单分子荧光检测技术
荧光单分子检测技术
荧光单分子检测技术嘿，朋友们！今天咱来聊聊这个超厉害的荧光单分子检测技术呀！你说这荧光单分子检测技术啊，就好像是一个超级敏锐的小侦探！它能在茫茫的分子海洋里，精准地找到那一个它要找的“小目标”。
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这技术啊，可不是随随便便就能做到的。
它需要一系列高精尖的设备和手段呢！那些仪器就像是小侦探的各种神奇道具，帮助它完成任务。
而且啊，操作这个技术的科研人员们，那可都得是高手，就像武林高手一样，得有深厚的内力和精湛的技艺。
它的应用那可广泛啦！在生物学领域，能帮助我们更好地了解细胞的奥秘，看看那些小小的分子在细胞里是怎么活动的。
这不就像是给细胞拍了一部超级清晰的纪录片嘛！在医学上呢，说不定就能检测到那些隐藏得很深的疾病标志物，提前给我们发出警报。
哇，这可真是救命的本事呀！你说这技术这么厉害，要是没有它，我们得错过多少重要的发现呀！就好比你没有了眼镜，看什么都模模糊糊的，那多难受呀。
荧光单分子检测技术就是让我们能看清分子世界的那副“眼镜”。
它的精度高得吓人，能检测到极其微小的变化。
这就像你能察觉到别人脸上最细微的表情变化一样，厉害吧！而且它还在不断发展进步呢，就像我们人会不断学习成长一样。
以后它肯定还会有更多更牛的应用，给我们带来更多的惊喜。
咱再想想，要是没有这么厉害的技术，我们对很多疾病的研究可能就会停滞不前，对很多生物现象也没法弄明白。
那我们的科学进步不就慢了好多嘛！所以说呀，荧光单分子检测技术真的是太重要啦！它就像是科学世界里的一颗璀璨明珠，照亮着我们探索未知的道路。
让我们一起为这个了不起的技术点赞吧！我相信，它在未来一定会给我们带来更多的精彩和奇迹！这就是荧光单分子检测技术，一个超级厉害的存在！。
单分子定位显微成像技术介绍
单分子定位显微技术（Single Molecule Localization Microscopy，简称SMLM）是一种基于荧光显微技术的高分辨率成像方法，它的原理是通过利用单个荧光分子的闪烁信号来定位样品中的单个分子，从而实现高分辨率成像。
SMLM技术可以实现分子级别的可视化，其分辨率可以达到10纳米以下，远高于传统显微技术。
由于其高分辨率和高灵敏度，SMLM 技术已经成为生物学、化学、材料科学等多个领域中重要的研究工具。
一、原理SMLM的原理基于单个荧光标记的瞬时发光特性。
当激光或其他光源激发荧光标记时，标记会发射荧光光子。
这些光子在相机或光探测器上被捕获，并转化为电子信号。
在SMLM 中，通过分析这些光子的时间和空间分布，可以确定每个荧光标记的位置。
SMLM的关键在于利用光学显微镜的成像系统将荧光标记限制在光学焦点内，使得每次只有单个标记被激发发光。
因此，可以记录每个标记的光子发射时间和位置信息，并将这些信息用于精确定位标记的位置。
SMLM技术包括多种方法，其中最常用的是单分子激发的STORM（stochastic optical reconstruction microscopy）和PALM（photoactivated localization microscopy）。
在SMLM过程中，需要解决许多技术挑战，包括背景噪声的影响、荧光标记的失活和漂移等问题。
为了解决这些问题，研究者们开发了各种算法和图像处理技术，如滤波、校正和重建方法等。
这些技术的应用可以提高SMLM的空间分辨率和信噪比，并为更深入的细胞生物学研究提供了新的工具。
图 1 STORM其中，STORM是最常用的SMLM技术，其基本原理是利用亚波长分辨率下荧光发光的闪烁特性，对单个发光染料的位置进行定位，进而构建出超分辨率的图像。
STORM技术将样品在一定范围内随机激发，从而使样品中的荧光染料分子以随机的方式发光。
