血小板膜表面抗体测定
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血小板膜表面CD62P检测活化方法
血小板膜表面CD62P检测
操作步骤
1. 标本采集：
(1)采血管顺序编号。
(2)抽取静脉血，采血管中注入2ml。
(3)于10分钟之内完成血小板激活和染色步骤，操作时应注意
减少人工激活。
注意事项：1、至少要采集10ml全血
2、而且必须用粗针采血
3、如果是用注射器，则将采的血先放入才血管，最后将
剩余的几毫升弃掉或做它用。
4、如果是用采血针采血，先弃掉2ml,然后再往采血管中采
集。
2. 荧光抗体染色：
(1)取2支试管，加入待测外周血标本，两管各加5ul
(2)在对照管中加入CD62P的同型对照抗体、CD61 各20μl
(3)在试验管中加入CD62p抗体和CD61抗体各20μl。
(4)轻轻混匀，室温暗处孵育15-20分钟。
(5)孵育后，加入500ul的PBS（若血小板数目过多，可以多加一
些PBS），混匀后上机检测；若不能立即上机，加入500ul 1%的多聚甲醛溶液固定，24小时内上机分析。
注意事项：
1、在所有操作中动作应轻柔，不可力度过大，因为血小板容易活化
2、方案的建立：
两张图：（1）散点图CD61/SS，圈CD61阳性的血小板（2）直方图CD62P，分析血小板的表达情况
FS，SS均应选择Log方式检测，阈值设在FL1（CD61的荧光通道）上，值可能会比较大，可能在200、300左右。
血小板抗体检测临床应用妇产科篇
2.糖皮质激素治疗
在分娩时选择性剖宫产可能有助于防止脑出血发生。
3.剖腹产
在一些情况，IVIG的作用是不可预测的，因此需要每周进行宫内血小板输注。然而在子宫内的血小板输注是一种侵入性的过程，有胎儿损失的风险，尤其是对低血小板计数的胎儿。如果出血性疾病是由血管损伤造成的，那么输血小板是不起作用的。胎儿血小板输注可能需要重新评估，以更好地平衡这种治疗的风险和有效性。
血小板抗原
相关疾病与反应
同种异体抗原同种抗原自身抗原药物依赖性抗原
输注无效发热、变态反应,TRALI流产新生儿（或胎儿）血小板减少、颅内出血
输注无效非溶血性输血反应反复流产新生儿同种免疫性血小板减少症（NAIT）
血小板血型与临床--同种异体抗原
血小板
输血
妊娠
骨髓移植
致敏血小板并引起破坏
抗供者血小板抗体
1
胎儿宫内死亡或颅内出血（ICH）可能早在14-16周妊娠时发生；而在妊娠30周之前，胎儿因NAIT导致的ICH发生的概率为10%。患有NAIT的新生儿产后患有ICH的概率为10%~20%，其中有10%的死亡率。研究者发现，患有ICH的新生儿常伴有神经功能损伤。
2
与新生儿溶血病不同的是，NAIT可能会出现在第一次妊娠，且在以后的妊娠中血小板抗体阳性率为100%，患有NAIT的概率非常高，且血小板减少症的程度更严重。
在胎儿出生前再检测一次孕妇体内血小板抗体的水平，如阳性则提示临床医生要做好胎儿患新生儿血小板相关性疾病的治疗预案。
临床意义
妊娠期血小板降低的查因：对于妊娠期血小板减低的孕妇（尤其是罹患或有自身免疫性疾病史）建议进行血小板抗体检测以对其孕期流产、死胎以及新生儿罹患血小板相关免疫性疾病的风险作出评估并提示临床医生尽早制定相应治疗方案。
在分娩时选择性剖宫产可能有助于防止脑出血发生。
3.剖腹产
