突变型人APP基因与增强型绿色荧光蛋白基因融合载体的构建
人LIF基因与增强型绿色荧光蛋白融合表达载体的构建及转染
人LIF基因与增强型绿色荧光蛋白融合表达载体的构建及转染林雪梅;李芳菲;姜蓉;王莎莉;王亚平【期刊名称】《西南大学学报：自然科学版》【年(卷),期】2007(29)3【摘要】目的:构建携带人LIF基因与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的融合表达载体,并转染人胚肺成纤维细胞,为研究LIF在维持人胚胎生殖细胞自我更新中的作用机制奠定基础.方法:以重组质粒pcDNA3.1/lif为模板,PCR扩增LIF基因,将扩增片断双酶切后连接到质粒pEGFP-Nl中,形成重组表达载体pEGFP-Nl/lif,并用脂质体法转染人胚肺成纤维细胞,荧光显微镜下观察,RT-PCR及Western杂交检测融合蛋白的表达.结果:成功构建融合表达载体pEGFP-N1/lif,在人胚肺成纤维细胞实现表达,检测到融合蛋白EGFP-LIF.结论重组pEGFP-N1/lif载体构建成功,可用于标记LIF 蛋白,为进一步研究LIF在维持人胚胎生殖细胞自我更新中的作用机制奠定基础.【总页数】4页(P134-137)【关键词】白血病抑制因子(LIF)基因;增强型绿色荧光蛋白;人胚肺成纤维细胞【作者】林雪梅;李芳菲;姜蓉;王莎莉;王亚平【作者单位】重庆医科大学组织学与胚胎学教研室重庆市生物化学与分子药理学重点实验室【正文语种】中文【中图分类】R321.1【相关文献】1.增强型绿色荧光蛋白基因与轮状病毒VP6基因融合表达载体的构建及表达 [J], 潘小霞;张顺;袁静;文喻玲;陈元鼎2.增强型绿色荧光蛋白基因与人血管内皮生长因子受体KDR基因胞外1-3区域融合表达载体的构建 [J], 左玲;苏冠方;栾永昕3.利用In-Fusion技术构建存活素-增强型绿色荧光蛋白融合基因重组慢病毒表达载体 [J], 林朝贵;范林;陈良龙4.人B7-2和增强型绿色荧光蛋白融合基因表达载体的构建 [J], 路静;杨洪艳;赵军;黄幼田;赵国强;董子明5.增强型绿色荧光蛋白基因与hTIMP 1基因融合表达载体的构建及鉴定 [J], 徐昭;周丽娟;李广平因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
增强型绿色荧光蛋白原核表达载体的构建及表达
增强型绿色荧光蛋白原核表达载体的构建及表达段斯亮;于声;苏晓庆【期刊名称】《广西医学》【年(卷),期】2008(30)10【摘要】目的构建以增强型绿色荧光蛋白(EGFP)为标记的原核表达栽体,并观察EGFP基因在大肠杆菌中的表达情况.方法据已知的EGFP基因序列,设计引物,并引入Nde Ⅰ和Xho Ⅰ酶切位点.采用PCR技术从含有EGFP的质粒pEGFP-C1中克隆EGFP编码序列;将其亚克隆入表达载体pTWIN1,得到以EGFP为标记的原核表达载体pTWIN-EGFP.转化大肠杆菌ER2566菌株,IPTG诱导EGFP基因表达.结果经过IPTG诱导后,细菌培养物在长波紫外线的照射下,发出明亮的绿色荧光.结论成功构建了原核表达载体pTWIN-EGFP,为应用EGFP作为报告基因和筛选标记奠定了实验基础.【总页数】4页(P1475-1477,封2)【作者】段斯亮;于声;苏晓庆【作者单位】柳州医学高等专科学校,柳州市,545006;贵阳医学院,贵阳市,550004;柳州医学高等专科学校,柳州市,545006【正文语种】中文【中图分类】R394.64【相关文献】1.增强型绿色荧光蛋白原核表达载体的构建及其表达 [J], 刘华伟;张宏;孙超;王庆贺;宋艳瑞2.增强型绿色荧光蛋白基因与轮状病毒VP6基因融合表达载体的构建及表达 [J], 潘小霞;张顺;袁静;文喻玲;陈元鼎3.小鼠增强型绿色荧光蛋白-过氧化物酶体增长因子活化受体γ2融合表达重组腺病毒的构建及表达 [J], 廖丽姿;肖金刚;杨苗苗;孔子任;孙钦策;田卫东4.增强型绿色荧光蛋白与肝细胞生长因子共表达载体的构建及表达 [J], 李兴升;王志刚;苏琳;任建丽;杨春江;郑元义;冉海涛;李攀5.颗粒溶素活性肽与增强型绿色荧光蛋白融合基因真核表达质粒的构建及其在小鼠黑色素瘤细胞中的表达 [J], 何永林;朱道银;伊正君;杨春;徐蕾;王瑜伟因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
