针对Ⅰ型及Ⅲ型前胶原基因的二联核酶的构建及体外活性研究
基因沉默与RNAi技术
基因沉默与RNAi技术定义：基因沉默双是指链RNA被特异的核酸酶降解，产生干扰小RNA(siRNA)，这些siRNA与同源的靶RNA互补结合，特异性酶降解靶RNA，从而抑制、下调基因表达。
RNA干扰是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。
由双链引发的植物RNA沉默，主要有转录水平的基因沉默(TGS)和转录后水平的基因沉默(PTGS)两类:TGS是指由于DNA修饰或染色体异染色质化等原因使基因不能正常转录;PTGS是启动了细胞质内靶mRNA序列特异性的降解机制。
有时转基因会同时导致TGS和PTGS。
基因沉默是一种RNA干扰技术。
RNA干扰是由双链RNA 引发的转录后基因静默机制。
其原理是：RNaseIII核酶家族的Dicer，与双链RNA结合，将其剪切成21 - 25nt及3'端突出的小干扰RNA (small interfering RNA，siRNA)，随后siRNA与RNA诱导沉默复合物(RNA - induced silencing complex，RISC结合，解旋成单链，活化的RISC受已成单链的siRNA引导，序列特异性地结合在靶mRNA上并将其切断，引发靶mRNA的特异性分解，从而阻断相应基因表达的转录后基因沉默机制.一、基因沉默的分类及其机制（一）转录水平基因沉默转录水平基因沉默是指对基因专一的细胞核ＲＮＡ合成的失活，它的发生主要是由于基因无法被顺利转录成相应的ＲＮＡ而导致基因沉默。
转录水平基因沉默可以通过有性世代传递，表现为减数分裂的可遗传性。
引起转录水平基因沉默的机制主要有以下几种：１．基因及其启动子甲基化甲基化是活体细胞中最常见的一种ＤＮＡ共价修饰形式，通常发生在ＤＮＡ的ＣＧ序列的碱基上，该区碱基甲基化往往导致转录受抑制，该区甲基化的频率在人类及高等植物中分别可达４％和３６％。
［４］近来的研究表明，发生在转基因启动子５’端的甲基化是造成转录水平基因沉默的主要原因。
核酶
三个碱基对的茎
需要二价阳离子，
产生5‘-OH和 2’,3’-环 磷酸
剪切部位
剪切部位
剪切机制
这类RNA进行自 身催化的反应是只切 不接。 特点：在 Mg 2+ 或其 他二价金属离子存在 下，在特定的位点， 自我剪切，产生5‘OH 和2’，3‘-环磷 酸二酯末端。
核酶自身剪切反应
mRNA剪接反应是 在剪接体（splicesome) 上进行的.
二、在其他领域的应用
防治动、植物 病毒侵害：马铃薯纺锤形块茎类病毒负链 的多价核酶构建，马铃薯卷叶病毒复制酶基因负链的突变 核酶的克隆等
1、核酶抗肝炎病毒的研究
目前人们已进行了核酶抗甲型肝炎病毒（HAV)、乙型肝炎 病毒（ HBV）、丙型肝炎病毒（ HCV）以及HDV作用的研 究。人工设计核酶多为锤头状结构，少部分是采用发夹状核 酶。
2、抗人类免疫缺陷病毒Ⅰ型（HIV- Ⅰ)核酶
1998年，美国加利福尼亚大学Wong-Staal等利用发夹核酶 抑制HIV- Ⅰ基因表达，并率先进入临床Ⅰ期。
三个双螺旋区
13个核苷酸残基保 守序列
剪切反应在右上方 GUX序列的3‘端 自动发生
IVS
5
UCUAAA Pre-rRNA
‘
A
A
5‘
UCU A
GUAA GUAA
pGOH 5‘GAA
5‘
UCUoAH3’
GUAA
5
UCUUAA 3
‘
rRNA
‘
5’GAAA
GOH 3’
19nt L-19IVS
四 3膜 ‘虫
❖3、核酶作用的特点
❖ 化学本质 RNA ❖ 底物 RNA 肽键 ā-葡聚糖分支酶 ❖ 反应特异性(专一性）碱基 ❖ 催化效率 低 ❖ 产物
ERAP1结构与功能研究进展
