蛋白质含量测定——双缩脲试剂法实验报告
【生化实验】双缩脲法测定蛋白质含量
原理
在碱性环境下，具有两个以上肽键的物质 与双缩脲试剂中的铜离子反应，形成紫红 色的络合物，颜色的深浅与肽键的多少即 蛋白质含量呈正比。
双缩脲法是基于铜离子与蛋白质之间的反应。 溶解于碱性溶液中的硫酸铜加入蛋白质溶液 中，二价的铜被还原为一价的铜并在碱性环 境中与蛋白质分子肽键中的氮形成络合物。 该络合物呈紫红色， 可在540 nm波长下进 行检测，吸光度与蛋白质含量成正比。
混匀
置37℃水浴30 分钟, 在540nm 波长下以0号管调零测各管吸光度
★实验结论: ___号待测蛋白浓度为_____ ★实验结束,清洗仪器,锁好抽屉,钥匙交班长处 ★所有实验报告装订好，按学号顺序放讲台上
2、绘制标准曲线
★实验结论中注明待测蛋白编号 ★实验结束,清洗仪器,锁好抽屉,钥匙交学委处 ★所有实验报告订好，上交时按学号顺序叠好
1、取8支试管，按下表操作
试剂 0
1
2
3
4
5
6
测定管
卵清蛋白溶液
(6mg/ml)
—
0.3ml 0.6ml 0.9ml
1.2ml
1.5ml
1.8ml
3.0ml 待测蛋白
蒸馏水 3.0ml 2.7ml 2.4ml 2.1ml 1.8ml 1.5ml 1.2ml —
双缩脲试剂 3.0ml 3.0ml 3.0ml 3.0ml 3.0ml 3.0ml 3.0ml 3.0ml
蛋白质浓度标准曲线
A 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1
ห้องสมุดไป่ตู้
0.6 1.2 1.8 2.4 3.0 3.6 蛋白质浓度 （ ）
722光电比色计使用
1.放入液体 2.调波长 3. 模式 “透射比”，开盖，调“0%” 4.将对照管对准光路， 关盖，调“100%”
蛋白质含量测定——双缩脲试剂法 实验报告
生物化学实验报告姓名:学号:专业年级:组别:生物化学与分子生物学实验教学中心实验名称蛋白质含量测定——双缩脲试剂法实验日期实验地点合作者指导老师评分教师签名批改日期一、实验目得1、１、掌握双缩脲测定血清总蛋白得基本原理、操作;1.２。
掌握双缩脲试剂得配制;1。
3。
熟悉血清总蛋白得临床意义;1。
4。
了解双缩脲法测定血清总蛋白得特点与注意事项。
二、实验原理2、１.两分子尿素加热脱氨缩合成得双缩脲(H2N—OＣ－NH—CO—NH2),因分子内含有两个邻接得肽键,在碱性溶液中可与Cu２＋发生双缩脲反应,生成紫红色络合物、2。
2。
蛋白质分子含有大量彼此相连得肽键(-CＯ—NH-),同样能在碱性条件下与Cu ２+发生双缩脲反应,生成得紫红色络合物,且在５40nｍ处得吸光度与蛋白质得含量在1０～120g/L范围内有良好得线性关系。
三、材料与方法:3、１、实验材料:3。
１．1.实验试剂:①小牛血清;②6、0ｍｏl/LNａOH溶液;③双缩脲试剂:硫酸酮、酒石酸钾钠、碘化钾;④蛋白质标准液(70ｇ/Ｌ);⑤0.9％ＮａCl;⑥蒸馏水。
3．1．2.实验器材:①试管;②烧杯;③容量瓶;④加样枪;⑤刻度吸管;⑥玻璃棒;⑥１100分光光度计;⑦电子天平;⑧水浴锅。
3。
2、实验步骤—双缩脲试剂4。
0 4。
０4。
0测定次数1 2 3 平均吸光度m,以空白管调零,测S与U管吸得光度;d。
测定结束后,将比色杯中得样品回收进试管。
依据公式算出结果:四、结果与讨论:4.1。
实验现象:①选取三支洁净无损得试管,从左往右依次加入0。
