细胞生物学实验细胞凋亡观察

实验目的：1.了解凋亡细胞的形态学特征，加深对于细胞凋亡现象及本质的理解。

2.了解并掌握细胞凋亡检测的方法和基本原理。

实验原理：细胞凋亡时，出现一系列形态学变化，包括凋亡细胞的染色质浓缩、边缘化，核膜裂解、染色质分割成块状，染色质的DNA出现缺口甚至断裂，出现DNA碎片，并逐渐形成凋亡小体等，经相应的染色后可以在普通光学显微镜和荧光显微镜下观察到这些变化。

从而把凋亡的细胞和正常的细胞区分开来。

细胞凋亡是指细胞对环境的生理、病理性刺激信号、环境条件的变化或缓和性损伤产生的应答有序变化的死亡过程。

细胞凋亡是一个主动过程，涉及一系列基因的激活、表达以及调控等的作用，它并不是病理条件下的自体损伤，而是为更好地适应生存环境的一种死亡过程。

1．细胞凋亡与细胞程序性死亡：细胞程序性死亡的概念是指一个多细胞生物体中某些细胞的死亡是个体发育中一个预定的，并受到严格程序控制的正常组成部分。

例如蝌蚪变成青蛙，其变态过程中尾部的消失伴随大量细胞死亡，高等哺乳类动物指间蹼的消失、颚融合、视网膜发育以及免疫系统的正常发育都必须有细胞死亡的参与。

这些形形色色的在机体发育过程中出现的细胞死亡有一个共同特征：即散在的、逐个地从正常组织中死亡和消失，机体没有炎症反应，而且这种死亡对整个机体的发育是有利和必须的。

因此认为动物发育过程中存在的细胞程序性死亡是一个发育学概念，而细胞凋亡则是一个形态学的概念，但是一般认为这两个概念可以交互使用，具有同等意义。

2．细胞凋亡与坏死的区别：虽然凋亡与坏死的最终结果极为相似，但它们的过程与表现却有很大差别。

坏死是细胞受到强烈理化或生物因素作用引起细胞无序变化的死亡过程。

表现为细胞胀大、胞膜破裂、细胞内容物外溢、核变化较慢、DNA降解不充分、有局部严重的炎症反应。

坏死是一个被动的过程，其细胞及组织的变化与凋亡有明显的不同。

细胞凋亡的生物学特征：形态学变化形态学观察细胞凋亡的变化是多阶段的，细胞凋亡往往涉及单个细胞，即便是一小部分细胞也是非同步发生的。

首先出现的是核糖体、线粒体等聚集，细胞体积缩小，细胞间连接消失，与周围的细胞脱离，然后是细胞质密度增加，线粒体膜电位消失，通透性改变，释放细胞色素C到胞浆，染色质逐渐凝聚成新月状附于核膜周边，嗜碱性增强。

细胞核固缩呈均一的致密物，进而断裂为大小不一的片段，核膜核仁破碎，DNA降解成约180bp-200bp的小片段，胞膜有小泡状形成，膜内侧磷脂酰丝氨酸外翻到膜表面，胞膜结构仍然完整，最终可将凋亡细胞遗骸分割包裹为几个由胞膜包裹的凋亡小体，因为细胞膜保持完整，没有细胞内容物的外溢，因此不引起周围的炎症反应，凋亡小体可迅速被周围专职或非专职吞噬细胞吞噬。

细胞凋亡的生物学特征：生物化学变化1、DNA的片段化细胞凋亡的一个显著特点是细胞染色体的DNA降解，这是一个较普遍的现象。

这种降解特异并有规律，所产生的不同长度的DNA片段约为180-200bp的整倍数，而这正好是缠绕组蛋白寡聚体的长度，提示染色体DNA恰好是在核小体与核小体的连接部位被切断，产生不同长度的寡聚核小体片段，实验证明这种DNA的有控降解是一种内源性核酸内切酶作用的结果，该酶在核小体连接部位切断染色体DNA，这种降解在琼脂糖凝胶电泳中就呈现特异的梯状Ladder图谱，而坏死则为弥漫的连续图谱。