ERAP1结构与功能研究进展郭爱华;徐沪济【摘要】Endoplasmic reticulum aminopeptidase 1 (ERAP1) is a multifunctional enzyme belonging to the M1 family of aminopeptidases with roles in the regulation of blood pressure, angiogenesis, ectodomain shedding of several cytokine receptors, and processing of antigenic peptides presented to MHC class I molecules. Allelic variants of ERAP1 have been linked to a number of human diseases, including the autoimmune disease ankylosing spondylitis (AS), diabetes, some forms of cervical cancer, and hypertension.% 内质网氨基肽酶1(endoplasmic reticulum aminopeptidase 1,ERAP1)是氨基肽酶 M1家族中的一个多功能的酶,在血压调节、血管发生、细胞因子受体的胞外区脱落,以及对递呈至 I 型主要组织相容性抗原复合物(major histocompatibility complex class I,MHC I)的抗原肽的加工中发挥作用.ERAP1等位基因变异体与多种人类疾病相关,包括自身免疫性强直性脊柱炎(ankylosing spondylitis,AS)、糖尿病、子宫颈癌以及高血压等.【期刊名称】《分子诊断与治疗杂志》【年(卷),期】2013(000)002【总页数】6页(P128-133)【关键词】内质网氨基肽酶 1;I型主要组织相容性抗原复合物;免疫反应;抗原加工【作者】郭爱华;徐沪济【作者单位】第二军医大学长征医院风湿免疫科，上海 200433; 中国航天员科研训练中心航天医学基础与应用国家重点实验室，北京 100094;第二军医大学长征医院风湿免疫科，上海 200433【正文语种】中文MHC I型分子对与之高亲和力结合的肽配基长度有严格要求，典型的肽配基长度为8~10个氨基酸残基，因此，被MHC I型分子递呈的肽必须在装载前进行精细剪切[1]。
补体C3与BPI活性区融合蛋白(CB)的构建与表达
活性 区， 获得 Ｃ ３ 一 Ｂ Ｐ Ｉ 活性 区融合 蛋 白 （ 即Ｃ Ｂ融 合蛋 白） ， 构建 ｃ Ｂ原核表达载体 ｐ Ｅ Ｔ ２ ８ － Ｃ Ｂ ， 在大 肠杆菌 中
＼ ／ ｒ Ｂ Ｐ Ｉ／ ／ Ｈ ｉ ｎ ｄ ｌ ｌ ｌ ＋ Ｘ ｂ ｏ ｌ Ｉ
ｉ 连 接 做 体 、 测 序
｛ ＼ Ｉ Ｃ ３ ￣ ｂ ／ ／
Ｉ 如 ｍ Ｈ Ｉ Ｉ Ｉ
Ｂ ａ ｍ Ｈ ｌ 连接Ｆ 妇 载体
叫
活性位点融合 基因 Ｇ ３ ａ ｂ （ Ｇ ３ ａ ｓ 和Ｇ ３ ｂ ｓ 含有长度 为 １ ８
公 司。
的几乎全部生物活性Ｌ ６ Ｊ 。将 ｃ ３活性位 点基因片段 与
Ｂ Ｐ Ｉ 蛋 白功能区基 因融合 ， 获得重组蛋 白 Ｃ Ｂ， 以期其具 有一定杀菌活性 的 同时 ， 还可 以作为桥 梁分子促 进外 源病原被血细胞、 巨噬细胞等黏附和吞噬。 本实验通过融合 Ｃ ３ 分子补体受体结 合位点与 Ｂ Ｐ Ｉ
进 行 表 达 和蛋 白的 提 取 ， 并初 步验证 Ｃ Ｂ蛋 白活 性 ， 为
其功能和应用奠定基础 。
１ 材 料 和 方 法
１ ． １ 材 料
１ ． １ ． １ 质粒和菌株
大肠杆菌菌 株 Ｄ Ｈ ５ ａ 、 Ｂ Ｌ ２ １ 菌，
分离到的一种阳离子蛋 白， 分子量约 ５ ５ ｋ Ｄ ａ 。大量实验 室及临床前研究表 明， Ｂ Ｐ Ｉ 具有强大的中和脂 多糖 和杀 灭Ｇ 钿 菌 的能力 ， 最近发现 Ｂ Ｐ Ｉ 还具有抑制血管生成 ， 抗真菌如抗荚膜组织包浆菌， 抗原虫 的作用 ［ ５ ｌ ， Ｂ Ｐ Ｉ 蛋
有关国家重要研发计划重要专项
1250
4.5
2
2016YFC1100200
生物材料化学信号、微纳米结构及力学特性对非骨组织再生诱导作用及其机制研究
中国科学院上海硅酸盐研究所
常江
750
4.5
3
2016YFC1100400