9%氯化钠溶液、蛋白质标准液、相应得小牛血清各０、5mｌ,分别命名为B试管、S试管与U试管,再分别向三支试管内加入4mｌ得双缩脲试剂,溶液均成蓝色透明状、②将三支试管放入3７℃水浴锅中加热2０mｉn,取出后,Ｂ试管呈淡蓝色,S试管与U试管均成浅紫色,且S试管得颜色比Ｕ试管得颜色深。
(如图一)图一水浴后三支试管颜色图二分光计读数S0、18５0。
蛋白质定量生化实验报告
一、实验背景蛋白质是生物体内的重要功能分子，具有多种生物学功能，如催化、结构、运输、信号传导等。
因此，蛋白质定量分析在生物科学研究中具有重要意义。
本实验旨在通过双缩脲法对蛋白质进行定量测定，并分析实验结果。
二、实验目的1. 掌握双缩脲法测定蛋白质含量的原理和方法；2. 学会操作双缩脲试剂，并观察蛋白质定量结果；3. 分析实验数据，探讨蛋白质定量结果的影响因素。
三、实验原理双缩脲法是一种经典的蛋白质定量方法，其原理是：蛋白质分子中的肽键在碱性条件下与铜离子（Cu2+）发生反应，生成紫红色的络合物。
该络合物在540nm处的吸光度与蛋白质含量呈线性关系，通过测定吸光度可以计算出蛋白质的浓度。
四、实验材料1. 实验试剂：- 双缩脲试剂A：0.1g/L硫酸铜溶液；- 双缩脲试剂B：0.01g/L酒石酸钾钠溶液；- 标准蛋白质溶液（如牛血清白蛋白）；- 未知蛋白质样品；- 蒸馏水；- 6mol/L氢氧化钠溶液；- 50mmol/L磷酸盐缓冲液（pH 7.0）。
2. 实验仪器：- 分光光度计；- 移液器；- 试管；- 烧杯；- 玻璃棒。
五、实验步骤1. 准备标准曲线：- 取6个试管，分别加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL标准蛋白质溶液； - 加入1.8mL蒸馏水，使总体积为2.0mL；- 加入0.2mL双缩脲试剂A；- 混匀，静置10分钟；- 加入0.4mL双缩脲试剂B；- 混匀，静置10分钟；- 以蒸馏水为空白，在540nm处测定吸光度；- 以蛋白质浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。
2. 测定未知蛋白质样品：- 取6个试管，分别加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL未知蛋白质样品； - 加入1.8mL蒸馏水，使总体积为2.0mL；- 按照步骤1中的方法进行操作；- 以蒸馏水为空白，在540nm处测定吸光度；- 通过标准曲线计算未知蛋白质样品的浓度。
六、实验结果与分析1. 标准曲线绘制：- 标准曲线呈线性关系，相关系数R2=0.998。
双缩脲法试验一蛋白质含量测定
0 0 3 2
1 2 3 4 5 6 0.3 0.6 0.9 1.2 1.5 1.8 2.7 2.4 2.1 1.8 1.5 1.2 2 2 2 2 2 2
实验一 蛋方法
2．样液测定
取未知浓度的蛋白液 3.0ml 置试管内，加入双缩尿试剂 2.0ml ，混匀，测其 540nm 的值，对照标准曲线方程， 求得未知液蛋白浓度。 ( 注意：计算浓度时，不要把 2ml 双缩脲试剂计算在内，只
生化技术实验
生物实验中心 2009.10
实验一 蛋白质含量测定--双缩脲法
一、 目的 学习掌握双缩脲法测定蛋白质含量。 了解其它一些蛋白质定量方法。
(BCA 法、 folin- 酚试剂法，即 lowry 法，紫外分光光度 法,280nm）
实验一 蛋白质含量测定--双缩脲法
二、原理：
一.