含增强型绿色荧光蛋白的BMP2真核载体的构建和表达的开题报告
含增强型绿色荧光蛋白的BMP2真核载体的构建和表达的开题报告一、研究背景骨形态发生蛋白2（BMP2）是一种强有力的成骨分子，在骨再生和再生医学领域被广泛应用。
然而，目前BMP2的使用存在一些问题，如需高剂量才能获得良好的效果，剂量过高有可能导致不必要的副作用，同时也有可能导致药物费用的增加和药物供应的不足。
因此，建立一种新型的BMP2真核载体，可以有效提高BMP2的表达效率和骨骼生成能力，是非常重要的。
二、研究目的本研究旨在构建一种含有增强型绿色荧光蛋白（EGFP）标记的BMP2真核载体，并进一步表达该载体以验证其表达效果。
通过这种BMP2真核载体的构建和表达，可以有效提高BMP2的表达效率和骨骼生成能力。
三、研究内容和方法1.构建含增强型绿色荧光蛋白的BMP2真核载体本研究采用PCR扩增的方法，构建含有增强型绿色荧光蛋白（EGFP）标记序列的BMP2真核载体。
具体步骤如下：1）设计BMP2和EGFP的引物序列；2）通过PCR扩增的方法，获得BMP2和EGFP的DNA序列；3）将BMP2和EGFP的DNA序列进行连接，并构建含有增强型绿色荧光蛋白的BMP2真核载体。
2. 表达含有增强型绿色荧光蛋白的BMP2真核载体本研究采用转染的方法将含有增强型绿色荧光蛋白的BMP2真核载体导入到细胞中。
具体步骤如下：1）选取合适的细胞系进行转染；2）将含有增强型绿色荧光蛋白的BMP2真核载体导入到细胞中；3）观察细胞中的EGFP表达情况，并验证BMP2的表达效果。
四、预期成果1.成功构建含有增强型绿色荧光蛋白的BMP2真核载体。
2.实现含有增强型绿色荧光蛋白的BMP2真核载体的表达。
3.验证该载体在表达BMP2方面的高效性。
五、研究意义本研究的成果将为BMP2的研究和应用提供重要的理论和实验基础。
具体意义如下：1.本研究可以有效提高BMP2的表达效率和骨骼生成能力，为骨科和再生医学领域的疾病治疗提供新的治疗手段。
增强型绿色荧光蛋白与MAGE-n共表达载体的构建及表达
增强型绿色荧光蛋白与MAGE-n共表达载体的构建及表达黄亚渝;童卫;马加海;董海龙;叶菁;陈广生;张秀敏;隋延仿【期刊名称】《现代肿瘤医学》【年(卷),期】2006(14)7【摘要】目的:构建增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)与人黑色素瘤抗原-n(melanoma antigen n,MAGE-n)真核共表达载体,并在小鼠黑色素瘤B16细胞中进行表达.方法:采用酶切法从pLXSN-MAGE-n 中得到MAGE-n基因片段,克隆至真核表达载体pIRES2-EGFP中,构建真核共表达质粒pIRES2-EGFP-MAGE-n.用脂质体法转染小鼠黑色素瘤B16细胞,G418筛选阳性克隆,荧光显微镜检测阳性克隆中EGFP的表达,RT-PCR、Western blot和免疫组化分别检测阳性克隆中MAGE-n mRNA和蛋白的表达水平.结果:从pLXSN-MAGE-n重组质粒中酶切获得一条约950bp的片段,成功构建了真核共表达载体pIRES2-EGFP-MAGE-n,转染B16细胞后筛选得到阳性克隆,可见到EGFP的表达,产生明亮的绿色荧光,RT-PCR检测到MAGE-n mRNA的表达,Western blot和免疫组化检测到MAGE-n蛋白的表达.结论:成功构建了共表达质粒pIRES2-EGFP-MAGE-n,获得了稳定共表达EGFP和MAGE-n的小鼠黑色素瘤B16细胞系,为进一步研究MAGE-n在肿瘤免疫治疗中的作用奠定了基础.【总页数】4页(P783-786)【作者】黄亚渝;童卫;马加海;董海龙;叶菁;陈广生;张秀敏;隋延仿【作者单位】第四军医大学西京医院血液科,陕西,西安,710032;第四军医大学西京医院医教部教务科,陕西,西安,710032;第四军医大学基础部病理学教研室,陕西,西安,710033;第四军医大学基础部病理学教研室,陕西,西安,710033;第四军医大学基础部病理学教研室,陕西,西安,710033;第四军医大学基础部病理学教研室,陕西,西安,710033;第四军医大学基础部病理学教研室,陕西,西安,710033;第四军医大学基础部病理学教研室,陕西,西安,710033【正文语种】中文【中图分类】R730.3【相关文献】1.