生物材料表面/界面及表面改性研究
浙江大学
高长有
1400
4.5
4
2016YFC1100500
具有生物功能的个性化假体快速成型及3D打印关键技术研究与应用
中国人民解放军第三军医大学
唐康来
1315
4.5
5
2016YFC1100600
个性化硬组织重建植入器械的3D打印技术集成和应用研究
上海交通大学
郝永强
1185
4.5
6
2016YFC1100700
可降解医用高分子原材料产业化及其植入器械临床应用关键技术
中国科学院长春应用化学研究所
陈学思
1580
4.5
7
2016YFC1100800
中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所
王常勇
1050
4.5
13
2016YFC1101400
人类器官的构建及工程化技术体系建立
中国人民解放军第四军医大学
金岩
950
4.5
14
2016YFC1101500
脊髓损伤及脑损伤再生修复生物材料产品的研发
烟台正海生物科技股份有限公司
张赛
2000
4.5
15
2016YFC1101600
26
2016YFC1102700
新型牙种植体研发及其工程化技术研究
成都普川生物医用材料股份有限公司
HDV核酶研究近况
HDV核酶研究近况国外医学分子生物学分册1999年第21卷第5朔1一{l}fHDV核酶研究近况于乐成毛青综述顾长海李奇芬审阅__,.—～,_.一第三军医大学西南医院全军传染病中心(重庆,400038)了7摘要HDV核酶为HDV双滚环复制所必需,最小序列约85枝苷酸(n’)左右,呈独特的假结样结掏,其结构和功能的关系已得到深入探索反式HDV核酶可能会成为一种新型有效的抗病毒药物键词HDV;核酶;结构和功能;应用丁衔韵研关键词核酶;结构和功能;应用jI竹田0’】/—一-—一J丁型肝炎病毒(HDV)基因组为单负股环状RNA,通过双滚环机制(doublerollingcirclemechanism)进行复制.该过程必须经过病毒前体RNA的自我催化裂解,即必须经过基因组核酶(genomeribozyme,gRz)和抗基因组核酶(antigenomeribozyme.ag. Rz,即复制中间体)的自裂.这一过程与一些植物致病病毒RNA复制特点相似.HDV复制过程中RNA的延伸,由宿主细胞RNA聚合酶II催化;自裂产物连接成环状,可能由宿主细胞RNA连接酶催化”.1HDV核酶的自裂位点及最小序列1988年,Sharmeen等用B『物延伸法证明ag.Rz的自裂位点在C904～G903之间.不久.Kuo等报道gRz的自裂位点在U688~G689之间.gRz36~100(自裂位点端和3’端分别含36nt和1.0nt)活性较高.后来.Perrotta等通过体外试验发现g. Rzl84和ag.Rzl84(j端分别为u和c)能保持较高自裂活性,其序列分别对应于HDV 基因组第688～772nt和抗基因组第904～820nt,提示HDV核酶的最小序列约85lit左右.g.Rzl一82和ag.Rzl一79虽能充分自*国家自然科学基金资助课题裂,但速率大大减慢.Thill等将g.RzI84的5端延长至5nt,去除3端第jl～68nt,得到g.Rz5—66(g.Rz71)仍能自裂,但同等条件下速率明显下降.2HDV核酶切割反应的机理及产物虽然.HDV核酶的结构与锤头状,发夹状核酶等明显不同,但催化反应发生的机理相似.都是转酯化反应.由自裂位点3端的2’-OH或氧原子对自裂位点处的磷原子实施亲核攻击,产物是23环化磷酸二酯和5一OH.倘缺乏2一OH或自裂位点5端为一脱氧核苷酸,则不能发生自裂.3体外HDV核酶切割反应的条件体外HDV核酶切割反应的条件为:①Mg_等二价金属阳离子为切割反应所必需. 其矶理之一可能是中和核酶RNA结构间的阴性斥力.使易于折叠成活性结构.Ca,Mn可替代Mg,有的研究甚至观察到Ca增加反式切割的效率远高于Mgis,v]. Sr”_,CA,Ba,Co,Pb,Zn对某些诱变株的自裂有较弱的辅助作用②一般在65C范围内随温度升高核酶活性增加.温度过高则因破坏HDV核酶的二级结构而使其丧失活性.