western内参GAPDH
Western Blot技术详细操作步骤
Western Blot技术详细步骤蛋白质印记（Western Blot）是一种常用的生物技术，用于检测特定蛋白质在细胞提取物中的存在。
Western Blot基本步骤如下：1. 准备样品和设备：收集细胞或组织样品，然后使用适当的细胞裂解缓冲液将细胞破碎。
前处理样本并测定蛋白质浓度。
准备凝胶电泳设备，包括聚丙烯酰胺凝胶和Tris-glycine SDS运行缓冲液。
2. 凝胶电泳：将处理好的样品与样品缓冲液混合并加热，然后将其加载到凝胶孔中。
接着将预染蛋白质分子量标记也加载至凝胶中。
开始分子量依赖的电泳，使蛋白质在凝胶中分离。
3. 转印：将蛋白质从凝胶转移到结构更加稳定的膜载体，如聚偏氟乙烯 （PVDF）或者硝酸纤维素膜。
使用电转印或半干转印设备进行转移。
4. 封闭：为防止非特异性结合，使用5%无脂奶粉或BSA溶于TBST （Tris-缓冲的盐水加Tween 20）在膜上进行封闭。
一般封闭时间约为1小时，根据实验需求可调整。
5. 第一抗体孵育：将特异性的一抗稀释 （通常为多克隆或单克隆抗体），然后在封闭液中孵育膜。
根据抗体浓度与孵育时间进行相应优化。
6. 清洗：使用TBST清洗膜，以去除未结合的一抗。
通常需要清洗3次，每次5-10分钟不等，避免一抗非特异性结合。
7. 第二抗体孵育：将标记有荧光或酶的二抗稀释后，再次孵育膜。
封闭液中的二抗通常是与一抗长在不同宿主动物中的特异性抗体。
孵育时间需要优化。
8. 清洗：再次清洗膜，以去除未结合的二抗。
重复步骤6的清洗方法。
9. 检测：将膜放入检测设备中，如化学发光仪、荧光扫描仪等。
等待信号产生并记录结果。
测定蛋白质相对表达量的强度并进行定量分析。
10.数据分析：使用图像处理软件进行定量分析，如ImageJ等软件，并进行归一化处理，一般以内参蛋白（如β-actin, GAPDH等）数据为基准。
以上就是蛋白印记的基本操作步骤，具体细节及操作条件可能因实验室环境和试剂不同而有所差异。
核蛋白内参
核蛋白内参我们知道，内参蛋白是指由管家基因（house keeping gene）编码表达的一类蛋白，它们在各组织和细胞中的表达相对恒定，在实验中检测蛋白的表达水平变化时常用它们来做参照物。
这些内参蛋白常应用于 Western Blot 中，Western Blot 不仅能证明样品中是否含有某种蛋白，还能比较不同条件、不同组织和细胞中目的蛋白的相对含量，从而衡量蛋白的表达水平。
内参蛋白作为一种参照物，在其中的作用为确定样本使用量的一致性，以及校正实验过程中可能出现的操作误差，从而进一步保证实验结果的准确性。
那么对于不同的蛋白，内参蛋白该如何选择呢？前两节介绍了几种常见内参蛋白的选择和应用。
本节将系统介绍不同内参蛋白的选择以及云克隆公司现有的内参蛋白抗体。
对于内参蛋白的选择首先是考虑分子量。
一般情况下，内参蛋白和检测的目的蛋白最好相差在 5kDa 以上。
如分子量为45kDa 的检测蛋白，我们可以选择 Tubulin Beta（54kDa），Lamin B1（66kDa）等，而不选择 ACTa2（42kDa）或者 beta-actin（45kDa）。
其次对于不同的组织，应选择不同的内参。
如肌动蛋白是一种细胞骨架蛋白，有六种不同的亚型，包括： alpha-skeletal muscle actin、alpha-cardiac muscle actin、alpha-smooth muscle actin、gamma-smooth muscle actin、beta-actin (β-non-muscle) 和 gamma-non-muscle actin。
其中常用作Western Blot 内参的 beta-actin 在肌肉和脂肪组织中分布较少，那么若样本是心肌或脂肪组织来源的，就可以考虑分别用 alpha-cardiac muscle actin (ACTC1) 和 GAPDH 作为内参蛋白。
最后，提取蛋白的部位不同，选择的内参蛋白也不同。
westernblot内参选择
westernblot内参选择编辑整理：尊敬的读者朋友们：这里是精品文档编辑中心，本文档内容是由我和我的同事精心编辑整理后发布的，发布之前我们对文中内容进行仔细校对，但是难免会有疏漏的地方，但是任然希望（westernblot内参选择）的内容能够给您的工作和学习带来便利。
同时也真诚的希望收到您的建议和反馈，这将是我们进步的源泉，前进的动力。
本文可编辑可修改，如果觉得对您有帮助请收藏以便随时查阅，最后祝您生活愉快业绩进步，以下为westernblot内参选择的全部内容。
内参抗体种类很多,比如β—actin、β-tubunlin、GAPDH、Lamin B等，那么针对自己的实验，我们该如何选择呢?下面简单介绍下选择内参抗体应遵循的原则：一.样本种属来源：首先要考虑的就是实验样本来源于什么物种。