增强型绿色荧光蛋白原核表达载体的构建及其表达 [J], 刘华伟;张宏;孙超;王庆贺;宋艳瑞2.增强型绿色荧光蛋白基因与轮状病毒VP6基因融合表达载体的构建及表达 [J], 潘小霞;张顺;袁静;文喻玲;陈元鼎3.猪传染性胃肠炎病毒S与M基因融合表达载体及IRES连接双基因共表达载体的构建 [J], 贺小英;彭树英;杨瑞锋;张涌4.α2B-肾上腺素能受体与增强型绿色荧光蛋白标记的活化T细胞核因子2共表达稳转细胞株的构建 [J], 王震;李玉蕾;周培岚;苏瑞斌;傅风华5.增强型绿色荧光蛋白与肝细胞生长因子共表达载体的构建及表达 [J], 李兴升;王志刚;苏琳;任建丽;杨春江;郑元义;冉海涛;李攀因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
突变APP荧光融合基因的构建和表达
ｆ ｌ ｕｏ ｒ ｅ ｓ ｃ ｅ ｎ ｃ ｅ ｓ ｅ ｑｕ ｅ ｎｃ ｅ ． Ｍｅ ｔ ｈｏ ｄ ｓ Ｔｈｅ ｌ ａｓ ｔ ３ ００ ｂａ ｓ ｅｓ ｏ ｆ Ａ ＰＰ （ ｗｈｉ ｃ ｈ ｗａ ｓ ｎ ａ ｍｅ ｄ ａ ｓ Ｃ９９ ｃ ｏ ｎｔ ａ ｉ ｎｉ ｎｇ Ｆｌ ｅ ｍｉ ｓ ｈ ｍｕ ｔ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ）。ｔ ｏｇｅ ｔ ｈ ｅ ｒ
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第 ３ ６卷 第 ６ 期第 ７ ９ ５页 ２ ０ ０ ７年 ｌ ２月
华 中科 技 大 学 学 报 （ 医学版）
Ａｃ ｔ ａ Ｍｅ ｄ Ｕｎ ｉ ｖ Ｓ ｃ ｉ Ｔｅ ｃ ｈ ｎ ｏ ｌ Ｈｕ ａ ｚ ｈ ｏ ｎ ｇ
Ｖｏ１ ． ３ ６ Ｎｏ ．６ Ｐ． ７ ９ ５
性 。结 果 ① 基 因序 列 分 析 证 明 重组 质 粒 构 建 成 功 ； ② 激 光 共 聚 焦 显微 镜 下 观 察 黄 色 荧 光 分 布 于 转 染 细 胞 内 ， 表 明 融 合
基 因能 够 准 确 表 达 荧 光 ； ③ ＭＴ Ｔ检测显示 Ａ Ｂ生成 后 细 胞 活 性 下 降 ， 差异有 极显 著性意 义（ Ｐ ＜Ｏ ． Ｏ １ ） ； ④ 激 光 共 聚 焦 显 微 镜 下观 察 Ｙ Ｆ Ｐ — Ｃ ９ ９能 够 生 成 Ａ Ｂ ， 转染细胞内有荧光颗粒聚集沉积 ， 形 态 异 常 。结 论 荧 光 标 记 ＡＰ Ｐ Ｆ ｌ ｅ ｍｉ ｓ ｈ突 变 重 组质粒构建成 功， 为进一步在体研究 Ａ Ｐ Ｐ的 有 序 裂 解 特 别 是 ７裂 解 活 动 奠 定 了基 础 。 关 键 ｈ突 变 ； 基 因 融 合 中 图 法分 类 号 Ｒ ２ ７ ９
增强型绿色荧光蛋白基因的克隆和表达
增强型绿色荧光蛋白基因的克隆和表达陈曦2013141411122实验设计分析：若实验所需的目的基因EGFP及载体质粒皆只提供相关菌液，则直接提取质粒，纯化后进行双酶切及连接重组，利用热激法转化DH5α，涂抗性板后观察现象进行菌落PCR鉴定即可。
若载体质粒已准备好，仅目的基因质粒于菌内，则可直接利用菌落PCR技术提取目的基因，再与载体质粒进行slic连接后热激转化，涂抗性板后观察现象进行菌落PCR鉴定即可。
由于考虑成本问题及质粒特点，本实验主要利用双酶切法。
实验计划：1.质粒DNA的提取及检测2.DNA的限制性内切酶酶切及连接重组3.重组DNA的转化及重组子的鉴定4.利用菌落PCR技术进行阳性克隆的鉴定实验详细步骤：一、质粒DNA的提取及检测实验设计分析：由于pET- 28a质粒、pEGFP-N3质粒皆有Bam HⅠ与Not I酶切位点，且分别距EGFP基因上下游较近，而于pET- 28a中，两酶切位点距离很近，仅相隔30kb左右，且二者接含有卡纳抗性。
因而先利用碱裂解法小提质粒并纯化两质粒，为下一步双酶切做准备。
质粒示意图实验原理：分离质粒DNA的方法一般包括三个基本步骤：培养细菌使质粒扩增、收集和裂解细菌、分离和纯化质粒DNA。
