研究生 PCR
中国药科大学现代生化药物复习资料(适用于期末、研究生入学考试)
•现代生化药学复习提要第一章 PCR1 PCR的英文全称：Polymerase chain reaction 聚合酶链式反应2 PCR是发明者：Kary Mullis 美国科学家 1985申请专利。
Perkin-Elmer Cetus公司第一台PCR扩增仪。
3 PCR的基本原理是什么？以拟扩增的DNA分子为模板，以一对分别与模板互补的寡核苷酸片段为引物，在DNA聚合酶的作用下，按照办保留复制到机制沿着模板链延伸直至完成新的DNA合成。
A．混合模板DNA，四种核糖的三磷酸盐和DNA聚合酶，加入过量的2种DNA引物，与模板中需要的序列的起始和结束区域结合。
B．加热反应液至94℃以使模板DNA的双链变成单链（变性）C．冷却至50℃，引物与模板DNA的单链结合（退火）D．升温至72℃，DNA聚合酶催化DNA复制以产生双螺旋DNA（延伸）E．重复步骤2-4至满意为止4 PCR反应的产物中一般会生成几种长度不同的产物？反应结束时他们的含量分别是怎样的？一种是与预期长度的片度，一种是比预期长度长的多的产物。
目的产物以指数级数2n增加；另一种产物以几何级数 2n增加，在总产物中所占的比重很小，可以忽略。
5 一般PCR反应中包括几种基本成份？它们的功能分别是什么？7种：模板DNA、特异性引物、热稳定DNA聚合酶、脱氧核苷三磷酸（dNTP）、二价阳离子、缓冲液及一价阳离子、石蜡油○1模板DNA：是待扩增序列的核酸,不能混有任何蛋白酶、核酸酶、TaqDNA聚合酶抑制剂、结合DNA的蛋白。
○2特异性引物：引物是靶DNA的3’端和5’端特异性结合的寡核苷酸片段，是决定PCR特异性的关键。
引物是决定PCR扩增片断的长度、位置和结果的关键。
引物设计的必要条件：与引物互补的靶DNA序列必须是已知的。
○3热稳定DNA聚合酶：○1聚合作用（5’→3’）、○23’→5’的外切酶活力、○35’→3’的外切酶活力○4脱氧核苷三磷酸（dNTP）：原料。
分子生物学实验报告
分子生物学实验报告重组质粒的pcr验证（目的基因的pcr扩增）姓名:xxx学号：xxx专业：xxx界别：xxx同组者：xxxx一．实验目的（1）自学掌控pcr反应的基本原理和实验技术。
（2）了解引物设计的基本要求。
1.pcr基本原理聚合酶链式反应(polymerasechainreaction)，简称pcr，是一种分子生物学技术，用于在体外快速扩增dna，类似dna的细胞内复制过程:由一对引物介导，通过温度的调节，使双链dna变性为单链dna、单链dna能与引物复性（退火）成为引物-dna单链复合物、以及在dntps存在下dna聚合酶能使引物沿单链模板延伸成为双链dna（引物的延伸）；这种热变性-复性-延伸的过程，就是一个pcr循环；一般通过20-30个循环之后，就可获得大量的要扩增的dna片段。
pcr技术的基本原理类似dna的天然激活过程，其特异性依赖与靶序列两端优势互补的寡核苷酸引物。
pcr由变性--淬火--延展三个基本反应步骤形成：①模板dna的变性：模板dna经加热至90~95℃左右一定时间后，使模板dna双链或经pcr扩增形成的双链dna解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板dna与引物的淬火(复性)：模板dna经冷却变性成单链后，温度降到55℃左右，引物与模板dna单链的优势互补序列接合融合；③引物的延伸：dna模板--引物结合物在taqdna聚合酶的作用下，以dntp为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板dna链互补的复制链。
经过“变性—淬火—延展”三个过程就可以赢得代莱dna分子，而且这种崭新dna分子又可以沦为下次循环的模板。
因此，变性、淬火和延展循环反复25~30次后，即可从少量的模板dna中扩充出来大量的目的产物。
pcr引物设计的目的是为了找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板dna序列，因此，引物的优劣直接关系到pcr的特异性与成功与否。
PCR实验操作常见问题及解决方法
聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction ,PCR)是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。
它能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍,使肉眼能直接观察和判断；可从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的DNA供分析研究和检测鉴定。
PCR技术是生物医学领域中的一项革命性创举和里程碑。
