峨眉黄连及近缘种DNA提取与RAPD反应的优化

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乌药等4种中药饮片基因组DNA提取方法的改进

乌药等4种中药饮片基因组DNA提取方法的改进
郭纯;鲁耀邦;聂媛媛;唐金凤
【期刊名称】《中南药学》
【年(卷),期】2009(7)11
【摘要】目的从乌药、云木香、枳壳、槟榔中药饮片中提取可用于RAPD扩增的高质量基因组DNA。

方法采用改良CTAB法粗提基因组DNA,部分基因组DNA 再进一步用试剂盒纯化,采用琼脂糖凝胶电泳、紫外分光光度法及RAPD扩增效果进行检测并比较。

结果饮片基因组DNA纯化后,以随机引物S28进行PCR扩增获得谱带更丰富、条带更清晰的RAPD条带。

结论本文所建立的DNA提取方法可适合多数中药饮片基因组DNA的提取,并可进一步用于RAPD分析。

【总页数】4页(P803-806)
【关键词】乌药;云木香;枳壳;槟榔;DNA提取
【作者】郭纯;鲁耀邦;聂媛媛;唐金凤
【作者单位】湖南中医药大学药学院
【正文语种】中文
【中图分类】R284
【相关文献】
1.豆象干标本基因组DNA提取方法的改进 [J], 李金庆;鲁闽;粟智平;段效辉;王颖;孙超;卢经
2.农业院校分子生物学实验方法的改进和探索——以"植物基因组DNA提取实验"
为例 [J], 蔡春梅;李帅
3.玉米干种子基因组DNA提取方法的改进 [J], 董永军;庞冰;张婷婷;王陆军;郝建平;王艳梅;李培良;王创云;邓艳芳;周琼;李志敏
4.从固定液保存的刺参样品中提取基因组 DNA 的改进方法 [J], 王祖哲;王利;顾晨雷;马普;王秀利
5.早食李基因组DNA提取方法的改进 [J], 谢志亮;何业华
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药用百合DNA提取和RAPD条件的优化

药用百合DNA提取和RAPD条件的优化童巧珍;盛孝邦;刘湘丹;周日宝;吴佳【期刊名称】《湖南中医药大学学报》【年(卷),期】2008(28)2【摘要】目的确定药用百合最佳随机扩增多态DNA(RAPD)分析方法 .方法以药用百合新鲜鳞叶为材料,研究DNA的提取方法 ,并对影响RAPD反应的各因素进行优化.结果药用百合RAPD反应体系及程序为:在40 μL反应体系中,含40 ng模板DNA,0.3 μmol/L随机引物,0.2 mmol/L dNTPs,1.7 mmol/L Mg2+,3 μL10×PCRBuffer,1.5 U Taq酶;扩增程序为:第一步94℃预变性2 min,第二步94℃变性1 min,第三步36℃退火45s,第四步72℃延伸90s.返回至第二步重复40个循环,第六步72℃延伸10 min,最后4℃保存以备电泳.结论建立了药用百合RAPD 的优化反应体系及程序.【总页数】4页(P33-36)【作者】童巧珍;盛孝邦;刘湘丹;周日宝;吴佳【作者单位】湖南农业大学,湖南,长沙,410128;湖南中医药大学,湖南,长沙,410007;湖南农业大学,湖南,长沙,410128;湖南中医药大学,湖南,长沙,410007;湖南中医药大学,湖南,长沙,410007;湖南中医药大学,湖南,长沙,410007【正文语种】中文【中图分类】R284.2【相关文献】1.兰州百合DNA提取方法比较及RAPD体系的快速优化 [J], 崔文娟;林玉红;欧巧明;石有太;罗俊杰2.广东野百合DNA提取和RAPD条件的优化 [J], 黄永芳;杨懋勋;柳军;周锦平3.兰州百合DNA提取方法比较及RAPD体系的快速优化 [J], 崔文娟;林玉红;欧巧明;石有太;罗俊杰4.濒危药用植物降香黄檀DNA提取及RAPD反应体系优化 [J], 杨新全;冯锦东;杨成民;魏建和;李榕涛;何明军5.亚洲百合DNA的提取及RAPD-PCR反应体系的优化 [J], 赵琛因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

DNA分子诊断技术在中药鉴定中应用

究,以阐明防治肝纤维化的现代作用机理中药复方抗肝纤维化的现代药理学研究包括药效学和药动力学,其中药效学研究开展的较早相对容易,但多数研究局限于药物效应方面,真正涉及到作用机制方面的研究还不广泛和深入。