实验步骤：①溶液及培养基配制。
溶液Ⅰ：葡萄糖50 mmol/L，EDTA 10 mmol/L，Tris-HCl 25 mmol/L，pH至8.0。
高压蒸汽灭菌后，4℃保存。
作用：分散细胞，螯合金属离子使酶失活，防止DNA的降解。
溶液Ⅱ：NaOH 0.2 mol/L，SDS 1%，现配现用（可均配2×溶液贮存，用前等体积混合）。
作用：细胞在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与染色体DNA发生变性。
溶液Ⅲ：按体积比5 mol/L乙酸钾：冰乙酸：ddH2O为6：1.15：2.85配制而成。
保存于4℃，用时置于冰浴中。
作用：酸性条件上质粒DNA复性，留在上清液。
大肠杆菌DNA和蛋白质-SDS复合物等发生沉淀。
串联重复核定位信号的绿色荧光蛋白融合载体的构建与原核表达
［ 关键 词 ］核定位信号； 载体蛋白质类 ； 基因表达； 蛋白纯化
［ 中图分 类号 ］ ８ ２
［ 文献标 识码 ］Ａ ［ 文章编 号 ］１ ０ ７７２０）４０４－ ０ － ０（０８０－ ０ ４ ０２ ３ ０
Ｃｏ ｓｒ ｃ ｉｎ ａ ｄ Ｐｒ ｋ ｒ ｏ ｉ ｐ ｅ ｓｏ ｆＧｒ ｅ ｌ ｏ ｅ ｃ ｎ ｎ ｔ ｕ ｔｏ ｎ ｏ ａ ｙ ｔ Ｅｘ ｒ ｓｉ ｎ ｏ ｅ ｎ Ｆ ｕ ｒ ｓ ｅ ｔ ｃ
邓 鹏 ，陈腾祥 ， 龚小卫 ”
（ 南方医科大学 病理生理学教研室 ， 广东省蛋 白质组学重点实验室 ，广东 广州 ５０１ ） １５ ５
［ 摘 要 】目的： 构建绿色荧光蛋白一 串联重复核定位信号融合蛋白的表达载体（ ｉＥ Ｆ － Ｎ Ｓ ， Ｈｓ Ｇ Ｐ３ Ｌ ） 并在原核 ． ｘ
细胞 中进行表达与纯化 。方法 ： 采用 Ｐ Ｒ方法从 原先克隆在 ｐ Ｇ ＰＣ 载体 中的 ３ Ｎ Ｓ与 Ｅ Ｆ Ｃ Ｅ Ｆ －１ ｘＬ Ｇ Ｐ编码序列扩增 出来 ， 使用常规酶切和 连接 方法 将 其重 组 至 ｐ Ｔ１ ｂ载 体 中， 阳性 克 隆进行 酶切 、 Ｃ Ｅ －４ 对 Ｐ Ｒ和测 序 鉴定 。转 化 Ｂ２（Ｅ ） Ｌ １ Ｄ ３ 大肠 杆菌株 ， ＩＴ 用 Ｐ Ｇ诱导融合蛋 白表达 ， 利用 Ｎ－ Ｔ 并 ｉ Ａ亲 和层析纯 化该 融合 蛋 白。结果 ：构建的 Ｎ
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第３ ３卷 第 ４期 ２０ ０ ８年 ８月
贵 阳 医 学 院 学 报
Ｊ ＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＧＵＩ ＹＡＮＧ Ｅ ＣＡＬ ＣＯＬ Ｍ ＤＩ ＬＥＧＥ
Ｖ０ ． ３ Ｎｏ ４ １３ ． ２０ ８ ｏ ８．
串联 重 复 核 定 位 信 号 的绿 色 荧 光 蛋 白融 合 载 体 的 构 建 与原 核 表 达 木
利用In-Fusion技术构建存活素-增强型绿色荧光蛋白融合基因重组慢病毒表达载体
利用In-Fusion技术构建存活素-增强型绿色荧光蛋白融合基因重组慢病毒表达载体【摘要】目的：本研究以构建存活素增强型绿色荧光蛋白(survivin ＆efp)融合基因慢病毒表达载体（pcfusurvivin）为例来探讨infusion克隆技术在常规载体构建中的应用价值。
方法：根据infusion技术原理，克隆引物设计时，在survivin 同源序列的两侧分别引入经ae i线性化的载体pcfu两端各15个碱基，将以此引物扩增的聚合酶链式反应（pcr）产物与线性化pcfu用infusion交换酶在室温下作用30min，使survivin特异性扩增产物两端的序列与线性化载体两端的序列发生同源交换，取2μl交换液进行转化，挑取阳性克隆，进行酶切和测序鉴定。
将鉴定正确的阳性克隆瞬时转染293t 细胞，观察survivin ＆efp融合蛋白在293t细胞中的表达。
结果：每2μl克隆交换液获得大约103个克隆数，阳性率达90%以上，瞬时转染pcfusurvivin可获得survivin ＆efp融合蛋白在293t细胞中的表达。
结论：该技术是一种非连接酶依赖性克隆技术，使基因克隆步骤简化并大大节省了实验时间和经费。
