBF3全长编码基因, 构建EBF3与EGFP的融合基因真核表达载体pEGFP/EBF3, 用脂质体转染技术将pEGFP/EBF3导入HepG2, 使EBF3EGFP融合蛋白得到表达。
结果: 经转化细菌、抽提质粒、酶切鉴定和DNA序列分析证实, EBF3基因已正确插入pEGFP N1中EGFP基因的上游, 获得融合基因表达载体pEGFP/EBF3。
将pEGFP/EBF3导入HepG2细胞24 h后, 在倒置荧光显微镜下可观察到EBF3EGFP融合蛋白主要表达于核内, 转染pEGFP/EBF3和pEGFP N1后48 h的转染效率分别为52%和59%。
Western blot证实转染pEGFP/EBF3后24 h和48 h细胞质和细胞核中均检出相对分子质量（Mr）为87 000的EBF3EGFP融合蛋白, 转染pEGFP/EBF3后48 h和72 h, S期细胞比例均明显高于pEGFP N1转染细胞组和未转染细胞组, 表明EBF3基因的导入可诱导细胞从G1期向G2期发展, 从而促进细胞增殖。
结论: 成功构建了真核表达载体pEGFP/EBF3, 并在HepG2细胞中进行了表达, 为进一步研究EBF3的功能提供实验基础。
【关键词】早期B细胞因子3; 融合蛋白; 增强型绿色荧光蛋白; HepG2细胞［Abstract］ AIM: To construct the eukaryotic expression vector for early human B cell factor 3(EBF3) fused with the enhanced green fluorescent protein (EGFP) and express the fusion protein EBF3EGFP in HepG2 cells. METHODS: The intact EBF3 gene was amplified from RNA isolated from the placental tissue by RT PCR. Then it was inserted into the pEGFP N1 vector to construct the recombinant eukaryotic expression vector pEGFP/EBF3. The fusion protein EBF3EGFP was expressed in HepG2 cells by the transfection of pEGFP/EBF3 into the cells. RESULTS: The pEGFP/EBF3 recombinant expression vector was constructed and confirmed by DNA sequencing, enzymatic digestion and PCR identification. 24 h after the fusion protein EBF3EGFP was transfected wiht pEGFP/EBF3, it was observed mainly in the cellular nucleus under the inverted fluorescence microscope. Both pEGFP/EBF3 and pEGFP N1 were transfected into human HepG2 cells. 24 h after the transfection, the proportion of transfection was about 52% and 59%, respectively. Western blot analysis confirmed that the EBF3EGFP fusion proteins ofMr 87 000 were detected in the cytoplasmic and nuclear protein of HepG2 transfected with pEGFP/EBF3 for 24 h or 48 h. The cell proportion in S phase increased in HepG2 cells transfected with pEGFP/EBF3 in comparison with HepG2 cells transfected with pEGFPN1 or untransfected. These findings suggested that the transfection of EBF3 gene into HepG2 induced the cell proliferation from G1 phase to G2 phase by increasing the number of cells. CONCLUSION: The construction of pEGFP/EBF3 eukaryotic expression vector and the expression of EBF3EGFP fusion protein in HepG2 cells lay a foundation for further study of the relationship between EBF3 and its growth and the proliferation of tumor cells.