实验目的
了解热水提取多糖的过程与注意事项。并了解 目的物质提取过程中的主要影响因子及其相互
关系。
掌握sevag试剂法除蛋白和乙醇沉降多糖的方法
与注意事项。
并学会使用旋转蒸发仪分离浓缩目的物质。
二 .实验原理
用热水提取真菌植物子实体中的多糖 , 利用 多糖类物质在热水中溶解度较高 , 将其提取 出来。 利用 sevag 试剂将游离蛋白变性成为不溶性 物质,经离心分离去除,可达到去除杂蛋白的 目的 接着利用多糖在乙醇中溶解度降低的原理将 多糖从溶液当中沉降出来。
三、 仪器
中低速离心机、循环真空泵、布式漏斗、 高速干粉粉碎机、恒温水浴锅、旋转蒸发 仪，可见分光光度计。250ml烧杯、试管、 移液管若干、1000mL的磨口锥形瓶1个/组。
双缩脲法测定蛋白质含量实验报告
1. 理解并掌握双缩脲法测定蛋白质含量的原理。
2. 学会使用双缩脲试剂进行蛋白质含量的测定。
3. 通过实验，了解实验误差的产生及其控制方法。
二、实验原理双缩脲法是一种基于蛋白质分子中肽键与铜离子反应产生紫色络合物的分析方法。
当蛋白质分子中的肽键在碱性条件下与铜离子作用时，会形成紫红色的络合物。
该络合物在540nm波长处的吸光度与蛋白质含量呈正比关系，因此可以通过测定吸光度来推算蛋白质的含量。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：- 蛋白质标准品- 待测蛋白质样品- 双缩脲试剂- 6mol/L的NaOH溶液- 0.1g/mL的硫酸铜溶液- 7支试管- 移液器- 分光光度计2. 实验仪器：- 磁力搅拌器- 电子天平- 移液管- 量筒1. 标准曲线的制作：- 取7支试管，分别加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml的蛋白质标准品溶液，用水补足至1ml。
- 各管中加入4ml双缩脲试剂，充分摇匀。
- 在室温下反应30分钟。
- 使用分光光度计在540nm波长处测定吸光度。
- 以蛋白质标准品浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。
2. 样品测定：- 取待测蛋白质样品1ml，加入4ml双缩脲试剂，充分摇匀。
- 在室温下反应30分钟。
- 使用分光光度计在540nm波长处测定吸光度。
- 从标准曲线上查找对应的蛋白质含量。
五、实验结果与分析根据实验步骤，绘制标准曲线，并在标准曲线上查找待测样品的蛋白质含量。
实验结果显示，待测样品的蛋白质含量为X mg/mL。
六、实验讨论1. 误差分析：- 误差主要来源于实验操作、试剂质量、仪器精度等因素。
- 为了减少误差，需要严格控制实验操作，使用高精度的仪器，并确保试剂质量。
2. 干扰因素：- 双缩脲法测定蛋白质含量时，一些物质可能会产生干扰，如三羟甲基氨基甲烷、一些氨基酸和EDTA等。
- 为了排除干扰，可以在实验前对样品进行预处理，如透析、凝胶过滤等。
3. 注意事项：- 在使用双缩脲试剂时，必须注意试剂的配制和储存条件。
蛋白质的定量测定一-双缩脲法
06
CATALOGUE
双缩脲法的改进和发展方向
改进方法
优化试剂配比
通过调整试剂浓度和比例，提高方法的灵敏度和 准确性，减少误差。
扩大应用范围
针对不同来源和性质的蛋白质样品，优化实验条 件，使其能够适用于更多样品的测定。
ABCD
简化操作步骤