关键词】基因；克隆细胞；基因，病毒value of infusion clonin techhique on routine vector construction lin chao ui fan lin chen lian londepartment of cardioloy，union hospital，fujianmedical university，fuzhou，fujian，350001，abstract：objective:to introduce a simple method for the clonin of pcr products.methods:the infusion clonin technique was described by constructin a rebinant lentivirus vector (pcfu) with survivin ＆efp fusion ene as a sample.the survivin cdna was amplified with survivin ene specific primers with 15 bp extensions homoloous to the pcfu ends.by the action of the infusion enzyme at room temperature for 30 minutes，the sinlestranded pcr frament and vector ends were fused due to the 15 bp homoloy.finally，clones derived from transformation were chosen randomly and identified.results:about 103 positive clones for inserts were obtained after transformation with 2 μl of exchanin products，and the ratio of the positive colonies was more than 90%.after 24 h the pcfusurvivin was transfected into 293t eukaryotic cells，the expression of the survivin ＆efp fusion ene can be confirmed with fluorescence microscope.conclusion:the liation independent property makes the infusion pcr clonin technique rapid，reliable and hiher costeffective，avoidin the need for multiple sub clonin steps.key words：enes;clone cells;enes,viral传统的聚合酶链式反应（pcr）产物克隆技术包括补平末端克隆、ta克隆以及连接酶依赖性克隆等。
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突变型人APP基因与增强型绿色荧光蛋白基
因融合载体的构建
作者：张丽娟王凤斌成敏刘蓉
【摘要】目的构建携带突变型人淀粉样前体蛋白基因(APP695)与增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因融合载体。
方法在NCBI上查找APP695的序列，设计引物。
以pCB6质粒携带的野生型APP695序列为模板，以突变体引物扩增突变型APP695。
将突变型APP695与pIRES2 EGFP连接并测序证实。
结果经过酶切鉴定、PCR和DNA测序等方法，证实构建的pIRES2EGFP/APP695突变型质粒载体序列正确。
结论成功构建APP695EGFP融合基因载体，为研究AD发病的分子机制和治疗时的药物筛选奠定基础。
【关键词】瑞典突变APP695；增强型绿色荧光蛋白；APP695 EGFP融合基因；载体