而药动学的研究尚处在起步阶段,更深层次的研究较为少见,故中药复方药效学和药代动力学的研究应是今后重点研究方向之一。

由于中药复方对器官或组织的选择性不明显,药物活性不强烈,药效作用温和,往往长期服用才显现药效,所以应用中药复方进行抗肝纤维化的防治研究时应注意时效和量效关系的研究,但由于复方药物成分复杂,各药配合后药性、药效的变异,给复方抗肝纤维化的药动学研究增加了很多困难,所以目前从时效和量效关系方面着手的抗肝纤维化复方研究并不很多。

杜以兰等[3]提出采用由量—效关系和时—效关系求效量半衰期的方法研究其药动学。

还有人提出证治药动学伪说,根据证候与治疗的关系探讨方剂的效应,并相继提出“效应成分动力学”“中药复方活性成分群”等概念,代表了复方药理学研究的新思路。

中药复方抗肝纤维化的药效学和药动学研究是研究中药的药理效应及引起这种效应的有效成份在体内吸收、分布、代谢和排泄等量变规律的科学,可为临床抗肝纤维化时合理用药,优选用药方案及精选复方中的药味提供重要的理论依据,所以应是中药复方抗肝纤维化现代研究中新的研究思路和研究方向。

综上所述,若能立足于中药复方抗肝纤维化多靶点、多环节、多层次的整体优势,把握肝纤维化复杂的病理变化,建立起方证相符的病理学模型,有效开展中药复方的药理学研究,以中医理论为指导,筛选出疗效确定、临床与实验结果一致、经得起重复的复方制剂,那么,相信中药复方抗肝纤维化的防治研究和临床疗效将会跨上一个新的台阶。

参考文献:[1]王宝恩.中药复方861冲剂治疗肝纤维化远期疗效的观察[J ].中西医结合肝病杂志,1993,1(2):69.[2]董筠.乙肝抗纤方治疗慢性乙型肝炎肝纤维化的临床与实验研究[J ].南京中医药大学学报,1998,14(6):335-338.[3]李成韶,杜以兰.以药效为指标进行中药药动学研究的思路和体会[J ].中药药理与临床,1998,4(1).(收稿日期:2004-03-16)DNA 分子诊断技术在中药鉴定中应用刘雯霞1　雷国莲2(1.陕西中医学院研究生,陕西咸阳712046;2.陕西中医学院药学系生药教研室,陕西咸阳712083)摘　要:综述DNA 分子诊断技术在中药鉴定中的应用研究,重点论述分子诊断技术的分类及常用RAPD 技术,AFL P 技术及基因片段序列研究状况。

何首乌基因组DNA提取及RAPD反应体系正交设计优化

何首乌基因组DNA提取及RAPD反应体系正交设计优化(作者：_________ 单位： ____________ 邮编： __________ )【摘要】目的确定适合何首乌RAPD-PC的基因组DNA 提取方法及最适宜反应体系。

方法通过改良的CTAB法提取何首乌基因组DNA研究其用于RAPD-PCR勺可行性。

利用正交设计方法L16 (45)，针对Tag酶，引物，dNTP镁离子，模板设计了5因素4水平的正交实验，优化RAPD-PC反应体系。

结果正交设计结果表明，可以得到几种不同的有效扩增反应体系组合。

根据实际需求，最适宜的RAPD-PC 反应体系为20 卩I，其中1X PCR buffer, Tag 酶1U，弓I 物 1 卩mol/L，镁离子2 mmol/L，dNTP 300 卩mol/L，模板40 ng。

结论改良的CTAB法和正交优化得到的反应体系适合用于何首乌RAPD 遗传多样性分析。

【关键词】何首乌；DNA提取；RAPD正交设计何首乌是我国传统医药中的名贵药材，何首乌块根及茎叶均可入药。

何首乌具有补肝肾、益精血、乌须黑发、养心安神等功效，主治血虚身痛、心烦失眠、劳伤多汗等症。

同时可用于保健和食品等多方面，何首乌块根富含淀粉，含量高达45.2%,药食两用。

RAPD(Random Amplified Polymorphic DNA)技术是由美国学者Williams : 1］和Welsh :2］两个研究团队在1990年几乎同时发展起来的。