⑧有的研究观察到HDV核酶裂国外医学分子生物学分册1999’年第2l卷第j期解底物的速率对数在pH4～6范围内呈线性上升,而另有研究发现某些HDV核酶的切割速率在pH5～9.1范围内并无明显变化,但大多数研究均提示pH7.0～7.5时核酶活性最高.①变性剂:G魁-CⅢb2-:’5ol群cJq/一G’1i:i4HDV核酶的结构模型及其结构域g,Rz和ag.Rz二级结构相似,但与锤头状核酶,发夹状核酶及链孢属Vs核酶不同.迄今主要提出3种模型,即假结样结街(pseudoknorstructure),斧头样结构(ax headstructure),三叶草形结构(cloverleaf structure)等模型.诱变分析,光交联,化学修饰等研究证实假结样结构(附图)最为可能’Ⅲ,可划分为9个结构域仅含lnt足可发生自裂,该nt可为U,C,A,但不能为GE]3].4.2Stem皿Lee等[.将g.Rzl0—66此延长2倍,不妨碍核酶折叠+但能增加核酶对甲酰胺的抵抗性,使活性有所增强+而减少lbp就会明显降低自裂活性此区的碱基配对所形成的双螺旋堆集结构主要起稳定核酶活性的作用,不参与构成活性中心,其序列有较大灵活性4.3Stemnl由3bp构成,5侧与stemI51侧共轴,3侧与stemI相邻.破坏其碱基配对或改变其序列均会导致活性下降+某些序列甚至完全无活性.所以此区结构和序列均很重要.4.4L3.与stemⅡ共同构成一个发夹环结构(hairpin—loopstructure).g.Rz和ag.Rz此区序列基本相同,富含嘧啶,唯g.Rz多1个U27.L3有较高的序列特异性+可能参与构或活性中心其5端,特别是CZllZ4附近区域可能靠近裂解位点的磷原子以发挥催化作用.4.5StemⅣ和L4两者共同构成另一个发夹环结构体外试验证明此区可减至4bp而对活性影响不大.但稳定的stmⅣ结构确实有利于活性提高,尤其是其根部的CG配对起着连接儿/4和J4/2的桥梁作用4.6J1/2连接stem【和stemI,对体外自裂反应意义不大,设计反式核酶时可被切断或删去但ag.Rz此区的8nt较保守,可能与核酶活性调节有关.4.7Jl/4连接stem【与stemⅣ,其中的3个G对核酶活性发挥很重要,若G38/40被A,C,u取代,则核酶活性明显下降.此区的G40/国外医学分子生物学分册l999年第21卷第5期42与位于J4/2区的G74/75的同型配对可使核酶结构扭曲,分别使C75/76靠近切割位点4.8J4/2连接stemN与stemI.对此区中G74/75,C75/76,A77/78,A78/79的碱基修饰显着降低核酶活性,C75/76的改变会导致核酶活性完全丧失光交联研究也显示ag.Rz的C76靠近切割位点.因此C75/76很可能直接参与了催化作用.4.9应用x线衍射技术发现g.RzJ1/~区的G38G39可与L3区的C22,C21形成短双链区P1.1.从而使g.Rz呈复杂的巢式双假结样(nesteddouble pseudoknot)高级结构.多种方法研究显示:L3,J1/4,J4/2可能共同参与构成催化中心.进一步研究尚发现: 若在两类HDV核酶间互换L3和J4/2+则活性均下降;但若只互换Jl/4,则活性均有不同程度升高”5反式HDV核酶的设计及意义核酶的自裂是一种分子内切割反应.称为顺式切割(cis—cleavage),核酶对底物的分子间切割则称为反式切割(trans—cleavage). HDV核酶是迄今发现的唯一可通过病毒自然感染而进入哺乳动物细胞中的核酶.所以研究其反式作用的重大意义在于利用它可能优于其它核酶的抗哺乳动物致病病毒作用. Branch等曾以斧头型结构为基础.从相应cDNA上分别转录出相当于”酶和”底物”的RNA分子,在适当条件下将两者混合,确实出现了”酶对”底物”的反式切割.