【Abstract】Objective To construct and express a recombinant vector bearing fusion gene of human amyloid precursor protein (APP)695 mutant gene and enhanced fluorescence protein (EGFP) fusion gene. Methods The primers were designed according to the sequences of APP695 gene found from NCBI. Then the mutant APP695 was amplifed by PCR with pCB6
carrying wild human APP695 and acting as a template, the gene of mutant APP695 was ligated to pIRES2EGFP .The recombinant plasmid of pIRES2EGFP/APP695 mutant was verfied by checking sequences. Results The exact sequences of pIRES2EGFP/APP695 mutant vector were confirmed by digestion of restriction endonucleases, PCR and sequencing. Conclusions The pIRES2 EGFPAPP695 mutant fusion gene recombination has been constructed successfully, which lays the foundation for further research of AD pathogenesis and screening new drug targets on AD therapy.
【Key words】 Swedish mutant APP695；EGFP；Fusion gene of human APP695/ EGFP ; Vector
淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein，APP)基因是Alzheimer病(AD)已发现的诸多相关基因之一。
APP基因某些位点的突变可以引发某些家族的早发性AD，故APP的突变在AD发病中的作用引起了广泛关注。
本研究应用增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescence protein，EGFP)作为报告基因，将APP695突变基因与其融合，构建突变型APP695EGFP融合基因载体，为进一步研究APP695突变在AD发病中的作用，以及筛选对AD有治疗作用的药物奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
携带野生型人类APP695的pCB6质粒，由美国加利福尼亚大学细胞分子医学院许华熙博士惠赠。
携带EGFP的pIRES2质粒载体，由潍坊医学院免疫学教研室保存，DH5α感受态细胞为潍坊医学院免疫学实验室冻存。
NheⅠ、HindⅢ、SmaⅠ、XbaⅠ等限制性内切酶，T4DNA 连接酶与TaqDNA聚合酶，引物等均购自上海生工生物工程技术服务公司。
1.2 方法
1.2.1 pIRES2EGFP APP695融合基因重组质粒的构建
将携带EGFP的pIRES2质粒载体用NheⅠ、HindⅢ酶切后，采用PCR扩增突变型APP基因，用Premier 5软件设计PCR引物，以pCB6APP695野生型质粒载体DNA作为模板，PCR扩增突变APP基因。
引物序列为：TA1 APP U ：5′attgctagcatgctgcccggtttggcactg 3′，TA2 APP MU:5′tctgaagtgaatctggatgcagaat3′，TA3 APP MD：5′attctgcatccagattcacttcaga3′，TA4 APP D:5′。