1、哺乳动物的组织或者细胞样本，通常选择β-actin、β—tubulin、GAPDH、Lamin B、Histone H3、Na,K atp ase等。
2、植物来源实验样本，则可以选择plant actin、Rubisco等。
3、其他来源样本研究较少，所以就应该参照文献报导，选择合适的蛋白作为内参.二。
目的蛋白分子量：选择内参抗体时,应该考虑目的蛋白分子量的大小.通常应该保证目的蛋白与内参蛋白分子量相差5KD以上。
比如目的蛋白分子量为45KD，此时不适宜选择β—actin 作为内参，可以考虑选择GAPDH或者β—tubulin作为内参.三.目的蛋白表达部位：就一般的蛋白检测来说,β—actin、β—Tubulin抗体等就可以了,而针对于核蛋白的定量，特别是样本蛋白就是核蛋白时,选择恰当的核蛋白内参则更能体现内部参照的价值.常用的核内参抗体有Lamin A、Lamin B、Histone H3,除此之外,其它常见的核蛋白内参还有PCNA、K70、K80等，在一些文献报道中，Erk2、TATA binding protein（TBP）以及c-Jun、c—Fos等都有使用.而对于膜蛋白检测，常用的内参抗体为Na，K ATPase.对于线粒体蛋白的检测，常用VDAC1和COX IV作为内参抗体.以上几条原则只是针对通常情况，但是需要注意的问题是—-内参的选择需要考虑实际的试验环境,比如某些细胞中，由于组织缺氧、糖尿病等因素会导致GAPDH的表达增高，不适合做内参。
qPCR 内参基因选择
7.Haas M J, Plazarte M, Chamseddin A, et al. Inhibition of hepatic apolipoprotein AI gene expression by histamine[J]. European journal of pharmacology, 2018, 823: 49-57.
乳腺癌转BPI基因研究中，qPCR选择了18S rRNA作内参，而Western blot选择了GAPDH为 内参
➢内参基因使用示例 文献3
材料： 1. 人结肠癌组织 2. 人正常结肠粘膜组织 3. EGFR敲除和野生小鼠
小鼠结肠癌表皮生长因子下调miRNA的研究中，qPCR和weatern都选择β-actin作为内参 基因
5. Xu H, Bionaz M, Sloboda D M, et al. The dilution effect and the importance of selecting the right internal control genes for RT-qPCR: a paradigmatic approach in fetal sheep[J]. Bmc Research Notes, 2015, 8(1):1-15.
1rtpcr和qpcr实验内参基因选择内参基因概念和作用内参基因的选择参考示例目录加入标题入标题加入标题内参即为内部参照内参基因则是在检测目的基因从dna到mrna表达过程中可用来当作参照的基因
免疫试验必备 内参抗体
品名 货号 价格 宿主
应用
His, HRP Labeled
CB101001 ￥3000/100ug
Rabbit
WB 1:1000 IHC 1:200 IP 1:200
北京西美杰科技有限公司 上海 电话：021-63599871 传真：021-63599873 Email：shanghai@
货号 25-01-01 24-01-01 25-00-01 24-00-02 24-00-01
品名 HisDetector Nickel-AP HisDetector Nickel-HRP HisDetector Western Blot Kit, AP Colorimetric HisDetector Western Blot Kit, HRP Chemiluminescent HisDetector Western Blot Kit, HRP Colorimetric
检测物种 Human, Mouse, Rat
品名 货号 价格 宿主
Rubisco Large Subunit AS03 037 ￥4770/100ug Rabbit
应用
WB 1:5000-1:10000 IF 1: 250
检测物种 plant and algal
北京西美杰科技有限公司 上海 电话：021-63599871 传真：021-63599873 Email：shanghai@
品名 货号 价格 宿主
β-actin CB100996 ￥1500/100ug Rabbit
应用
WB 1:1000 IP 5ug/mg lysate
检测物种 Human, Mouse
品名 货号 价格
β-actin 60008-1-Ig ￥1548/150ul
Western blot内参蛋白的选用方法及步骤
Western blot内参蛋白的选用方法及步骤一、Western Blot实验为什么要用内参?Western Blot实验结果进行内参校正已成为一种惯例。