减少实验步骤，降低操作难度，提高实验效率。
提高检测速度
采用快速显色反应或缩短反应时间的方法，缩短 实验周期，提高检测速度。
蛋白质结构研究
通过双缩脲法测定不同蛋白质的含量，有助于研究蛋白质的结构和 功能，进一步了解生物体的生命活动。
蛋白质合成与代谢研究
双缩脲法可以用于研究生物体内蛋白质的合成与代谢过程，探索相 关生理机制。
在医学研究中的应用
临床诊断
双缩脲法可以用于检测尿液、血 液等生物样本中的蛋白质含量， 辅助医生进行临床诊断。
药物研发
在药物研发过程中，双缩脲法可 用于检测药物对蛋白质的影响， 评估药物的疗效和安全性。
病理学研究
通过双缩脲法测定病变组织中蛋 白质的含量，有助于病理学研究 ，深入了解疾病的发生和发展机 制。
在食品工业中的应用
食品品质控制
01
双缩脲法可以用于检测食品中的蛋白质含量，确保食品品质符
合标准。
营养标签
03
CATALOGUE
双缩脲法的结果分析
实验结果记录
实验过程中，需要详细记录每个实验 步骤的操作和结果，包括加入试剂的 种类、浓度、体积，以及反应过程中 的现象和变化等。
实验结果记录应准确、详细，包括实 验数据和观察到的现象，以便后续分 析和处理。
结果计算与处理
根据实验记录的数据，进行相应的计 算和处理，以得出蛋白质的含量。
双缩脲法测定蛋白质实验报告
双缩脲法测定蛋白质实验报告
蛋白质的双缩脲法测定是常见的生物化学实验。
它是用来测定有机物中大量焦磷酸核苷（DNS）和蛋白质的10比热容变（TN）的定性分析试验。
一般根据实验结果，可求出有机物中蛋白质的含量。
本实验使用DNS溶液，蛋白质粉末（2mg），有机溶液（2mL），稀盐酸，硫酸、蒸馏水等试剂，运用比热容法来定量测定蛋白质，把响应者溶液和反应者溶液放入比热容杯中，先测测热曲线，记录溶液温度, 再加入反应者，再测测热曲线，记录溶液温度。
之后计算比热容，再从比热容图中求出10比热容变（TN），可由TN和蛋白质抗原浓度（P）重新计算出C蛋白质浓度，以检验蛋白质是否重正确。
本实验首先将22.725mL的2mol/L的硫酸溶液加入比热容杯中，用比热容仪对其温度变化进行测定，测得TN值为10.27 J/g•°C。
然后将8mg的蛋白质粉末和2 mL的稀盐酸中加入到比热容杯中，再测定温度，得到TN值为20.72 J/g•°C。
最后，将TN值相减，得出蛋白质的10比热容变（TN）值为10.45 J/g•°C，根据 TN与P的关系，得出蛋白质浓度C 为1.575mg/mL。
试验结果表明，采用双缩脲法测定有机物中蛋白质的含量是简单、准确、快捷的方法，可以更有效地进行蛋白质测定实验。
蛋白质含量测定——双缩脲试剂法-实验报告
蛋白质含量测定——双缩脲试剂法-实验报告生物化学实验报告姓名：学号：专业年级：组别：生物化学与分子生物学实验教学中心3.2.实验步骤四、结果与讨论：4.1.实验现象：①选取三支洁净无损的试管，从左往右依次加入0.9%氯化钠溶液、蛋白质标准液、相应的小牛血清各0.5ml，分别命名为B试管、S试管和U试管，再分别向三支试管内加入4ml的双缩脲试剂，溶液均成蓝色透明状。
②将三支试管放入37℃水浴锅中加热20min ，取出后，B 试管呈淡蓝色，S 试管和U 试管均成浅紫色，且S 试管的颜色比U 试管的颜色深。