PCR反应的关键环节有：①模板核酸的制备；②引物的质量与特异性；③酶的质量与特异性；④PCR循环条件。
寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。
PCR产物的电泳检测时间，一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚致消失。
Q可能原因：1.模板：①模板中含有杂蛋白质；②模板中含有Taq酶抑制剂；③模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白；④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚；⑤模板核酸变性不彻底。
在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应固定不宜随意更改。
2.引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。
有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增。
3.酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性。
需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭。
4.Mg2 浓度：Mg2 离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。
5.反应体积的改变：通常进行PCR扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul，或100ul，应用多大体积进行PCR扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如20ul 后，再做大体积时，一定要模索条件，否则容易失败。
重复引物PCR技术在超大片段动态突变疾病基因检测中的应用_陈晟
遗传Hereditas (Beijing) 2014年11月, 36(11): 1145―1151 综 述收稿日期: 2014-07-19; 修回日期: 2014-10-14作者简介: 陈晟，硕士研究生，专业方向：神经遗传病。
E-mail: chensheng0039@通讯作者:吴志英，博士，主任医师，研究方向：神经遗传和变性病。
E-mail: zhiyingwu@ DOI: 10.3724/SP.J.1005.2014.1145 网络出版时间: 2014-10-16 11:39:42URL: /kcms/detail/11.1913.R.20141016.1139.003.html重复引物PCR 技术在超大片段动态突变疾病基因检测中的应用陈晟1，吴志英21. 福建医科大学附属第一医院神经内科，福州 350005；2. 复旦大学附属华山医院神经内科，上海 200040摘要: 动态突变疾病是指基因编码区或非编码区发生核苷酸重复序列异常扩增所导致的一类遗传性疾病。
发生于非翻译区的动态突变常常伴有超大片段重复序列，应用普通PCR 法无法对该片段进行扩增，而传统的Southern blot 等技术费时费力，无法应用于临床基因诊断。
在此背景下，重复引物PCR 技术应运而生，并随着应用范围的扩大而逐渐改进，适用于强直性肌营养不良症、Friedreich 共济失调、脊髓小脑性共济失调10型及C9orf72基因突变引起的额颞叶痴呆或肌萎缩侧索硬化等遗传性动态突变疾病的临床基因检测。
文章简要介绍了重复引物PCR 技术的原理，着重阐述了重复引物PCR 技术在相关超大片段动态突变疾病临床基因检测中的应用进展。
关键词: 重复引物PCR 技术；超大片段重复序列；基因诊断；动态突变疾病Advances on repeat-primed PCR assay for the genetic diagnosis of dy-namic mutation diseases with large pathogenic expansionsSheng Chen 1, Zhiying Wu 21. Department of Neurology , First Affiliated Hospital , Fujian Medical University , Fuzhou 350005, China ;2. Department of Neurology , Huashan Hospital , Fudan University , Shanghai 200040, ChinaAbstract: Dynamic mutation diseases are genetic diseases caused by unstable repeat expansions in coding ornoncoding