目的蛋白表达量的相对多少，前提条件是等量的组织细胞蛋白上样，才有比较的基础，特别是表达量不高时，上样量的的差别就很有可能影响结果的分析。
因此，在Western Blot试验中，进行内参的检测，有以下两点作用：1、校正蛋白质定量、上样过程中存在的误差，实验结果的准确性；2、使用内参可以作为空白对照，检测蛋白转膜情况是否、整个Western Blot显色发光体系是否正常。
二、你的内参选对了吗？作为内参的蛋白要符合的标准，可从以下几方面入手：1、先要考虑的就是实验样本来源于什么物种。
样本来源选择内参哺乳动物组织或细胞β-actin、β-tubulin、GAPDH、Lamin B、Histone H3、Na,K atpase等植物来源plant actin、Rubisco其他来源样本研究较少应参照文献报导，选择合适的蛋白作为内参。
2、内参的检测带与那些目标蛋白的检测带在分子量上有所不同；选择内参抗体时，应该考虑目的蛋白分子量的大小。
通常应该目的蛋白与内参蛋白分子量相差5KD以上。
比如目的蛋白分子量为45KD，此时不适宜选择β-actin作为内参，可以考虑选择GAPDH或者β-tubulin作为内参。
针对不同样品制备常用的内参以及它们的分子量3、要考虑目的蛋白表达部位就一般的蛋白检测来说，β-actin、β-Tubulin抗体等就可以了，而针对于核蛋白的定量，特别是样本蛋白就是核蛋白时，选择恰当的核蛋白内参则更能体现内部参照的价值。
常用的核内参抗体有Lamin A、Lamin B、Histone H3，除此之外，其它常见的核蛋白内参还有PCNA、K70、K80等，在一些文献报道中，Erk2、TATA binding protein(TBP)以及c-Jun、c-Fos等都有使用。
蛋白内参
GAPDH（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase）和细胞骨架蛋白beta-actin或beta-tubulin。
GAPDH分子量为146KD，beta-actin分子量为42KD,beta-tubulin分子量可能为100KDactin即肌动蛋白，是细胞的一种重要骨架蛋白。
actin大致可分为六种，其中四种是不同肌肉组织特异性的，包括alpha-skeletal muscle actin、alpha-cardiac muscle actin、alpha-smooth muscle actin和gamma-smooth muscle actin，其余两种广泛分布于各种组织中，包括beta-actin(β-non-muscle)和gamma-non-muscle actin。
这些不同的亚型组织分布是不一样的，在肌肉组织中的beta-actin分布就很少，心肌主要是alpha-cardiac muscle actin。
因此不同的组织本来就应该选择不同的内参，不能一概而论的。
beta-actin作为内参是得到了公认的，这是针对大多数组织和细胞来说的，它广泛分布于细胞浆内，表达量非常丰富。
尽管最近有一些文章已经开始质疑beta-actin作为内参的有效性（好像是对于上样量>20ug的蛋白区分能力下降，记不清楚了），但是发文章应该还是没有问题的。
至于其他的内参也是可以考虑用的，GAPDH（甘油醛-3-磷酸脱氢酶）是参与糖酵解的一种关键酶，而tubulin和actin类似，是细胞骨架的组成部分，但是不是肌肉的主要成分，应该是一个代替品。
细胞总蛋白的Western Blot 的内参蛋白一般用ACTIN, TUBLIN等细胞内较稳定表达的蛋白。
但是核蛋白的Western Blot 内参有LAMIN A, LAMIN B等；膜蛋白的Western Blot一般用α-tubulin或GAPDH为内参。
内参蛋白选择
生命活动离不开蛋白质，作为生命活动的承担者，蛋白质一直都是主要的研究对象。
蛋白免疫印迹（Western Blot）是对目的蛋白进行检测、分析以及定量的一种技术。
也是检测蛋白表达的最常用的方法。
对于WB实验中，如果想结果不被质疑，内参对照是必不可少的。
内参是指由细胞中管家基因编码的蛋白，其在各组织细胞中的表达相对稳定，因此在测定目的蛋白的相对水平时常用它做对照物。
内参的种类很多，其中最常用的三大金刚是β-actin（肌动蛋白）、β-tubulin （微管蛋白）、GAPDH（甘油醛-3-磷酸脱氢酶）。
内参的作用：
校正作用，在蛋白定量及上样过程中不可避免的存在误差，在内参参与条件下以保证实验数据的准确性。
作为空白对照，检测蛋白转膜是否完整及发光显色等过程是否正常。
内参的选择因素:
1) 样本种属: 2) 目的蛋白的表达定位: 3) 目的蛋白的分子量: 4) 组织特异性: 5) 特殊的实验条件: 生命活动离不开蛋白质,作为生命活动的承担者。
目的蛋白 内参 整膜
目的蛋白内参整膜
目的蛋白、内参和整膜在实验中分别扮演不同的角色。