Williams等在发现RAPD多态性的同时还证明了RAPD标记的分离情况符合孟德尔遗传规律，因而明确了RAPD乍为分子标记用于研究生物遗传变异的理论基础。

RAPD分子标记建立在PCR基础之上。

通过使用一系列具有10个碱基的单链随机引物，对基因组的全部DNA进行PCR扩增以检测多态性。

RAPD^术因其操作简便、反应迅速、成本低和DNA用量少等优点而被广泛应用于药用植物种内或种间亲缘关系和遗传多样性方面的研究。

濒危药用植物降香黄檀DNA提取及RAPD反应体系优化

质量。
２．１ ‘ 童 ‘ ２去挥发油：第一次抽提加人翻，一饱和酚：氯仿：异戊醇＝５：２鲜：１后，必须上下摇动１众 ” ｉｎ左右，可以有效去除挥发油，否则抽提后会分三层，
影响上清液的吸取量。
２，美，１，３多糖的去除：在沉淀时上清液加人２乃体积的一０℃预冷的异丙醇和１２／１０体积的ｓｍｏ１，Ｌ一 ‘ １．５．ＩＲ二Ｒ扩增反应ＮＣＩａ进行沉淀，ＮＣＩａ可去除多糖，沉淀后尽可能用基础反应体系：２伪９模板ＤＮＡ、０二２ｏ１・Ｌ一 ‘ 枪头直接把沉淀吸出，还可减少其他杂质。
实验表明（瀚１略，Ｎ条带整齐、清晰，完全可用子ＲＡＰＬ）扩增反应。当叶片用硅胶处理放置后，部分材料所提取的ＤＮＡ有降解，分析可能是因为采集过程中叶片被损伤，ＤＮＡ被降解所制。此时，则应抛弃材料，选择其他保存好的材料进行实验。２，２，１反应体系的优化分析
２结果与分析
２，１总ＤＮＡ提取方法的确立
２，１，１１〕ＮＡ提取过程中的注意事项２．１，１，１去多黔：因降香黄檀纤片中富含多酚侧，采用珑和ＰｖＰ同时使用可有效去除多酚圈，其次提
取过程中在液氮研磨后转移过程要快，样品在外面时间太久容易被氧化，ＤＡ容易被降解，Ｎ影响ＤＮＡ
０．３ｎｌｍｏｌ・Ｌ一Ｌ〔ＩＮｒｌ，，０．邻ｍｌ〕）・Ｌ一 ’ 引物（５３７）。
蠢检羲
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热带棘业，，３，，、．，；，

菜心基因组DNA提取及RAPD反应体系的优化

菜心基因组DNA提取及RAPD反应体系的优化王丽;乔爱民;孙一铭;孙敏【期刊名称】《西南师范大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2006(031)002【摘要】用改良的CTAB法提取菜心基因组DNA,并利用紫外分光光度法测定其纯度和含量,用琼脂糖凝胶电泳法检测DNA的降解状况和纯度.结果表明:此法提取的DNA具有典型的天然DNA分子的标准紫外吸收光谱特点,且适于进行RAPD 分析.RAPD分析的优化反应体系为:25μL的反应液中含有0.8 U的Taq酶,0.28 μmol/Lprimer,30 ng的DNA,2.0 mmol/L Mg2+,0.20 mmol/L dNTPs.PCR扩增循环为94℃、5 min;94℃、1 min;36℃、1 min; 72℃、2 min,37个循环;72℃延伸10 min.【总页数】5页(P124-128)【作者】王丽;乔爱民;孙一铭;孙敏【作者单位】西南大学,生命科学学院,重庆,400715;仲恺农业技术学院,园艺系,广州,510225;仲恺农业技术学院,园艺系,广州,510225;西南大学,生命科学学院,重庆,400715;西南大学,生命科学学院,重庆,400715【正文语种】中文【中图分类】Q946【相关文献】1.巢蕨基因组DNA提取与RAPD反应体系优化 [J], 王雪兵;于旭东;朱会军;吴繁花;黄小凤;胡新文2.烟草靶斑病菌基因组DNA提取及RAPD反应体系的优化 [J], 伏颖;吴元华;穆凌霄;赵秀香3.蜡梅花瓣基因组DNA提取及RAPD-PCR反应体系优化 [J], 叶丽娟;禄久幸;杨秋生4.橡胶草基因组DNA提取及RAPD反应体系的优化 [J], 李若霖;崔百明;王颖;张秀春;陈雄庭;吴坤鑫5.何首乌基因组DNA提取及RAPD反应体系正交设计优化 [J], 胡裕清;赵树进因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