［Keywords］early B cell factor 3; recombinant fusion protein; EGFP; HepG2 cell［摘要］目的: 构建早期B细胞因子3（EBF3）与增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的融合基因真核表达载体pEGFP/EBF3, 使EBF3 EGFP融合蛋白在人肝癌细胞株HepG2中得到表达。
方法: 采用RT PCR技术, 从人胎盘组织总RNA中逆转录并扩增出EBF3全长编码基因, 构建EBF3与EGFP的融合基因真核表达载体pEGFP/EBF3, 用脂质体转染技术将pEGFP/EBF3导入HepG2, 使EBF3EGFP融合蛋白得到表达。
结果: 经转化细菌、抽提质粒、酶切鉴定和DNA序列分析证实, EBF3基因已正确插入pEGFPN1中EGFP基因的上游, 获得融合基因表达载体pEGFP/EBF3。
将pEGFP/EBF3导入HepG2细胞24 h后, 在倒置荧光显微镜下可观察到EBF3EGFP融合蛋白主要表达于核内, 转染pEGFP/EBF3和pEGFP N1后48 h的转染效率分别为52%和59%。
Western blot证实转染pEGFP/EBF3后24 h和48 h细胞质和细胞核中均检出相对分子质量（Mr）为87 000的EBF3EGFP融合蛋白, 转染pEGFP/EBF3后48 h 和72 h, S期细胞比例均明显高于pEGFP N1转染细胞组和未转染细胞组, 表明EBF3基因的导入可诱导细胞从G1期向G2期发展, 从而促进细胞增殖。
结论: 成功构建了真核表达载体pEGFP/EBF3, 并在HepG2细胞中进行了表达, 为进一步研究EBF3的功能提供实验基础。
［关键词］早期B细胞因子3; 融合蛋白; 增强型绿色荧光蛋白; HepG2细胞早期B细胞因子3（early B cell factor 3 , EBF3）是转录因子EBF家族成员之一, 1997年由Wang等［1］利用序列同源性筛选的方法在鼠胚胎cDNA文库中发现, 人EBF3由551个氨基酸残基组成, 相对分子质量（Mr）约为60 000, mRNA全长为4 361 bp, 基因定位于染色体10q26.3。
Zardo等［2］研究发现EBF3 mRNA广泛表达于心脏、胎盘、肝脏、骨骼肌等组织, 在大多数WHO组织病理学的分级标准中分级高的原发性脑肿瘤病例EBF3被复等位地甲基化和/或被删除, 与此一致的是EBF3表达于正常的人脑细胞系, 在脑肿瘤细胞系中沉默。
Zhao等［3］研究提示EBF3可能是一个潜在的肿瘤抑制因子。
原发性肝癌是我国常见的恶性肿瘤之一。
为探讨EBF3在肝肿瘤细胞增殖调控中的作用, 我们采用RTPCR方法从人胎盘组织总RNA中逆转录并扩增出EBF3基因的全长编码区序列, 构建增强型绿色荧光蛋白（EGFP）与EBF3的融合基因真核表达载体pEGFP/EBF3, 转染人肝癌细胞株HepG2, 使EBF3 EGFP融合蛋白得到表达, 并通过流式细胞术（FCM）分析转染细胞周期的变化。
1 材料和方法1.1 材料人肝癌细胞株（HepG2）由浙江大学医学院附属第一医院陈瑜惠赠。
真核表达载体pEGFP N1由本室保存; 限制性内切酶Hind Ⅲ和BamH Ⅰ、 dNTPs购自Promega公司; T4 DNA连接酶购自New England Bio公司; TRIzol试剂、 SuperScriptTMⅢ逆转录试剂盒、质粒抽提纯化试剂盒、 LipofectamineTM 2000转染试剂购自Invitrogen公司; PhusionTM Hot Start高保真DNA聚合酶购自Finnzymes公司; 胶回收试剂盒购自上海华舜公司; DNA marker DL 2 000购自TaKaRa公司; RPMI1640培养液购自南京凯基公司; 胎牛血清购自Gibco公司; 倒置荧光显微镜购自Leica公司; 流式细胞仪购自BD FACSCalibur公司。
细胞质与细胞核蛋白提取试剂盒、 cocktail 酶抑制剂购自Pierce公司; Western blot化学发光ECL试剂购自北京普利莱公司; 电泳及电转移仪购自BioRad公司; 小鼠抗人EBF3单克隆抗体（mAb）购自Abnova公司; PVDF膜、二喹啉甲酸（BCA）法蛋白浓度测定试剂盒、小鼠抗人αTubulin mAb、兔抗GFP抗体、 HRP标记山羊抗兔IgG二抗购自江苏碧云天生物技术研究所; 小鼠抗人Lamin B mAb购自Calbiochem 公司; HRP标记羊抗小鼠IgG二抗购自Jackson公司; RNase A、碘化丙啶购自南京生兴公司。