细胞生物学实验细胞凋亡观察

实验目的：

1.了解凋亡细胞的形态学特征，加深对于细胞凋亡现象及本质的理解。

2.了解并掌握细胞凋亡检测的方法和基本原理。

实验原理：

细胞凋亡时，出现一系列形态学变化，包括凋亡细胞的染色质浓缩、边缘化，核膜裂解、染色质分割成块状，染色质的DNA出现缺口甚至断裂，出现DNA碎片，并逐渐形成凋亡小体等，经相应的染色后可以在普通光学显微镜和荧光显微镜下观察到这些变化。从而把凋亡的细胞和正常的细胞区分开来。

细胞凋亡是指细胞对环境的生理、病理性刺激信号、环境条件的变化或缓和性损伤产生的应答有序变化的死亡过程。细胞凋亡是一个主动过程，涉及一系列基因的激活、表达以及调控等的作用，它并不是病理条件下的自体损伤，而是为更好地适应生存环境的一种死亡过程。

1．细胞凋亡与细胞程序性死亡：

细胞程序性死亡的概念是指一个多细胞生物体中某些细胞的死亡是个体发育中一个预定的，并受到严格程序控制的正常组成部分。例如蝌蚪变成青蛙，其变态过程中尾部的消失伴随大量细胞死亡，高等哺乳类动物指间蹼的消失、颚融合、视网膜发育以及免疫系统的正常发育都必须有细胞死亡的参与。这些形形色色的在机体发育过程中出现的细胞死亡有一个共同特征：即散在的、逐个地从正常组织中死亡和消失，机体没有炎症反应，而且这种死亡对整个机体的发育是有利和必须的。因此认为动物发育过程中存在的细胞程序性死亡是一个发育学概念，而细胞凋亡则是一个形态学的概念，但是一般认为这两个概念可以交互使用，具有同等意义。2．细胞凋亡与坏死的区别：

虽然凋亡与坏死的最终结果极为相似，但它们的过程与表现却有很大差别。坏死是细胞受到强烈理化或生物因素作用引起细胞无序变化的死亡过程。表现为细胞胀大、胞膜破裂、细胞内容物外溢、核变化较慢、DNA降解不充分、有局部严重的炎症反应。坏死是一个被动的过程，其细胞及组织的变化与凋亡有明显的不同。

细胞凋亡的生物学特征：

形态学变化

形态学观察细胞凋亡的变化是多阶段的，细胞凋亡往往涉及单个细胞，即便是一小部分细胞也是非同步发生的。首先出现的是核糖体、线粒体等聚集，细胞体积缩小，细胞间连接消失，与周围的细胞脱离，然后是细胞质密度增加，线粒体膜电位消失，通透性改变，释放细胞色素C到胞浆，染色质逐渐凝聚成新月状附于核膜周边，嗜碱性增强。细胞核固缩呈均一的致密物，进而断裂为大小不一的片段，核膜核仁破碎，DNA降解成约180bp-200bp的小片段，胞膜有小泡状形成，膜内侧磷脂酰丝氨酸外翻到膜表面，胞膜结构仍然完整，最终可将凋亡细胞遗骸分割包裹为几个由胞膜包裹的凋亡小体，因为细胞膜保持完整，没有细胞内容物的外溢，因此不引起周围的炎症反应，凋亡小体可迅速被周围专职或非专职吞噬细胞吞噬。

细胞凋亡的生物学特征：

生物化学变化

1、DNA的片段化

细胞凋亡的一个显著特点是细胞染色体的DNA降解，这是一个较普遍的现象。这种降解特异并有规律，所产生的不同长度的DNA片段约为180-200bp的整倍数，而这正好是缠绕组蛋白寡聚体的长度，提示染色体DNA恰好是在核小体与核小体的连接部位被切断，产生不同长度的寡聚核小体片段，实验证明这种DNA的有控降解是一种内源性核酸内切酶作用的结果，该酶在核小体连接部位切断染色体DNA，这种降解在琼脂糖凝胶电泳中就呈现特异的梯状Ladder图谱，而坏死则为弥漫的连续图谱。2、大分子合成

细胞凋亡的生化改变不仅仅是DNA的有控降解，在细胞凋亡的过程中往往还有新的基因的表达和某些生物大分子的合成作为调控因子。如在糖皮质激素诱导鼠胸腺细胞凋亡过程中，加入RNA合成抑制剂或蛋白质合成抑制剂即能抑制细胞凋亡的发生。

细胞凋亡的过程：

接受凋亡信号→凋亡调控分子间的相互作用→蛋白水解酶的活化（Caspase）→进入连续反应过程。

1、凋亡的启动阶段：

细胞凋亡的启动是细胞在感受到相应的信号刺激后胞内一系列控制开关的开启或关闭，目前比较清楚的通路主要有：

1）细胞凋亡的膜受体通路

2）细胞色素C释放和Caspases激活的生物化学途经

2、凋亡的执行：

尽管凋亡过程的详细机制尚不完全清楚，但是已经确定Caspase（半胱天冬蛋白酶）在凋亡过程中是起着必不可少的作用，细胞凋亡的过程实际上是Caspase不可逆有限水解底物的级联放大反应过程（激活特定的核酸酶、破坏细胞结构、促使调节蛋白丧失功能)。

保留的细胞不健康的细胞

细胞开

始收缩

细胞崩

溃分解

成碎片

不健康的细胞已被除去，

组织内附近的细胞进行

有丝分裂，合上缺口

细胞凋亡的诱导试剂：

名称工作浓度溶剂

Actinomycin D 500ng/ml 甲醇

Aphidocolin2ug/ml 二甲亚砜

A23187 10uM 二甲亚砜

Caffeine 16mM 沸水

Camptothecin4ug/ml 二甲亚砜

Cycloheximide100ug/ml 水

Dexamethasone1uM 乙醇

Doxorubicin0.2ug/ml 水

5‐Fluorouracil 25ug/ml 二甲亚砜，热水

Hydroxyurea500nM 水

Paclitaxel100‐580nM 二甲亚砜

Staurosporine500nM 二甲亚砜

Thymidine2mM 磷酸盐缓冲液

Vinblastine60nM 甲醇

细胞凋亡的检测方法：

1.根据细胞凋亡的形态变化（如凋亡小体的出现、染色质浓缩）

2.根据细胞核DNA变化（如测定高低分子质量DNA的变化、梯状条带）

3.根据细胞膜通透性改变（如测定标记蛋白、标记酶的释放）

4.根据细胞膜成分外露（如测定磷脂酰丝氨酸）