假结样结构最接近实际结构,以它为基础的反式作用体系可分为3类:①”底物”和”酶”通过stemI的碱基配对结合,”底物”相当于stemI5侧序列;②”底物”和”酶”通过stem口,stemⅣ的碱基配对结合,酶由stemⅡ3侧,J4/2,stem～3侧组成;③”底国外医学分子生物学分册1999年第2l卷第5期物”和”酶通过stemI,stemⅡ,stemⅣ的碱基配对结合,”酶”由steml5侧,stemⅡ,L3,stemI3侧,J1/4及stemIV5侧构成,如Lai等设计的RNA73/RNA37(底物/酶)体系口,1个RNA37分子可切割多个RNA73分子,显示了”酶”的特点.后两类体系固核酶”对底物”序列要求过严,几无应用意义.第一类体系中+底物”与”酶”结合只需7nt,且在一定程度上可改变stemI3侧序列以适应底物序列+因此具有用来切割异源RNA分子的潜在价值.6HDV核酶活性的调节目前对HDV核酶活性的调节有这样几点认识:①基于HDV—RNA分子内约7O 碱基互补的事实,Lazinski等0认为互补序列的某些部分可充当”衰减子(attenuator)”的角色,通过碱基配对,使核酶及时失活②丁型肝炎病毒抗原(HDV Ag)虽非HDV核酶自裂所必需,但确能加快自裂和拼接反应1.Razas等1”发现未感染细胞内存在一种HDV Ag类似物,能影响HDV—RNA复制,并具有和HDV Ag相互作用的潜在能力.③新近Perrotta等通过体外试验发现ag.Rz 的第86～89nt(5,GCCA3)可与J1/z区的第10～13nt(5UGGC3)形成一双螺旋区P2a,对ag.Rz具有Na依赖性调节活性:低浓度Na(3mmol/L以下)时可显着抑制ag.Rz活性,但若先用高浓度Na一(100 mmol/L以上)与ag.Rz适当温育后再加入Mg,则使切割活性明显升高;HDV Ag对HDV桉酶活性的调节可能类似这一机制.应当指出,加强对临床分离株序列变异的研究+可更多了解HDV桉酶在体内的结构和功能变化+获取悻外实验研究所不能获取的重要信息,两者结合起来,对深入了解HDV核酶结构,性质,功能具有重要意义. 参考文献LaiMM.AnnuRevBiochem,1995;64:259 SharmeenLeta1.JVjroI,1988;62?2674 KuoMYPa1.JVirol,1988;62:4439 PerrottaATeta1.Nature,1991{350:434 BeenMDeta1.EurJBiochem,1997;247:741 PuttarajuEMeta1.NucleicAcidsRes一1993: 214253SakamotoTeta1.JBioehemTokyo,1997{l21:11238FauziHela1.NucleicAcidsRes,1997;25: 31249LeeCBeta1.Biochemistry,1996;35:12303 10DuhameIJeta1.NucleicAcidsRes,1996:24: 391111JengKSela1.NucleicAcidsRes,1996;70: 240312PerrottaATela1.NucleicAcldsRes.1996: 24:131413PerrotlaATeta1.Biochemistry,1992~31:16 14BravoCa1.NucleicAcidsRes,1996;24: 1351’15BeenMDeta1.RNA,19g5;1:106l16Ferre—D’AmareARa1.Nature,1998,395: 56717WadkinsTSela1.NucleicAcidsRes,1997; 25:408518BranchADa1.ProcNatIAcadScjUSA, 1991;88:1016319KawakamiJeta1.FEBSIe(t,1996{394:l32 20NishikawaFetEurJBicohem,1996:237: 71221LaLYCa1.Biochemistry,1996:35:12422LazinskDWel,a1.JVirol,l995{69:l】90 23JengKSeta1.JVirol一1996:7O:429524RazasR”a1.Science,1996;274:9025PerrottaATeta1.JMotBioI,1998;279:361 (1998一l1—10收稿)。