在一些情况，IVIG的作用是不可预测的，因此需要每周进行宫内血小板输注。然而在子宫内的血小板输注是一种侵入性的过程，有胎儿损失的风险，尤其是对低血小板计数的胎儿。如果出血性疾病是由血管损伤造成的，那么输血小板是不起作用的。胎儿血小板输注可能需要重新评估，以更好地平衡这种治疗的风险和有效性。
血小板抗原
相关疾病与反应
同种异体抗原同种抗原自身抗原药物依赖性抗原
输注无效发热、变态反应,TRALI流产新生儿（或胎儿）血小板减少、颅内出血
输注无效非溶血性输血反应反复流产新生儿同种免疫性血小板减少症（NAIT）
血小板血型与临床--同种异体抗原
血小板
输血
妊娠
骨髓移植
致敏血小板并引起破坏
抗供者血小板抗体
1
胎儿宫内死亡或颅内出血（ICH）可能早在14-16周妊娠时发生；而在妊娠30周之前，胎儿因NAIT导致的ICH发生的概率为10%。患有NAIT的新生儿产后患有ICH的概率为10%~20%，其中有10%的死亡率。研究者发现，患有ICH的新生儿常伴有神经功能损伤。
2
与新生儿溶血病不同的是，NAIT可能会出现在第一次妊娠，且在以后的妊娠中血小板抗体阳性率为100%，患有NAIT的概率非常高，且血小板减少症的程度更严重。
在胎儿出生前再检测一次孕妇体内血小板抗体的水平，如阳性则提示临床医生要做好胎儿患新生儿血小板相关性疾病的治疗预案。
临床意义
妊娠期血小板降低的查因：对于妊娠期血小板减低的孕妇（尤其是罹患或有自身免疫性疾病史）建议进行血小板抗体检测以对其孕期流产、死胎以及新生儿罹患血小板相关免疫性疾病的风险作出评估并提示临床医生尽早制定相应治疗方案。
流式细胞术检测血小板功能及其临床应用
由于血小板的活化程度可由血小板 酶作外源激动剂时 ,为防止血小板聚集
膜糖蛋白表达水平的高低来判断 ,近年 并形成纤维蛋白凝块 ,可在全血标本中
来 ,文献报道利用流式细胞术 ,特别是全 加 入 四 肽 化 合 物 Gly2Pro2Arg2Pro
血法流式细胞术 ,检测血小板膜糖蛋白 ( GPRP) [3] 。固定这一步若不干扰单抗
它仅在血小板活化时才因构象变化而显 活化血小板检测的一些代表性单抗 。
21 血小板缺陷性疾病 :全血法流式
露出来 。因此 ,使用这个表位的荧光单 抗 ,我们能更精确地在更早阶段检测到
三 、诊断学意义及临床应用
细胞术提供了一个简单 、迅速的方法来
利用全血法流式细胞术检测上述血 诊断血小板膜糖蛋白缺陷性疾病 ,如巨
号 。探测器收集每个细胞的荧光讯号和 的百分率 。阳性血小板百分率法与荧光
光散射 ,然后传入计算机进行分析 。 传统的流式细胞术检测血小板膜糖
蛋白的表达 ,常用的样本是经洗涤的血 小板或富含血小板的血浆 。由于血小板 极易活化激惹 , 样本经离心 、洗涤等步 骤 ,容易人为地导致体外血小板激活 ,影 响临床诊断价值 。为此 ,Shatti 等[2] 引入 了全血法流式细胞术 。该技术能使用全 血样本测定循环中血小板的活化状态以 及血小板对激活剂的功能应答 。
抽血抗凝 →稀释 →生物素化的检测
板相关疾病的诊断中 ,检测血小板功能 用单克隆抗体 (单抗) →激动剂或缓冲液
的方法常常是有争议的 。这通常是由于 →固定 (1 %多聚甲醛) →FITC 标记的鉴
方法本身的原因造成的[1] ,譬如 ,静脉阻 别用单抗 →PE2卵白素 →稀释 。
滞 、抗凝剂选择 、离心 ,甚至标本处理不
流式细胞术(Flow Cytometry,FCM)检测血小板功能及其临床应用