2、大分子合成细胞凋亡的生化改变不仅仅是DNA的有控降解，在细胞凋亡的过程中往往还有新的基因的表达和某些生物大分子的合成作为调控因子。

如在糖皮质激素诱导鼠胸腺细胞凋亡过程中，加入RNA合成抑制剂或蛋白质合成抑制剂即能抑制细胞凋亡的发生。

细胞凋亡的过程：接受凋亡信号→凋亡调控分子间的相互作用→蛋白水解酶的活化（Caspase）→进入连续反应过程。

1、凋亡的启动阶段：细胞凋亡的启动是细胞在感受到相应的信号刺激后胞内一系列控制开关的开启或关闭，目前比较清楚的通路主要有：1）细胞凋亡的膜受体通路2）细胞色素C释放和Caspases激活的生物化学途经2、凋亡的执行：尽管凋亡过程的详细机制尚不完全清楚，但是已经确定Caspase（半胱天冬蛋白酶）在凋亡过程中是起着必不可少的作用，细胞凋亡的过程实际上是Caspase不可逆有限水解底物的级联放大反应过程（激活特定的核酸酶、破坏细胞结构、促使调节蛋白丧失功能)。

保留的细胞不健康的细胞细胞开始收缩细胞崩溃分解成碎片不健康的细胞已被除去，组织内附近的细胞进行有丝分裂，合上缺口细胞凋亡的诱导试剂：名称工作浓度溶剂Actinomycin D 500ng/ml 甲醇Aphidocolin2ug/ml 二甲亚砜A23187 10uM 二甲亚砜Caffeine 16mM 沸水Camptothecin4ug/ml 二甲亚砜Cycloheximide100ug/ml 水Dexamethasone1uM 乙醇Doxorubicin0.2ug/ml 水5‐Fluorouracil 25ug/ml 二甲亚砜，热水Hydroxyurea500nM 水Paclitaxel100‐580nM 二甲亚砜Staurosporine500nM 二甲亚砜Thymidine2mM 磷酸盐缓冲液Vinblastine60nM 甲醇细胞凋亡的检测方法：1.根据细胞凋亡的形态变化（如凋亡小体的出现、染色质浓缩）2.根据细胞核DNA变化（如测定高低分子质量DNA的变化、梯状条带）3.根据细胞膜通透性改变（如测定标记蛋白、标记酶的释放）4.根据细胞膜成分外露（如测定磷脂酰丝氨酸）细胞凋亡的检测方法：1、形态学观察方法：①Gimsa染色：凋亡细胞呈圆形，胞核深染，胞质浓缩，染色质成团块状，细胞表面有“出芽”现象，晚期凋亡细胞可见凋亡小体。

②台盼蓝染色：台盼蓝染料可以进入细胞膜不完整、破裂的坏死细胞。

③Hoechst染色：细胞核为蓝色。

凋亡细胞的染色质凝聚且边缘化，可见DNA碎片。

④PI（碘化丙啶）染色：正常细胞的细胞核呈红色；早期凋亡细胞胞核浓缩，染色加深，或核染色质聚集于核膜一边，呈新月状；晚期凋亡细胞胞核碎裂成大小不等的原形小体，并被细胞膜所包绕，即凋亡小体。

⑤AO（吖啶橙）和EB（溴化乙锭）双染色：AO可以透过细胞膜完整的细胞而嵌入核DNA呈绿色，EB只能透过细胞膜破损的细胞而嵌入核DNA呈红色。

显微镜下观察，活细胞为荧光深浅不一的结构样特征，核染色质为绿色；凋亡细胞染色强，亮度高，核染色质呈黄绿色浓聚在核膜内侧，可见细胞膜呈泡状膨出及凋亡小体或均匀一致的圆状或固缩团状结构。

⑥透射电镜观察：凋亡细胞表面微绒毛消失，核染色质固缩、边集，常呈新月形，核膜皱褶，胞质紧实，细胞器集中，胞膜起泡或出“芽”，同时可以观察到凋亡小体和凋亡小体被临近巨噬细胞吞噬。