一种三螺旋重组人源化iii型胶原蛋白、制备方法及应用
一种三螺旋重组人源化iii型胶原蛋白、制备方法及应用三螺旋重组人源化III型胶原蛋白（recombinant humanizedtype III collagen protein）是一种具有重要生物功能的蛋白质分子。
它在成纤维细胞中广泛存在，是维持细胞外基质稳定性和结构完整性的重要组成部分。
三螺旋重组人源化III型胶原蛋白的制备方法主要分为以下几个步骤：1.基因克隆：首先，通过PCR扩增技术从人体细胞中提取III型胶原蛋白的基因序列。
然后，在合适的质粒载体中插入所得基因序列，使其与表达载体相连。
2.转染和表达：将质粒载体与适当的细胞株进行转染，使其能够表达III型胶原蛋白。
常用的细胞株有CHO细胞、HEK293细胞等。
转染后，通过适当的培养条件和筛选方法，筛选出高效表达III型胶原蛋白的细胞株。
3.蛋白纯化：经过培养和表达后，收集细胞培养基，将其中的细胞残渣和其他杂质去除，得到含有III型胶原蛋白的上清液。
然后，利用离心、膜过滤、柱层析等技术手段对上清液进行纯化，得到纯净的III型胶原蛋白。
4.结构和功能验证：通过质谱、电镜等技术手段对纯化后的III 型胶原蛋白进行结构和功能验证，确保其具有预期的三螺旋结构和生物活性。
三螺旋重组人源化III型胶原蛋白的应用十分广泛。
以下是一些典型的应用领域：1.细胞外基质研究：三螺旋重组人源化III型胶原蛋白可以作为细胞外基质的组分，用于研究细胞与基质之间的相互作用、细胞迁移和侵袭等生物学过程。
2.药物载体：通过功能修饰，将药物结合到三螺旋重组人源化III 型胶原蛋白上，利用其良好的生物相容性和生物降解性，可以作为药物的有效载体，提高药物的稳定性和生物利用度。
3.修复和再生医学：三螺旋重组人源化III型胶原蛋白可以用于组织工程和再生医学研究中。
它可以作为支架材料用于组织修复和再生，促进细胞黏附和增殖，促进组织修复和再生过程。
4.皮肤抗衰老：胶原蛋白在皮肤中起着维持弹性和紧致度的重要作用。
第十二讲义章核酶
核酶的发现：内含子的切除反应发生在含有核苷酸和纯化的26S rRNA前体
而不含有任何蛋白质催化剂的溶液中，可能的解释只能是:内含子切除是由26S rRNA前体自身催化的，而不是蛋白质。
子部分连接起来）
根据所作用的底物不同分为：
自体催化（催化分子内反应） 异体催化（催化分子间反应）
I型内含子:来源rRNA 剪接型核酶
II型内含子:来源MT RNA
剪切型核酶
锤头核酶:来源植物病毒
发夹核酶
自体催化
丁型肝炎病毒（HDV)核酶：来源人类病毒
RNase P：来源tRNA的成熟 异体催化
为原始的催化酶。打破了酶是蛋白质的传统观念。
核酶的功能：
1. 核苷酸转移作用。 2. 水解反应，即磷酸二酯酶作用。 3. 磷酸转移反应，类似磷酸转移酶作用。 4. 脱磷酸作用，即酸性磷酸酶作用。 5. RNA内切反应，即RNA限制性内切酶作用。
三、Ribozyme的种类 根据作用方式分为：
剪切型（把RNA前体的多余部分切除）， 剪接型（把RNA前体的内含子部分切除并把不连续的外显
核酶的证实：将编码26S rRNA前体DNA克隆到细菌中并且在无细胞系统中
转录成26S rRNA前体分子。结果表明这种人工制备的26S rRNA前体分子在没 有任何蛋白质催化剂存在的情况下，切除了前体分子中的内含子。这种现象为 自我剪接(self-splicing)，这是人类第一次发现RNA具有催化化学反应的活性，
研究热点：从催化分子内反应的自我剪切ribozyme设 计出催化分子间反应的ribozyme。
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图X:?Y -
核酶与靶序列 +," 相互作用示意图 （箭头指示切割位点）
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5期
况二胜等： 针对!型及"型前胶原基因的二联核酶的构建及体外活性研究
!