流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）检测血小板功能及其临床应用血小板功能的检测包括测定血小板粘附、聚集和活化的能力。
然而，在血小板相关疾病的诊断中，检测血小板功能的方法常常是有争议的。
这通常是由于方法本身的原因造成的［1］，譬如，静脉阻滞、抗凝剂选择、离心，甚至标本处理不当等因素，都可导致医源性血小板激活，影响临床诊断的价值。
这就要求建立一种灵敏、精确、快速、简便，最好可用于临床常规检测血小板功能测定方法。
关键词：血小板临床应用流式细胞术血小板功能的检测包括测定血小板粘附、聚集和活化的能力。
然而，在血小板相关疾病的诊断中，检测血小板功能的方法常常是有争议的。
这通常是由于方法本身的原因造成的［1］，譬如，静脉阻滞、抗凝剂选择、离心，甚至标本处理不当等因素，都可导致医源性血小板激活，影响临床诊断的价值。
这就要求建立一种灵敏、精确、快速、简便，最好可用于临床常规检测血小板功能测定方法。
由于血小板的活化程度可由血小板膜糖蛋白表达水平的高低来判断，近年来，文献报道利用流式细胞术，特别是全血法流式细胞术，检测血小板膜糖蛋白的表达［2］。
该技术能灵敏、特异地检测血液中活化血小板，并评价其功能。
现就全血法流式细胞术检测血小板功能的方法及临床应用现状和潜力进行综述。
一、全血法流式细胞术1.方法学：流式细胞仪能快速测定大量个体细胞的特性。
样品中欲分析的细胞预先进行荧光标记，然后由压缩氮经硅管送达标本室，再以5 000～10 000个细胞/秒的速率逐个射入光敏感区。
在适当波长的激发光作用下，被特殊染色的细胞发射出一定量的荧光脉冲讯号。
探测器收集每个细胞的荧光讯号和光散射，然后传入计算机进行分析。
传统的流式细胞术检测血小板膜糖蛋白的表达，常用的样本是经洗涤的血小板或富含血小板的血浆。
由于血小板极易活化激惹，样本经离心、洗涤等步骤，容易人为地导致体外血小板激活，影响临床诊断价值。
为此，Shatti等［2］引入了全血法流式细胞术。
各类血小板功能检测的临床意义
显微镜计数法
通过人工显微镜观察血液样本，计数血小板数 量。
其他方法
如流式细胞术、电镜技术等，用于特殊情况下或进一步研究。
血小板计数检测的临床意义
诊断出血性疾病
血小板计数是诊断出血性疾病的 重要指标，如特发性血小板减少 性紫癜、血栓性疾病等。
监测抗凝治疗
对于接受抗凝治疗的患者，定期 检测血小板计数有助于评估治疗 效果和调整治疗方案。
通过检测血小板表面的活化标记物， 了解血小板活性状态。
血小板功能检测的临床应用
诊断血栓性疾病
通过对血小板功能的检测，有助于诊 断血栓性疾病，如动脉粥样硬化、心 肌梗死、脑卒中等。
评估心血管疾病风险
通过检测血小板功能，可以评估个体 发生心血管疾病的风险，为预防和治 疗提供依据。监测抗血小板药物治疗效果来自血小板活化检测的临床意义
诊断血栓性疾病
01
血小板活化是血栓形成的关键步骤，通过检测血小板活化程度
有助于诊断血栓性疾病，如心肌梗死、脑梗死等。
评估抗血小板治疗效果
02
对于接受抗血小板治疗的患者，检测血小板活化程度有助于评
估治疗效果，指导治疗方案调整。
预测心血管事件风险
03
血小板活化程度与心血管事件风险密切相关，通过检测血小板
活化程度有助于预测患者发生心血管事件的风险。
血小板活化检测的注意事项
01
02
03
标本采集和处理
采集血液标本时应避免过 度挤压和抗凝剂不足，防 止血小板活化和聚集。
检测方法选择