（如图一）图一 水浴后三支试管颜色 图二 分光计读数S 0.185 0.184 0.185 0.1847 U 0.152 0.151 0.152 0.1517结果计算：代入公式：血清总蛋白（g/L)=(Au/As)X 蛋白质标准液浓度（g/L)，得出结果：血清总蛋白=57.493g/L 。
4.3.结果讨论经查阅资料得：正常成人血清总蛋白含量为60～80g/L ，而小牛血清总蛋白含量比正常成人血清总蛋白含量略低一点，本次结果得出小牛血清总蛋白含量为57.493g/L ，符合情况。
4.3.1.成功原因：①本次试验的试剂混合水浴后出现了预期效果：B 试管呈淡蓝色，S 试管和U 试管均成浅紫色，且S 试管的颜色比U 试管的颜色深。
B 试管呈淡蓝色是因为B 试管中没有发生任何反应，所以呈现双缩脲试剂本来的淡蓝色，而S 试管和U 试管呈浅紫色是因为试剂中的蛋白质和双缩脲发生了双缩脲反应而呈浅紫色。
②吸光度测试后得到的数据，经计算后得到了预期中的结果，是因为前面操作严谨。
4.3.2.误差分析①三次重复测定过程中出现了一些浮动数据，可能是因为仪器本身存在的可允许的误差范围。
②第一次尝试使用分光光度计的时候得到了负值，经查明是因为放置在其内的比色杯将磨面对准了通光面，经调整后，获得了正确的数据。
4.4.课后复习题4.4.1.什么叫双缩脲试剂？为什么要在双缩脲试剂中加入酒石酸钾钠和碘化钾？答：双缩脲试剂是一个用于鉴定蛋白质的分析化学试剂，遇到蛋白质显紫色。
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南方医科女曇生物化学实验报告
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专业年级：
组另
生物化学与分子生物学实验教学中心
指导老师
一、实验目的
1.1. 掌握双缩脲测定血清总蛋白的基本原理、操作； 1.
2. 掌握双缩脲试剂的配制； 1.
3. 熟悉血清总蛋白的临床意义；
1.4. 了解双缩脲法测定血清总蛋白的特点和注意事项。
二、实验原理
2.1. 两分子尿素加热脱氨缩合成的双缩脲（H2N-OC-NH-CO-NH2,因分子内含有两 个邻接的肽键，在碱性溶液中可与 Cu2+发生双缩脲反应，生成紫红色络合物。
2.2. 蛋白质分子含有大量彼此相连的肽键（-CO-NH-），同样能在碱性条件下与Cu2+ 发生双缩脲反应，生成的紫红色络合物，且在540nm 处的吸光度与蛋白质的含量在10〜 120g/L 范围内有良好的线性关系。
三、材料与方法：
3.1. 实验材料：
3.1.1. 实验试剂：①小牛血清；②6.0mol/LNaOH 溶液；③双缩脲试剂：硫酸酮、酒 石酸钾钠、碘化钾；④蛋白质标准液（70g/L [:⑤0.9%NaCI;⑥蒸馏水。
3.1.2. 实验器材：①试管；②烧杯；③容量瓶；④加样枪；⑤刻度吸管；⑥玻璃棒 ;® 1100分光光度计；⑦电子天平；⑧水浴锅。
实验日期
实验地点 合作者 评分
教师签名
批改日期
厂取3支试管，做好标记，
按下表操作：
加入物（ml ）
B （空白） S （标准） U （待测）
小牛血清（1:10） - - 0.5
蛋白质标准液（1:10） -
0.5
0.9%Nacl
-a.各管混匀，观察各试管颜色；
-
b. 将各试管置于37C 水浴锅中加热20min ,观察颜色；
c. 将试管中的液体倒入比色杯中，置于1100分光光度计的样品槽内，在波长540nm 以空白管调零，测S 和U 管吸的光度；
d. 测定结束后，将比色杯中的样品回收进试管。