!"!
材料与方法
主要试剂 凝胶纯化试剂盒为 H22I’29J 购 自 +4K 公 司； 质粒提取试剂盒、 L)(9J2?8 公司产品， >+1M、 1-N 酶、
收稿日期： 修回日期： $%%!/!!/$0， $%%$/%$/%"。 " 通讯作者。 12)： "0/$3/"30"00&#； 4/5-6)： 78.-9:; <8= * 2>= * ?9
针对 ! 型及 " 型前胶原基因的二联核酶的构建及体外活性研究
况二胜! 杨复华!" 温淑娟$ 向开军#
! （武汉大学生命科学学院分子病毒学实验室， 武汉 # $ 广州 @#%%3$） （第一军医大学南方医院医学基因技术中心，
&!%&!&）
（中国科技大学生命科学学院， 合肥
$#%%$3）
摘
要
增殖性瘢痕组织中胶原蛋白的合成显著增加从而导致胶原的过度沉积。利用核酶特异地抑制前胶原基
［ ，］ 据 H’ B)2WW6(9 及 L8= 等报道 !$ !# 设计并合成型外显子 $ 区域的引物各 # 条， 分别 为 M" B、 、 和 、 、 ， 与 M" K M" L M# B M# K M# L ! ! （"） 及 （#） 型前胶原基因 4G(9$， 部分互补的用以 构建核酶基因的引物 M " RQM " C、 （表 M # RQM # C 。 !） !"$ 核酶基因的构建 引物 M" RQM" C， M# RQM# C 在其 #X 端有 !#9J 的互补 碱 基。 配 对 延 伸 可 得 到 完 整 的 核 酶 基 因 （0$EI ） 。 MLC 反 应 体 系 为 &% $ 引 物 各 %S! R： :， $ &% 5()QR >+1M，!% Y MLC K=772P & R，&= H22I’29J $ $ 酶， Z$[ 预变性 @%W，Z$[ $%W，@%[ $%W， 3![ $%W， !% 个循环。产物于 $S&\ 琼脂糖凝胶电泳回收纯化后 然后用 1@ 连接酶连接， 以连接 &X端添加磷酸基团， 产物作模板，M" RQM#C 为引物进行 MLC 扩增 （ MLC 反应体系为 &% $ 引物各 %S! R： :，&% 5()QR >+1M， $ $ !% Y MLC K=772P & R，&= 1-N 酶， Z$[ 变性 &%W，0&[ $ 退火 #%W， 。产物于 $S&\ 3![ 延伸 #%W， #% 个循环） 琼脂糖凝胶电泳收获 !$@EI 的 H+B 片段。
因的表达可减少胶原蛋白的合成， 为瘢痕的研究和防治提供了新的思路。为研究用核酶抑制前胶原基因表达的可 能及效果，设计并构建了针对! （ 型及! （ 型前胶原基因的二个单价核酶串联的二联核酶基因真核表达载 ! "） ! #） 体， 并对其体外切割活性进行研究。结果表明该二联核酶的切割效果明显， 均能有效地切割底物， 为进一步研究核 酶对前胶原基因表达的抑制作用以及利用核酶防治瘢痕产生打下基础。 关键词 前胶原基因，二联核酶，体外切割活性 A"!# 文献标识码 B 文章编号 !%%%/#%0! （$%%$） %#/%#$3/%@
（ 及 （#） 型前胶原基因第 8 外显子区靶 !67 ! ! "） 9:; 片段的 $%<"#$ 扩增 取人瘢痕组织抽提总 +,"， 先用引物 !! )、 !" （+," # ) 分别进行逆转录反应 *，引物 *， # . +& # # 总体积 56 /01123 4 *， 768 -69:; 后加逆转录酶 *， # # ， 取其产物 ( 以相应的引物对 （ !! "= #0， #(8-<） *， # 进行半巢式 !%+ 扩 !! %=!! ) 或 !""=!" %=!" )） 增 （ !