不同检测方法对血小板活 化的敏感性和特异性存在 差异，应根据具体情况选 择合适的检测方法。
结果解读
结合患者临床表现和其他 检查结果综合分析血小板 活化检测结果，避免误诊 和漏诊。
血小板 抗原抗体检测
自身 抗体
被动同种异体免疫 性血小板减少症
移植相关同种异体 免疫性血小板减少 症
自发性血小板减少 症
继发于母体自发性 血小板减少症
HLA / HPA 抗 体
HPA1b(78%), HPA5b(19%) HPA-2,3,4(3%),HPA-15,HPA-9bw, AntiCD36 HLA-I抗体50~80% 17~25%(日本人为 HPA-2b), HPA-15, anti-CD36 HPA-1a,HPA-1b,HPA-2b,HPA-3a,HPA3b,HPA-15, anti-CD36 HPA-1a,HPA-5b
血小板抗原抗体
广州医科大学附属第五医院 输血科
b
1
目录
血小板抗原 血小板抗体 抗体检测及交叉配血
血小板相关疾病
b
2
血小板抗原
❖ 血小板抗原泛指存在于血小板膜的能够刺激机体产生抗体, 并能与之结合的血小板膜蛋白质和糖分子.
❖ 血小板相关抗原: 红细胞血型抗原：ABO、Lewis和P系统抗原等，无RH抗原 白细胞抗原：HLA抗原
筛选基因型相容的供者 避免血小板抗体的产生
采取预防和治疗措施 避免流产、出血等
减少血小板输注无效 避免紫癜、出血和死亡
b
11
血小板抗原定型
HPA-1 HPA-2 HPA-3 HPA-4 HPA-5 HPA-15 a ba ba b a b ab a b
阳性对照条带 等位基因条带
1bb
2ab
3bb
4aa 5aa 15aa
❖ 血小板特异性抗原（human platelet antigen，HPA）
b
3
血小板抗原
血型抗原：ABO、Lewis和P系统抗原等，无RH抗原 ❖ 来源：血小板表面的A、B抗原来源主要有两个：大部分是血小板本身所
血小板抗体检测和相容性血小板输注的应用
血紫癜 （Ｔ ） Ｐ Ｐ 相符合 。 对血小板输注疗效 的评价 ， 由于血小板
输 注后 患 者 出血症 状 不易 量化 ，故 以血小 板恢 复 百分 率
的 １ ３例 进 行 ２次 以 上 血 小 板 输 注 治 疗 的血 液 病 及 肿 瘤 患 １
上普遍采用机采血小板输注 ， 但有妊娠史 的女性或 多次输血
的患者 ， 易产生同种免疫 ， 导致血小板输注无效 （Ｔ 。本文 Ｐ Ｒ） 通过对 １ ３例多次输注 机采血小板 的患者进行 血小板抗体 １
展 ， 腔镜 、 腹 宫腔 镜 下 处 理 子宫 肌 瘤 已成 为手 术 发 展 的方 向 ， 具 有 创 伤 出血 少 、 复 快 的 特 点 。 恢
［ ］ 黎培毅 ， ４ 刘宏伟 ， 杨延林 ． 腹式筋膜 内子宫 切除术． 用妇产科 实
杂志，９ ８ １ （ ）３ ． １９ ，４ １ ：６ ［ ］ 唐 良萏 ， ５ 卞度宏． 妊娠合并子宫肌瘤 的处理 ． 实用妇产 科杂志 ，
被检测 。
１ 统计 学 处 理 ． ４
Ａ Ｏ血 型不合而导致血小板破坏 ｌ。若血小板输 注后 １ｈ的 Ｂ ５ ｌ Ｃ Ｉ７ ， Ｃ＜ ． 应首先考虑免疫 因素所 致 ； １ｈ的 Ｃ Ｉ 数在正 ５ 若 Ｃ指
常范 围内， ２ 而 ４ｈ的 Ｃ Ｉ４５ 则应考 虑非免疫性 因素所致 。 Ｃ ＜ ．， 本研究结果显示 ４ ． ６９ ％患者出现 Ｐ Ｒ， Ｔ 与文献 ［ ］ ６ 报道在多次 输血 和慢性血小板减少 患者 中 ，有 ３ ％一０ ０ ７ ％出现血小板输