文冠果DNA提取及RAPD和ISSR反应体系构建

适反应体系为：ＰＣＲ扩增总体积为２ＯＬ，包含３Ｏｎｇ的模板ＤＮＡ，１Ｏ× ＰＣＲｂｕｆｆｅｒ２ｔｔＬ，２．０ｍｍｏ卜Ｌ－
Ｍｇ抖，０．１ｍｍｏｌ・ＬｄＮＴＰ和ＴａｑＤＮＡ聚合酶１Ｕ；ＩＳＳＲ最适反应体系为：ＰＣＲ扩增总体积为２０Ｌ，包括
３Ｏｎｇ的模板ＤＮＡ，１０ ×ＰＣＲｂｕｆｆｅｒ２Ｌ，２．５ｍｍｏｌ・ＬＭｇ，０．２ｍｍｏｌ・Ｌ－ｄＮＴＰ和ＴｌｎｑＤＮＡ聚合酶１Ｕ。
在最适反应体系下，ＲＡＰＤ和ＩＳＳＲ分析具有良好的稳定性和可重复性。
摘要：为研究文冠果种质遗传多样性，以新疆奇台文冠果自然栽培居群的４８个单株为材料，采用改良ＣＴＡＢ
法提取文冠果基因组ＤＮＡ，并对其ＲＡＰＤ和ＩＳＳＲ反应体系进行了优化。研究结果表明：文冠果的ＲＡＰＤ最
关键词：文冠果；ＤＮＡ；ＲＡＰＤ；ＩＳＳＲ
中图分类号：￥７９４文献标识码：Ａ文章编号：１００２ — ２７６７（２Ｏ１５）１ｏ＿０ｏ２７－Ｏ３Ｄ０ｌ：１０．ｉ１９４２／ｉ．ｉｓｓｎ１００２－２７６７．２０１５．１０．００２７
果基因组，建立了适合于文冠果的ＲＡＰＤ和ＩＳ — ＳＲ最佳反应体系，旨在为利用ＩＳＳＲ和ＲＡＰＤ技术分析文冠果居群遗传多样性提供科学依据。

桢楠DNA提取和RAPD条件的优化

张炜，汉利，龙贾廷彬ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ 谭斌宋鹏辜云杰李晓清，，，，
（．１四川省林业科学研究院，四川成都６０８；．１０１２宜宾市林业科学研究院，四川宜宾６４０；４００３邻水县林业局，．四川邻水６８０）３５０
Ａｂｓｒｃ：ｔａｔＤＮＡｆＰｈｅｅｚｅａｓｅｔａｔｄｆｏｔｅｆｅｈｌａｅｎｉｉａｇｌｄｅｅｖｓａｄｔｅｏｏｂｈｎｎｎｗａｘｒｃｅｒｍｈｒｓｅｖｓａｄｓｌｃｅｒｄｌａｅ．ｎｉｈｖｒｏｓｆｃｏｓａｆｃｉａｉｕａｔｒｆｅｔｎｇＲＡＰＤｅｃｉｎｗａｐｉｚｄ．ｅｏｔｚｄｒａｔｏｙｔｍｎｒｇａｒａｔｓｏｔｍｉｅＴｈｐｉｅｅｃｉｎｓｓｅａｄｐｏｒｍｍｅｏｏｍｉｆＲＡＰＤｏｏｂｈｎａｎｒｓｆｌｏｆｒＰｈｅｅｚｅｎａｗｅｅａｏｌｗｓ：ａｈ２ｔＬｍｐｉｃｔｎｒａｔｏｏｕｉｎｓｉｅｒＰｈｅｅｅｃ５ｘａｌｆａｉｅｃｉｎｓｌｔｕｔｄｆｏｂｉｏｏｏｚｎａａＲＡＰＤｓｃｎｉｔｄｏＬＤＮＡ，３ｘｈｅｎｎｗａｏｓｓｅｆ２ｔｘ０．ＩＬＴａｑＤＮＡｏｙｒｓ，１ｘｐｍｅ，ｘＭｇ２ｐｌｍｅａｅＩＬｒｉｒ５ＩＬＣ１，０．ＩＬＮＴＰｓａｄ１２，ｄＯ．ＴＣＲｍｐｉｃｔｏｒｇａｓｉｅｒＰｈｅｅｚｅｎ５ｘｄｎ６．ｐＬｄＨ，ｈｅＰａｌａｉｎｐｏｍｕｔｄｆｏｂｈｎａｎＲＡＰＤｉｆｒｏ