regions. The unstable repeat expansions located in the noncoding region usually accompany large expan-sions which are difficult to amplify using the standard PCR assay. Traditional detection methods, including South-ern blot, are usually time-consuming and labor-wasting. A new method called fluorescent repeat-primed PCR assay was brought into clinical applications. With the development of genetic diagnoses for dynamic mutation diseases, such as myotonic dystrophy, Friedreich’s ataxia, SCA10, and amyotrophic lateral sclerosis or frontotemporal demen-tia caused by C9orf72 mutations, the clinical use of repeat-primed PCR assay has been broadened. Here, we review the principle of repeat-primed PCR assay and its advances on the genetic diagnoses of related dynamic mutation dis-eases with large pathogenic expansions.1146 遗传Hereditas (Beijing) 2014第36卷Keywords:repeat-primed PCR assay;large pathogenic expansions; genetic diagnosis; dynamic mutation disease动态突变疾病是指基因编码区或非编码区发生核苷酸重复序列异常扩增导致的一类遗传性疾病，根据其发生扩增的分子生物学机制不同，大致可分为三类：第一类是异常扩增引起转录过程受阻，如脆性X综合征(Fragile X syndrome, FXS)、Friedreich 共济失调(Friedreich ataxia, FRDA)等；第二类是异常扩增导致病理性RNA毒性蓄积，如强直性肌营养不良症症1型(Myotonic dystrophy 1, DM1)、脊髓小脑性共济失调10型(Spinocerebellar ataxia 10, SCA10)等；以上两类均为非编码区重复序列异常扩增。
PCR实验室社会效益评估
PCR实验室社会效益评估在我国，PCR实验室广泛应用于疾病诊断、法医学鉴定、生态监测等多个领域。
通过实际案例分析，我们可以看到PCR实验室在社会中具有显著的经济效益、公共卫生效益和科研教学效益。
一、经济效益PCR实验室在医学领域发挥着重要作用。
以新冠病毒检测为例，PCR技术在短短几小时内就能准确判断患者是否感染病毒。
疫情期间，我国建立了大量PCR实验室，有效支撑了疫情防控工作的开展。
据数据显示，PCR实验室的建设和运营为我国节省了大量医疗资源和财政支出。
PCR实验室在法医学鉴定中也具有重要意义。
以DNA检测为例，PCR技术可以实现对微量样本的准确分析，为案件侦破提供关键证据。
据统计，我国每年约有10万起案件涉及到PCR实验室的技术支持，平均每起案件节省侦查时间约20天。
二、公共卫生效益PCR实验室在公共卫生领域的作用不容忽视。
以水质监测为例，PCR技术可以快速检测出水中的微生物含量，为政府部门制定水资源保护政策提供科学依据。
在食品安全领域，PCR实验室可以及时发现食品中的病原体，保障人民群众的饮食安全。
以我国某地为例，当地政府投资建设了PCR实验室，对饮用水、食品等进行定期检测。
结果显示，PCR实验室的建设使得当地食品安全事故发生率降低了30%，水质合格率提高了20%。
这些数据充分展示了PCR实验室在公共卫生领域的显著效益。
三、科研教学效益PCR实验室是科研教学的重要平台。
在我国，许多高校和科研机构都建立了PCR实验室，为研究人员提供高效、准确的实验手段。
以基因编辑技术研究为例，PCR实验室可以实现对目标基因的快速扩增和检测，为基因治疗、生物制药等领域的研究提供有力支持。
PCR实验室还承担着培养人才的任务。
在我国，许多PCR实验室对本科生、研究生和博士生开放，让学生在实际操作中掌握PCR技术，提高实践能力。
据调查，经过PCR实验室培训的学生，在就业市场上具有更高的竞争力。
PCR实验室在我国社会中具有显著的经济效益、公共卫生效益和科研教学效益。