为正常卵巢组织。我院在全子宫切除术时是否切 除卵巢 已采 取非常慎重的态度 。术中应仔细检查双侧卵巢 ， 若正常 ． 原则 上予 以保 留。
参 考 文 献
血液学检验33第七章-第2节-血小板的检验
1.是诊断特发性血小板减少性紫癜的指标之一 2.是ITP观察疗效及估计预后的指标 3.有助于研究其他疾病的免疫机制 【应用评价】 1.方法学
2.自身抗体的类型
第二节 血小板检验
六、血小板生存时间
【实验原理】根据观察单次剂量服用阿司匹林后血 小板TXB2和MDA生成量的恢复曲线可以反映血小板 的生存时间。可用ELISA或RIA测定TXB2或MDA的含 量。 【参考区间】TXB2法 7.6～12d，MDA法 9～12d
第二节 血小板检验
六、血小板生存时间
【临床意义】PST缩短见于血小板破坏增多性疾病 、 血小板消耗过多性疾病、高凝状态和血栓性疾病等。 【应用评价】PST测定主要有放射性核素和非放射性 核素两类方法。放射性核素法测定的准确度较高； TXB2或MDA测定的非放射性核素法可避免使用放射性 核素，操作简便。
第 第一 七章 章 造 血血栓及与造止血血调疾控病 检验技术
第一节 造血器官与造血微环境 第二节 血小板检验
单击目此录处编辑母版标题样式
一、血小板黏附试验 二、血小板聚集试验 三、血小板膜糖蛋白测定 四、血小板活化分析 五、血小板自身抗体 六、血小板生存时间 七、血小板第3因子有效性测定
第二节 血小板检验
第二节 血小板检验
七单、击血小此板处第编3因辑子母有版效标性测题定样（式PF3 ）
【实验原理】将健康人和患者的富含血小板血（PRP） 和乏血小板血浆（PPP）交叉混合，以白陶土激活 FⅫ，加钙离子后测定混合血浆的凝固时间，比较各 组血浆凝固时间的差异，从而判断PF3是否有缺陷。 【参考区间】受检者与健康人PRP、PPP交叉混合的 凝固时间延长＜5s 。
第二节 血小板检验
二、血小板聚集试验
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操作：
富集血小板法：
1）800r/min*15min,取上清，
2）加4－5ml鞘液，2000r/min*3min,弃上清，重复一次。
3)分别向试管中加入准备好的10u1含血小板的PBS（血小板的量约为106）（血小板若在正常范围，稀释到原量直接取10u1。）。
4)分别向已编好号的试管中依次加入一抗和二抗（设对照）
采集部位静脉采血
抗凝剂EDTA或肝素抗凝血
要求1．样本量2ml。
2．样本应在采集后6小时内完成，冷冻的标本或已固定的标本不能用。
3．样本血小板计数应在150-450×109/L之间。若>450×109/L，样本需要稀释，用PBS稀释；若<150×109/L，应多采集进行富集达到流式检测的细胞数。
4．溶血样本不能用。
C：多聚甲醛液体14ML室温
3：鞘液液体20L室温
4：清洗液液体5L室温
5：荧光微球液体10ML2-8℃
质控品BEKAMANCOULT，稀释的试剂于2-8℃可稳定2周；每天校准一次：遇特殊情况随时进行校准。
仪器
BeckmanCoulterEPICSXL/FC500/Altra
试剂
品牌剂型规格贮存
贝克曼库尔特
成分1：一抗冻干0.2mg-20℃
小鼠抗IgD(No.IM0284)IgG(No.IM0279)IgM(No.IM0285)