%+ 反应体系为 #6 # 引物各 6>*： ?，#6 9@A=* # # B,&!， -6 . !%+ )01123 # *， #0 &CD 酶， E58 变性 #6F， # ， 终产物经 ##8 退火 46F， 7-8 延伸 46F， (6 个循环） 5G 琼脂糖凝胶电泳回收纯化。 !6= 核酶基因和靶基因片段的克隆及鉴定 核酶 H," 片段与 I%+(>-J& 、 靶 H," 片段分别 与 I’KLJ& 载体连接。转化子分别以引物对 &7=!" 筛选正向克隆 +、 &7=!! %、 &7=!" % 进行 !%+ 扩增， （&7 启动子下游的 #$J($ 方向插入） 。 !%+ 反应体系 为 #6 # 引物各 6>*： ?，#6 9@A=* B,&!，-6 . !%+ # # )01123 # *，#0 &CD 酶， E(8 变性 #6F，##8 退火 46F， # 7-8 延伸 46F， (6 个循环。 !6> 体外转录反应 按体外转录试剂盒使用说明进行。靶 +," 的 转录放射性标记， 核酶的转录反应不标记。所有的 质粒在转录前经酶切割成线性分子。反应体系为：
(5P
生 表! %&’() ! "#$ 引物序列
物
工
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-P 卷
%*) +),-)./) 01 2345)3+
!! "： #$%%""&%"%%&’%’&"%"’""%’ ($ #$"’"%’’’"%"’%"%&%’%%% ($ !! )： !! %： #$%&&’’&%&%’&%"%"’"&%"%’ ($ !" "：#$%%&’""’"&’&%%&&’"&’&’% ($ !" )：#$%"&%%&%%"’""%&’&’&"’’ ($ !" %：#$’""&&&’%&"&&&%%&&%"’%% ($ !! *：#$""%"%%&&’%%’&&’&%’%"%&’"&’"’&%%’&’"’’"% ($ !! +：#$’"’%%%&’%%’’"&%&’%’&&&%’&%%&%"%’’"%& ($ !" *：#$%%&&’""&&%"%%&&%"&&&%&’"&’"’&’%’&’"’’"% ($ !" +：#$’’%%%&’""’%&’"&’’’’&&&%’&%%&%"%’%"%& ($
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图5 核酶切割产物的 !+V7 变性电泳放射自显影结果 0CD JF=9;JE@9A;J*C@G J:JLMH@H 9I @: Q@=;9 GLDJQJAD 9I =CD =J;AD= $.+H )M =CD EFJL4;@)9OMKD
［-4］ 参照 有 关 文 献 适 当 修 改 进 行。 将 等 量 靶
（各 4 混合并加入缓冲液 （终 +," 与对应的核酶 *） # 浓度 #699@A=* &3:FJQ%A， ， IQP>6，-#99@A=* L?%A5 ） 终体积为 (6 *。分别在 (78 、 458 、 #68 保温 -># < # 后加入 -6 # （ EPG 甲酰胺， * 终止液 #99@A=* KH&"， （(78 ） 下 -699@A=* &3:FJQ%A，IQP>6）。另外在恒温 变换 L?%A5 浓度（-6、 以观察核酶对靶 -#、 5699@A=*） +," 的切割效应。样品在 R#8 变性 #9:;， PG 聚丙 烯酰胺及 79@A=* 尿素平板凝胶电泳分析。凝胶在 O 768 放射自显影 54<， S 光底片采用 T@BCU 产品。