研究生分子生物学实验讲解
⑦取组织样品时要快速
RNA完整性的鉴定
RNA样品电泳后，可见28S、 18S及5S小分子RNA条带，则 说明完整性好。若有降解可能 是操作不当或污染了RNase。 28S和18S RNA比值约为2：1, 表明RNA无降解。如比值逆转， 则表明RNA降解。
(2) 如何保证RNA的纯度？
2、加250ul裂解液，颠倒4次混匀；加10ul碱性蛋 白酶溶液，颠倒4次混匀；室温放5分钟。 3、加350ul平衡液，颠倒4次混匀；10000rpm离 心10分钟。 4、上层清液转移到离心柱上。10000rpm离心1分 钟，弃去收集管中溶液。
5、加入750ul清洗液（已加乙醇），10000rpm 离心1分钟，弃去收集管中溶液。
RT：Reverse transcription
PCR的基本过程 三个基本步骤
①变性(denaturation):双链DNA模板解开成单链 94–96℃，速度快，1min
②退火(annealing)：两个寡核苷酸引物结合到单链模板 退火温度依赖Tm(Tm-5) Tm = 4(G+C) + 2(A+T) ℃
1. The electric charge effect（电荷效应） PH（8.3） > PI（4.0－4.5）, DNA -
2. The sieving effect （分子筛效应） a The molecular weight of DNA b The structure of DNA
共价闭环 DNA ＞ 直线 DNA ＞ 开环的双连 DNA
3. The concentration of agarose gel （琼脂糖凝胶的浓度）
EB（溴化乙锭）
PCR_管内温度的精准预测及快速控温
引用格式：张月业, 姚佳, 张芷齐, 等. PCR 管内温度的精准预测及快速控温[J]. 中国测试，2023, 49(11): 150-156. ZHANG Yueye,YAO Jia, ZHANG Zhiqi, et al. Accurate estimation and rapid temperature control methods of PCR temperature in tube[J]. China Measurement & Test, 2023, 49(11): 150-156. DOI: 10.11857/j.issn.1674-5124.2023020082PCR 管内温度的精准预测及快速控温张月业1,2， 姚 佳2， 张芷齐2， 李金泽2， 周连群1,2(1. 长春理工大学机电工程学院，吉林 长春 130022; 2. 中国科学院苏州生物医学工程技术研究所 中国科学院生物医学检验技术重点实验室，江苏 苏州 215163)摘 要: 聚合酶链式反应（PCR ）分析仪以样品块（Block ）温度为控制对象实现样本温度控制，易产生热滞效应。
为减小管内迟滞，缩短样本的变温时间，该研究在利用有限元分析技术建立单孔样本热传导模型的基础上，构建一种融合初始温度-目标温度-等效热阻的三参数模型预测管内实际温度，实现PCR 过程管内温度实时跟踪。
根据模型精准预测管内温度，对样品块进行精准快速控温，大幅缩短升降温时间，降低了管内样品的传热迟滞。
实验结果表明，与管内实际温度相比，管内样品温度预测方法误差低于±1.5 ℃；样品块温度控制目标曲线优化后，管内温度迟滞时间缩短了27%以上。
该文提出精准控制温度过冲的优化方法在保证管内样本温度的基础上显著缩短了PCR 热循环整体时间，有利于实现更快速、更精准的核酸定量检测结果。
关键词: 聚合酶链式反应; 有限元分析; 温度预测; 温度优化中图分类号: R318.6; TB9文献标志码: A文章编号: 1674–5124(2023)11–0150–07Accurate estimation and rapid temperature control methods ofPCR temperature in tubeZHANG Yueye 1,2, YAO Jia 2, ZHANG Zhiqi 2, LI Jinze 2, ZHOU Lianqun 1,2(1. School of Mechanical and Electrical Engineering, Changchun University of Science and Technology, Changchun 130022, China; 2. Key Laboratory of Bio-medical Diagnosis, Suzhou Institude of Biomedical Engineering andTechnology, Chinese Academy of Sciences, Suzhou 215163, China)Abstract : The polymerase chain reaction (PCR) analyzer takes the