目的蛋白是实验中想要研究或追踪的特定蛋白质。
通过使用WB（Western Blot）等方法，可以对目的蛋白进行半定量分析，判断不同样品中目的蛋白表达含量的多少。
这取决于内参的标定。
内参即是内部参照，通常是在被检样本中高表达且表达水平相对稳定的蛋白。
在WB实验中，内参抗体是重要的参考，它帮助确定目的蛋白表达量的相对多少。
选择合适的内参在WB实验中是关键的因素。
常用的内参包括GAPDH、Tubulin 和Actin等，它们在各组织细胞中的表达相对稳定，常被用作对照物。
整膜是一种实验技术，可以用来提高膜的机械强度和耐用性，以防止在实验过程中膜发生变形或破裂。
通过整膜技术，可以延长膜的使用寿命并提高实验的可靠性。
以上信息仅供参考，可以查阅与目的蛋白、内参和整膜相关的专业文献或咨询专业人士，获取更全面准确的信息。
大鼠gapdh内参序列
大鼠gapdh内参序列
我可以为你提供大鼠甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）内参基因的部分序列，但由于序列长度的原因，我无法在这里提供完整的序列。
如果你需要完整的大鼠 GAPDH 内参序列，我建议你参考以下资源：
1. 基因数据库：你可以访问公共的基因数据库，如 NCBI（National Center for Biotechnology Information）或 Ensembl 等，在这些数据库中搜索并下载大鼠 GAPDH 基因的完整序列。
2. 相关研究论文：许多研究论文会在其方法部分提供所使用的内参基因序列。
你可以查找与大鼠 GAPDH 相关的研究论文，并查找其中是否提供了该基因的完整序列。
3. 商业试剂盒供应商：一些商业试剂盒供应商提供用于实时荧光定量 PCR（qPCR）分析的内参基因产品，他们可能会在产品说明书或技术资料中提供大鼠 GAPDH 内参基因的完整序列。
通过以上途径，你应该能够获取到所需的大鼠 GAPDH 内参序列。
请注意，在使用任何基因序列时，请确保遵循相关的法律法规和学术道德规范。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
刚开始接触western，看了很多和内参有关的资料，越来越迷惑。
请教园子里的高手：1 内参的主要作用是什么，是必须的吗? 2 内参是和样品一起加，还是单独加，抗体孵育时是分着加，还是一起，条件一致吗？3 单是证明是否样品中存在某蛋白，不用内参可以吗？
请赐教！
1、在实验中，可能存在总蛋白浓度测定不准确；或者蛋白质样品在电泳前上样时产生的样品间的
操作误差；这些误差需要通过测定每个样品中实际转到膜上的GAPDH 的含量来进行校正，所以一般的western实验都需要进行内参设置。
具体校正的方法就是将每个样品测得的目的蛋白含量与本样品的GAPDH 含量相除，得到每个样品目的蛋白的相对含量。
然后才进行样品与样品之间的比较。
所以有时候要用内参
2、和一抗一起加，按照内参的比例加
3、可以不用加内参
1.内参是样品中本身就有的，有其一定的分子量。
一抗.二抗时得分开孵育。
2.只是定性的话不需要加内参
Western Blot除了能证明某样品中含有某种蛋白之外，其最为重要的作用是比较不同条件下或者不同组织中，目的蛋白表达量的相对多少。
即为蛋白表达水平最直接的证据。
要衡量蛋白的表达水平，前提条件就是等量的上样量。
内参的意义就是保证上样量的一致。
内参即是内部参照（Internal Control），对于哺乳动物细胞来说一般是指由管家基因编码表达的蛋白(Housekeeping Proteins)，它们在各组织和细胞中的表达相对恒定，在检测蛋白的表达水平变化时常用它来做参照物。
如果内参的条带亮度基本一致，那么就可以认为上样量也基本一致。
常用的蛋白质内参有GAPDH（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase）和细胞骨架蛋白beta-actin或beta-tubulin。
最近发现tubulin的表达水平比其它看家基因更加恒定。
因此人们越来越多的使用tubulin做为内参。
在Western Blotting实验过程中使用内参的方法有：
一、超级简便的标记内参使用法：只要在二抗孵育时加入HRP标记内参抗体，按照正常操作即可。
二、普通内参：当目的蛋白的分子量大小与选用的内参蛋白分子量相差不大时，可以先进行目的蛋白的抗体温育显色和检测。
然后使用Strip缓冲液洗掉膜上的抗体，重新进行内参蛋白的抗体温育、显色检测。
三、（也是我们实验室用的方法）当目的蛋白的分子量大小与选用的内参蛋白分子量大小相差比较明显情况下，可以在转膜后预染，根据蛋白质Marker的大小将膜剪为大分子量和小分子量两部分，使内参蛋白与目的蛋白分开。
然后两块膜分别与内参蛋白抗体以及目的蛋白抗体进行温育，二抗温育以及显色。
很感谢大家的帮助，现在总算明白了一些。