丿
血清总蛋白（g/L ） - A U 汉蛋白质标准液浓度（g/L ）
依据公式算出结果：
A S
J
四、结果与讨论：
4.1. 实验现象：
①选取三支洁净无损的试管，从左往右依次加入 0.9%氯化钠溶液、蛋白质标准液、 相应的小牛血清各0.5ml ，分别命名为B 试管、S 试管和U 试管，再分别向三支试管内 加入4ml 的双缩脲试剂，溶液均成蓝色透明状。
0.5 双缩脲试剂
4.0
4.0
4.0
②将三支试管放入37C 水浴锅中加热20min ,取出后，B 试管呈淡蓝色，S 试管和U 试管均成浅紫色，且S 试管的颜色比U 试管的颜色深。
（如图一）
图一水浴后三支试管颜色
42实验数据
结果计算：代入公式：血清总蛋白（g/L ）=（Au/As ）X 蛋白质标准液浓度（g/L ），得 出结果：血清总蛋白=57.493g/L 。
4.3.结果讨论
经查阅资料得：正常成人血清总蛋白含量为 60〜80g/L ,而小牛血清总蛋白含量比 正常成人血清总蛋白含量略低一点，本次结果得出小牛血清总蛋白含量为 57.493g/L ,
符合情况。
4.3.1. 成功原因：
①本次试验的试剂混合水浴后出现了预期效果： B 试管呈淡蓝色，S 试管和U 试管 均成浅紫色，且S 试管的颜色比U 试管的颜色深。
B 试管呈淡蓝色是因为B 试管中没有 发生任何反应，所以呈现双缩脲试剂本来的淡蓝色，而 S 试管和U 试管呈浅紫色是因为 试剂中的蛋白质和双缩脲发生了双缩脲反应而呈浅紫色。
管号
测定次数
1 2 3 平均吸光度
0.185
0.184
0.185
0.1847
0.152 0.151
0.152 0.1517 图二分光计读数
②吸光度测试后得到的数据，经计算后得到了预期中的结果，是因为前面操作严谨。
4.32误差分析
①三次重复测定过程中出现了一些浮动数据，可能是因为仪器本身存在的可允许的
误差范围。
②第一次尝试使用分光光度计的时候得到了负值，经查明是因为放置在其内的比色
杯将磨面对准了通光面，经调整后，获得了正确的数据。
4.4. 课后复习题
4.4.1 .什么叫双缩脲试剂？为什么要在双缩脲试剂中加入酒石酸钾钠和碘化钾？答：双缩
脲试剂是一个用于鉴定蛋白质的分析化学试剂，遇到蛋白质显紫色。
它是
一个碱性的含铜试液，呈蓝色，由0.1g/ml氢氧化钠或氢氧化钾、0.01g/ml硫酸铜和酒石酸钾钠配制。
硫酸铜、酒石酸钾钠的碱性溶液中会生成紫红色络合物，在这种比例的
碱性水溶液中，本来形成的Cu(0H)2会与溶液中多余的0H形成[Cu(OH)4]2-络离子，酒石酸钾钠的作用就是保护这种络离子不被析出变为沉淀，向试剂中加入碘化钾，可延长试剂的使用寿命。
4.4.2 .试剂配制过程中，为何NaOH要单独配制，最后加入？
答：先单独加入NaOH溶液是为了营造一个碱性环境,在碱性环境下双缩脲试剂B中的Cu2+与蛋白质肽键络合产生颜色反应.如果先将双缩脲试剂A与双缩脲试剂B混合, 即NaO 旳CuSO4§液混在一起,那么就会产生Cu(OH)2沉淀,药剂就会失去作用,看不到效果,也就无法判断是否存在蛋白质.
4.4.3. 简述血清总蛋白测定的临床意义。
答：临床上，当血清总蛋白浓度降低时，可能代表：血清总蛋白浓度降低、蛋白质合成障碍、蛋白质丢失增加、营养不良或消耗增加或血浆稀释。
当血清总蛋白浓度增高时，可能代表：因多发性骨髓瘤而引起的蛋白质合成增加或因脱水、休克而引起的血浆。