sample block temperature as the control object to control the sample temperature, resulting in thermal hysteresis. To reduce the thermal hysteresis and shorten the temperature change time of sample, this paper is based on the establishment of single-hole sample thermal conduction model by the finite element analysis technique, a three-parameter model that fused the initial temperature-target temperature-equivalent thermal resistance is constructed to predicted the sample temperature in tube and achieve real-time temperature tracking in the PCR process. According to the predicted temperature in the tube, the temperature of the sample block is accurately and quickly controlled, which greatly shorten the heating and cooling time and reduce the heat transfer hysteresis of the sample in the tube. The收稿日期: 2023-02-11；收到修改稿日期: 2023-04-07基金项目: 国家重点研发计划资助项目（2022YFC2409300）；江苏省社会发展重点研究开发项目（BE2020768）；中国科学院生物医学检验技术重点实验室开放课题资助项目(A2023F001)作者简介: 张月业（1997-），男，河南台前县人，硕士研究生，专业方向为PCR 温度控制。
pcr教程研究生用
（三）试剂的要求 1.引物：人工合成的单链DNA。
A：长度15-30bp，最好20-24 bp。 B：内部的互补序列。 C：引物间的互补序列。 D：序列的随机。 E：识别序列的单拷贝。 F：浓度：02-1μmol/L。 G：应纯化低温保存。
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2.DNA模板 A：量10-50ng左右。 B：纯，无污染。
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步骤 1.PCR扩增 遗传标记特异性由特异性引物决定。 2.电泳分离PCR产物
A：凝胶：聚丙烯酰氨凝胶（polyacrylamide gel,PAG），
成分：丙烯酰氨与甲叉丙烯酰氨 凝胶浓度（T）：6-8%，与分析的片段大小有关。
交联度（C）：3%，甲叉/丙烯酰氨与甲叉 B:载样缓冲液：甘油（蔗糖）密度重力，防扩散。
2.去垢剂与蛋白酶：SDS（十二烷基磺酸钠）增加膜 通透性；促进DNA与蛋白质分解；促使核酸酶与蛋 白质变性。
蛋白酶K酶解组蛋白。
3.有机溶剂：酚：变性沉淀蛋白质，组蛋白、蛋白 酶等。
氯仿：变性沉淀蛋白质，除酚，水相分离。
异戊醇：除酚，除泡沫。
4.乙醇与盐类：DNA不溶于乙醇与盐类。
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（四）基本步骤 1.样品处理：分离细胞，低渗盐水（0.2%）或细胞悬浮液。
3.DNA聚合酶 A：根据具体实验要求选择。60-
150/S,Taq DNA酶5ˊ-3ˊ外切酶活性。 1/300-18000错配。
B：注意外切酶活性，5ˊ-3ˊ或3ˊ-5ˊ。 C：活性最适温度70-75℃，半衰期一般 95℃40 min ；92℃130 min D：镁离子依赖。 E：低温保存。
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（四）常见问题与处理
泳速指示剂：溴酚蓝（5%，65bp） 二甲苯青（5%，260bp）
C：电压：100-200V
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引物的复性温度
通过以下公式帮助选择合适的温度：
• Tm（解链温度）＝4(G+C)+2(A+T) • 复性温度=Tm值－（5～10℃）
– 在Tm值允许范围内，选择较高的复性温度可 大大减少引物和模板间的非特异性结合，提 高PCR反应的特异性