细胞凋亡的检测方法：2、DNA凝胶电泳：细胞发生凋亡或坏死，其细胞DNA均发生断裂，细胞内小分子量DNA片断增加，高分子DNA减少，胞质内出现DNA片断。

但凋亡细胞DNA断裂点均有规律的发生在核小体之间，出现180－200bpDNA片断，而坏死细胞的DNA断裂点为无特征的杂乱片断，利用此特征可以确定群体细胞的死亡，并可与坏死细胞区别：正常活细胞DNA 电泳出现阶梯状条带；坏死细胞DNA电泳为连续性条带。

3、磷脂酰丝氨酸外翻分析法（凋亡早期）：磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine, PS）正常位于细胞膜的内侧，但在细胞凋亡的早期，PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中。

Annexin-V是一种分子量为35~36kD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力特异性结合。

将Annexin-V进行荧光素标记后作为荧光探针，结合荧光显微镜或流式细胞仪可检测细胞凋亡的发生。

细胞凋亡的检测方法：4、线粒体膜电位变化的检测（凋亡早期）：线粒体在细胞凋亡的过程中起着枢纽作用，多种细胞凋亡刺激因子均可诱导不同的细胞发生凋亡，而线粒体跨膜电位的下降，被认为是细胞凋亡级联反应过程中最早发生的事件，它发生在细胞核凋亡特征（染色质浓缩、DNA断裂）出现之前。

可以导致膜通透性的改变。

MitoSensor TM为一个阳离子性的染色剂，对此线粒体跨膜电位改变非常敏感，呈现出不同的荧光染色。

正常细胞中，它在线粒体中形成聚集体，发出强烈的红色荧光。

凋亡细胞中，因线粒体穿膜电位的改变，它以单体形式存在于细胞液中，发出绿色荧光。

用荧光显微镜或流式细胞仪可清楚地分辨这两种不同的荧光信号。

5、Caspase-3活性的检测（凋亡早期）：Caspase家族在介导细胞凋亡的过程中起着非常重要的作用，其中Caspase-3为关键的执行分子，它在凋亡信号传导的许多途径中发挥功能。

Caspase-3正常以酶原（32kD）的形式存在于胞浆中，在凋亡的早期阶段，它被激活，活化的Caspase-3由两个大亚基（17kD）和两个小亚基（12kD）组成，裂解相应的胞浆胞核底物，最终导致细胞凋亡。

但在细胞凋亡的晚期和死亡细胞，Caspase-3的活性明显下降。

细胞凋亡的检测方法：5、TUNEL法（凋亡晚期）：细胞凋亡中,染色体DNA双链断裂或单链断裂而产生大量的粘性3’-OH末端，可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）的作用下，将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸酶或生物素形成的衍生物标记到DNA的3’-末端，从而可进行凋亡细胞的检测，这类方法称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（Terminal–deoxynucleotidyl Transferase Mediated Nick End Labeling,TUNEL）。

由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂，因而没有3’-OH形成，很少能够被染色。

TUNEL实际上是分子生物学与形态学相结合的研究方法，对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色，能准确地反应细胞凋亡典型的生物化学和形态特征，可用于石蜡包埋组织切片、冰冻组织切片、培养的细胞，并可检测出极少量的凋亡细胞，因而在细胞凋亡的研究中被广泛采用。

6、凋亡相关蛋白的表达和细胞定位分析（凋亡不同时期）实验器材：普通光学显微镜、荧光显微镜、剪刀、镊子、载玻片、盖玻片、注射器、滤纸、胶头吸管、细胞计数板、移液器、移液管、24孔板、烧杯、容量瓶、酒精灯。

实验试剂：1.293Cell、DMEM、FBS、H2O2、PBS、乙醇。

2.Gimsa染液：0.5g Gimsa溶于50ml甲醇中，在研钵中充分研磨，溶解后加入50ml甘油，混合均匀后至于37℃恒温箱中放置10小时，用棕色瓶密封保存备用。

3.Hoechst33258染液：超纯水溶解Hoechst33258至终浓度为1mg/ml，在4℃长期保存。

PI（碘化丙啶）染液：PI溶于含0.1%TritionX-100的PBS中，终浓度为50μg/ml，含RNase100μg/ml，避光保存。