二抗：山羊抗小鼠IgG(H+L) (No.IM0819)
冻干1mg-20℃
2：全血溶血试剂液体
A：甲酸液体70ML室温
B：碳酸钠等液体32ML室温
方案（Protocol）
5)混匀，避光，室温孵育20-30分钟
6)洗或不洗，上机测样
全血法：
1）加4－5ml鞘液，1500r/min*15min,弃上清，后同上3）－6）
报告结果
报告百分数
操作性能
精密度批内五次重复CV<2％
参考值
IgA<2.98% IgG<3.04%
IgM<3.0% IgD<2.91%
临床意义
为免疫性血小板减少性紫癜(ITP)诊断、治疗、预后估计的重要指标，在ITP、胶原性疾病时升高。
血小板膜表面抗体测定
方法
流式细胞仪(BeckmanCoulter，贝克曼库尔特)
原理：
间接免疫荧光法。FITC标记的各型多克隆抗体，加到经离心富集的血小板中，与血小板膜上的相应的IgG-Fc片段结合，经过洗涤（和固定）等步骤后，在流式细胞仪上进行分析。
标本采集与处理
受检者的准备检查对象生活饮食处于日常状态。
富集血小板法：
1）800r/min*15min,取上清，
2）加4－5ml鞘液，2000r/min*3min,弃上清，重复一次。
3)分别向试管中加入准备好的10u1含血小板的PBS（血小板的量约为106）（血小板若在正常范围，稀释到原量直接取10u1。）。
4)分别向已编好号的试管中依次加入一抗和二抗（设对照）
采集部位静脉采血
抗凝剂EDTA或肝素抗凝血
要求1．样本量2ml。
2．样本应在采集后6小时内完成，冷冻的标本或已固定的标本不能用。
3．样本血小板计数应在150-450×109/L之间。若>450×109/L，样本需要稀释，用PBS稀释；若<150×109/L，应多采集进行富集达到流式检测的细胞数。
4．溶血样本不能用。
C：多聚甲醛液体14ML室温
3：鞘液液体20L室温
4：清洗液液体5L室温
5：荧光微球液体10ML2-8℃
质控品BEKAMANCOULT，稀释的试剂于2-8℃可稳定2周；每天校准一次：遇特殊情况随时进行校准。
仪器
BeckmanCoulterEPICSXL/FC500/Altra
试剂
品牌剂型规格贮存
贝克曼库尔特
成分1：一抗冻干0.2mg-20℃
小鼠抗IgD(No.IM0284)IgG(No.IM0279)IgM(No.IM0285)
二抗：山羊抗小鼠IgG(H+L) (No.IM0819)
冻干1mg-20℃
2：全血溶血试剂液体
A：甲酸液体70ML室温
B：碳酸钠等液体32ML室温
方案（Protocol）
5)混匀，避光，室温孵育20-30分钟
6)洗或不洗，上机测样
全血法：
1）加4－5ml鞘液，1500r/min*15min,弃上清，后同上3）－6）
报告结果
报告百分数
操作性能
精密度批内五次重复CV<2％
参考值
IgA<2.98% IgG<3.04%
IgM<3.0% IgD<2.91%
临床意义
为免疫性血小板减少性紫癜(ITP)诊断、治疗、预后估计的重要指标，在ITP、胶原性疾病时升高。
血小板膜表面抗体测定
方法
流式细胞仪(BeckmanCoulter，贝克曼库尔特)
原理：
间接免疫荧光法。FITC标记的各型多克隆抗体，加到经离心富集的血小板中，与血小板膜上的相应的IgG-Fc片段结合，经过洗涤（和固定）等步骤后，在流式细胞仪上进行分析。
标本采集与处理
受检者的准备检查对象生活饮食处于日常状态。