• 复性时间一般为30～60s，足以使引物与 模板之间完全结合
MgCl2等一些重要成分，这样使得引物在较高温
度下与模板退火，提高了反应的严谨性，使扩增
更特异；
⑧ 采用二对引物即外引物和内引物进行扩增来提高 扩增的特异性。
PCR技术的应用举例
1. RT-PCR用于mRNA定量
RT-PCR（reverse transcription-PCR）
原理：先在逆转录酶的作用下、以mRNA为模板合
目前有两种 Taq DNA 聚合酶供应
– 天然酶：从水生嗜热杆菌中提纯
– 基因工程酶：大肠菌合成
一个典型的 PCR反应约需酶量1- 2.5U/100 ul体系 浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成 产物量减少
Taq 酶的保真性不高 • 5’→3’聚合酶活性和5’→3’外切酶活性，
– 主要取决于模板DNA的浓度
• 循环次数：25～35次
• 循环次数越多，非特异性产物的量亦随之 增多
如何提高PCR中的DNA聚合酶的保真性？
① 在PCR反应体系中，除使用Taq DNA聚合酶，掺 入少量的具有3′→5′外切酶活性的耐热DNA聚合 酶，如Pfu，Vent，Pwo等，错配率可降为原来的 1/10； ② Mg2+浓度尽可能低，但不影响DNA合成； ③ 减少高温反应时间，这样DNA热损伤将减少； ④ 减少循环数。
—特别避免 3’端的互补，否则会形成引物二聚
体，产生非特异性的扩增条带
⑤引物 3’端的碱基要求严格配对（不能做任何 修饰）
— 特别是最末及倒数第二个碱基，以避免因末端
碱基不配对而导致PCR失败
⑥引物5′端可修饰 — 引物5′端限定着PCR产物的长度，但对扩增特
异性影响不大；引物5′端碱基可不与模板DNA 互补而呈游离状态；引物5′端最多可加10个碱 基而对PCR反应无影响
— 特定条件下可扩增长至10kb的片段
③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜
— G+C太少扩增效果不佳，G+C 过多易出现非 特异条带
— ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或 嘧啶核苷酸的成串排列，尤其3′端不应超过3 个连续 的G或C，因为这样会使引物在G+C富集区 引发错 误延伸
④避免引物内部出现二级结构和引物间互补
待扩增片段
高温变性
低温退火
中温延伸
PCR每一步的转换通过温度的改变控制。 DNA模板解链（变性）、引物与模板结合 （退火）、DNA聚合酶催化新生DNA的合 成（延伸）三个步骤构成PCR反应的一个 循环。 此循环反复进行，可使目的DNA得以迅速 扩增。
理论扩增率： 2n 递 增（n为循环次数 ）， 25～30循环，目标DNA可增加109倍。 实际扩增率：(１＋Ｘ)n，X为PCR的实际扩 增率，平均约为75%。
高或偏低），就会引起错配
– 高浓度的dNTP可与Mg2+结合，使游离的
Mg2+浓度下降，影响DNA聚合酶的活性
4、模板DNA
模板DNA的来源： —微生物中提取DNA —从细胞中提取DNA：血细胞、绒毛、尿样、毛
发、精斑、口腔上皮细胞
—固定和包埋的组织标本：脱蜡、蛋白酶K消化
模板DNA的浓度： 0.1～2ug/100ul体系
由于引物和底物的消耗，酶活力的下降等因 素，扩增产物的增加，逐渐由指数形式变为 线性形式，所以实际上进行30个循环后，扩 增倍数一般可达106～107。 以上“变性、退火、延伸”三部曲为PCR 一轮循环。
PCR扩增曲线
PCR 反应体系与流程
反应体系 模板（DNA或RNA） 引物 Taq DNA聚合酶 10×PCR缓冲液 1.5～4 mM Mg2+ 0.2 mM dNTP 反应流程
—PCR产量随模板DNA浓度的增加而显著升高 —模板DNA浓度过高导致非特异性产物增加
5、Mg2+浓度
• Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著 的影响 • 在一般的 PCR反应中，各种dNTP浓度为 200umol/L时，Mg2+浓度为1.5～2.0 mmol/L为宜 • Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现 非特异扩增， 浓度过低会降低 Taq DNA 聚合酶的活性，使反应产物减少
① 变性温度与时间： • 一般93℃～94℃，1min足以使模板变性
– 若低于93℃则需延长时间 – 但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有 影响。
② 退火(复性)温度与时间： • 退火温度是影响PCR特异性的重要因素 • 退火温度与时间，取决于引物的长度、 碱基组成及其浓度，还有靶基因序列的 长度 • 对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引 物，55℃作为选择最适退火温度的起点 较为理想