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２．１ｄＮＴＰｓ用量对ＰＣＲ结果的影响
ｄＮＴＰｓ作为ＰＣＲ反应的
次数４０～４５次都可以满足要求。
２．５黄连ＲＡＰＤ反应体系的确立影响随机引物ＰＣＲ反应的
原料参与新链ＤＮＡ的合成过程，对循环数，产物扩增的量有较大的影响，浓度过低，偶然性大，无扩增产物或扩增产物不稳
“ Ｊ
。
综合考虑这些因，本实验的ｄＮＴＰｓ浓度梯度设置在５０
～
３００ｔｔｍｏｌ／Ｌ之间（见图１）。实验结果表明：在黄连的ＲＡＰＤ实
验中，ｄＮＴＰｓ浓度在１５０—３００￣ｏｌ／Ｌ范围内均获得较好的扩增
２结果
出。对退火温度，延伸温度和循环次数进行多次对比分析（如
表１）。结果表明：退火温度３９～４０￣Ｃ可以取到理想的带谱；退
火时间以４０～６ｏｓ为宜；而扩增时间以６０ —９０ｓ比较合适。循环
酶，采用相同的扩增程序，就能获得重复性好、稳定可靠的结
的带弱，甚至出现弥散现象，致使谱带难以辨认。这可能是由于模板浓度过高所致。另外，模板ＤＮＡ的纯度也一定程度上影
因素很多，实验结果的质量是由反应中各因子共同作用决定的。通过对影响实验结果的各因子交互组合实验，本研究最后确立黄连的ＲＡＰＤ反应体系１０× ｒｅａｃｔｉｏｎ２５ａ：ｖｄＮＴＰｓ２．ｏａｖ
效果，但以２００—３００￣ｏｌ／Ｌ范围内的实验结果最为稳定，其扩增
带型相似。因此我们认为，黄连的ＲＡＰＤ实验的最佳的ｄＮＴＰｓ
浓度为２００ —３００Ｗｎｏｌ／Ｌ。２．２ＲＡＰＤ中模板ＤＡＮ用量的适宜范围模板ＤＮＡ的用量是
３讨论
定；浓度过高则会导致聚合酶错误掺入，影响扩增的特异性和精确性。Ｗｉｌｌｉａｍｓ等的ＲＡＰＤ实验中每种ｄＮＴＰｓ浓度为
１００ｔｍａｏｌ／Ｌ；在以后的研究中常使用１００—２００ｔｔｍｏｌ／Ｌ的ｄＮＴＰｓ－
Ｍｇ “
，
影响ＲＡＰＤ扩增产物的一个重要因素，它制约着扩增产物的量
及特异性，ＲＡＰＤ实验的模板浓度范围较大，不同物种的最适浓度范围有所不同，需经过实验来确定。本实验在２０５０ｎｇ
（２００￣ｍｏｌ／Ｌ），Ｍｇ “ １．５ａ（ｖ１．５ｍｍｏ１），Ｐｒｉｍｅｒ１．Ｏａ（Ｖ５ｐｍｏ１），Ｔａｑ１．５Ｕ，ｄｄＨ２Ｏ１６．５ａ，ｖＴｅｍｐｌａｔｅ１．Ｏａ（Ｖ２０～４０ｎｇ），Ｔｏｔａｌ２５、０。反应过程为４５个循环，４０ ℃退火５０ｓ，７２ ℃延伸９０ｓ。
ＴａｑＤＮＡ聚合酶、引物、模板ＤＮＡ和ｄＮＴＰ及反应缓冲液
之间设置模板ＤＮＡ用量梯度（见图２）。结果表明：模板ＤＮＡ浓
等因素均能影响扩增结果，并且不同物种的ＲＡＰＤ反应体系差
别也较大。本实验通过一系列研究发现：虽然ＲＡＰＤ反应涉及
研究表明，采集黄连幼嫩叶片可以更好地提取黄连属植物ＤＮＡ＿。本试验采用改良ＣｌＴＡＢ法，在提取液中加入巯基乙
醇和ＰＶＰ两种抗氧化剂，可防止ＤＮＡ的褐化。另外苯酚：氯仿：异戊醇（２５：２４：１）抽提２次，可有效除去蛋白、多糖和酚类等物质，获得的ＤＮＡ的质量和纯度都较好。ＲＡＰＤ反应条件严格，
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司ＡｃｔａＡｅａｄＭｅｄＷｅｉｆａｎｇＶｏ１．２９ Ⅳ ０：
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ＵＶＰＨＯＴＯＭ．Ｗ型凝胶成像系统中观察，分析，记录。
度对ＰＣＲ结果影响不显著，在２０—６０ａＳ／反应的模板ＤＮＡ含量
条件下均扩增出了基本相同的带型；超过８０ｎｇ以后，扩增出来
诸多因子，但通过严格控制反应条件，保证所有反应都在同一反应体系下完成，如使用同一厂家相同批号的ＴａｑＤＮＡ聚合