医学分子生物学
聚合酶链反应
福建医科大学分子医学研究中心
PCR的用途
体外扩增特异DNA片段的技术，能快速、特
异地扩增目的DNA片段。
能通过试管内的数小时反应将特定的DNA 片段扩增数百万倍。 迅速获取大量的单一核酸片段，为分子生 物学研究提供了强大的工具。
发展历程
1953年，Watson和Crick提出DNA双螺旋 结构及半保留复制模型。 1958年，Meselson和Stahl用实验证实DNA 半保留复制模型。 70年代以来，人们采用两种思路去尝试建 立基因的无性繁殖体系，一是基因克隆技 术，二是体外扩增技术。
③ 延伸温度与时间： • Taq DNA聚合酶的生物学活性： 70～80℃ 150核苷酸/S/酶分子 70℃ 60核苷酸/S/酶分子 55℃ 24核苷酸/S/酶分子 高于90℃时，DNA合成几乎不能进行
③ 延伸温度与时间：
• 延伸温度：一般选择在70～75℃之间
– 常用温度为72℃ – 过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。
1988年Saiki开始将耐热性Taq DNA聚合酶 应用于PCR，整个反应只加一次酶即可，扩 增特异性和效率都明显改善，操作大为简化。
1989年被誉为“分子年”，列PCR为十余项 发明之首。 1993年，Mullis荣获诺贝尔化学奖。
PCR的基本原理
试管中进行的DNA复制反应，依据 ① DNA半保留复制的机理； ② 体外DNA分子于不同温度下可变性和复性 的性质； 通过人为控制体外合成系统的温度，使 ① 双链DNA变成单链， ② 单链DNA与人工合成的引物退火， ③ DNA聚合酶使引物沿着单链模板延伸为双 链DNA。
/primer3/
在这里输入基因序列
点击这里，按默认条件搜索引物 产物必须包括„„碱基 产物不能包括„„碱基
产物大小 其他条件 点击这里，按上述设置条件搜索引物
（3）用UCSC硅片PCR验证引物
/
2、酶及其浓度
① 查找基因序列 ② 用primer3软件设计引物； ③ 在UCSC Genome Browser上验证（如果 失败则重新设计）
（1）查找基因序列
/
输入基因名称或登录号 如 Homo sapiens GAPDH
选择“Gene”
（2）用primer3查找引物
1976年，台籍科学家钱嘉韵（Alice Chien） 从黄石国家公园的嗜热菌Thermus aquaticus 中分离出热稳定的Taq DNA聚合酶。
1985年，美国Cetus公司人类遗传研究室的 Mullis发明聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction，PCR），Saiki等首次应用PCR法 成功地扩增了人-珠蛋白的DNA，并应用于 镰刀状红细胞贫血的产前诊断。
逆转录反应的引物
1. 随机引物 约30％论文采用，缺点：rRNA的干扰 2. Oligo(dT)引物 约40％论文采用，缺点：mRNA 5’端的合成 另有10％论文同时采用以上两种引物 3. 基因特异性引物（GSP）
约20％论文采用，缺点：cDNA的通用性，低丰 度mRNA的逆转录
半定量RT-PCR
• 延伸反应时间：根据待扩增片段长度而定
– 1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min（足够） – 3～4kb的靶序列需3～4min – 扩增10kb需延伸至15min
• 延伸时间过长会导致非特异性扩增 • 对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些
2、循环次数 • 循环次数
– 决定PCR扩增程度
• 循环次数
引物设计的原则
基本原则是最大限度地提高扩增效率和特
异性，同时尽可能抑制非特异性扩增。
①引物长度： 15-30bp，常用20bp左右
— 引物的有效长度不能大于 38 bp，否则最适 延伸温度会超过TaqDNA聚合酶的最适温度 （74℃），不能保证PCR扩增产物的特异性
②引物扩增跨度：以500bp为宜
成 互 补 的 cDNA （ complementary DNA ） ， 再 以
cDNA为模板进行PCR反应。
是一种快速、简便、敏感性极高的检测mRNA表达
的方法。
常用的两种逆转录酶 AMV（avian myeloblastosis virus）：
酶活性最适温度42℃
MMLV（Moloney murine leukemia virus）： 酶活性最适温度37℃
3’
5’
5’
3’
限制性内切酶的识别序列
启动子序列 定点突变 探针标记
⑦引物的特异性：
— 引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同
源性
⑧引物量：
— 每条引物的浓度0.1
~ 0.5μM，以最低引物量产 生所需要的结果为好