利用图像处理算法，可以对发光点的位置进行高精度的计算，得到超分辨率图像。
单分子荧光技术的发展与应用
单分子荧光技术的发展与应用单分子荧光技术是当前生物医学领域最热门的研究领域之一，它已成为不可或缺的工具，能够深入探究生物分子在细胞中的动态行为，例如蛋白质折叠、蛋白质-蛋白质、蛋白质-核酸相互作用等，对于研究生命科学有着深远的影响。
一、单分子荧光技术的起源和发展20世纪60年代，荧光显微技术被广泛应用于生命科学领域，生物学家们通过斑点法或者克隆手段，在细胞间或细胞内标记荧光蛋白，以观察它们的行为，这种方法被称为“荧光显微镜”。
但由于加标的局限性，如发光强度过低、样本混杂、光强度间差异、发射发生叠加等等，以及无法观测到单个荧光分子的运动，导致许多问题无法得到圆满的解决。
单分子荧光技术的概念源自1989年W. Moerner和M. Orrit等人的最早报道，他们在基于液体气相色谱法的实验中，通过激光激发单个荧光分子并对其进行记录，实现了单个荧光分子观测的目的。
1990年，B. Dickson和C. Yang在使用荧光染料标记的DNA中发现了荧光蛋白的发光发射强度与荧光染料浓度成反比的现象。
在此基础上，根据该技术的很多关键概念和观察到的现象，单分子荧光技术被不断发展完善。
目前已经发现的单分子荧光技术种类已经多达几十种，每一种都有其特别的用途和限制。
二、单分子荧光技术的研究方法与原理单分子荧光技术是建立在荧光现象基础上的一种特殊光谱技术，它通过利用荧光蛋白或荧光标记的分子，在低荧光背景下实现单个荧光分子的可靠检测和跟踪。
其中常见的单分子荧光技术有：光激发荧光技术，双荧光共振能量转移技术，荧光猝灭技术等等。
它们的共同点是通过加标技术对分子标记，再在荧光显微镜下观察信号的发射，通过激光激发荧光信号，同时记录发光强度、荧光寿命、荧光偏振等多个参数，以实时监测单个分子的运动过程。
单分子荧光技术利用了荧光蛋白分子（如GFP、EGFP、DsRed 等）和染料分子，这些分子都具有特定的荧光信号，而这些信号是由激发荧光分子所产生的。
单分子荧光技术的应用与发展
单分子荧光技术的应用与发展单分子荧光技术已经成为许多生物学、生物化学和生物物理学领域的研究工具。
随着技术的进步，单分子荧光技术也在不断发展。
本文将介绍单分子荧光技术的应用和发展。
一、单分子荧光技术的基本原理单分子荧光技术是一种可以观测单个分子的光学技术。
其基本原理是利用化学反应或是物理操作使得单个分子在某种状态下变得可荧光化，并通过荧光光谱仪或者荧光显微镜进行检测。
单分子荧光技术具有分辨率高、检测速度快、实验操作简单、对样品数量要求低等优点，已经成为了生物学研究重要的手段之一。
二、单分子荧光技术在生物学中的应用单分子荧光技术可以用于研究生物分子的结构、功能、相互作用等。
下面将从蛋白质、核酸和细胞三个方面来介绍单分子荧光技术在生物学中的应用。
1. 蛋白质单分子荧光技术可以用于研究蛋白质的结构和功能。
例如可以研究蛋白质的折叠状态和结构，研究蛋白质的生物学功能，如酶活性、配体结合等。
此外，还可以通过单分子荧光技术研究蛋白质在细胞中的分布和动态过程，比如研究蛋白质的运动方式、交互作用等。
2. 核酸单分子荧光技术也可以应用于核酸的研究。
例如可以研究核酸的二级结构、三级结构甚至是四级结构等，以及研究核酸的随机游走过程、交互作用等。
3. 细胞单分子荧光技术也可以用于研究细胞的生物学过程。
例如研究细胞膜上的细胞受体分子的定位和分布、研究细胞活动中酶的转运过程、研究细胞中的信号传导过程等。
三、单分子荧光技术的新发展随着技术的新发展，单分子荧光技术在生物学领域的作用得到了更广泛的应用。
下面将从荧光探针、光学成像、微流体芯片和数据分析等四个方面介绍单分子荧光技术的新发展。
1. 荧光探针荧光探针是单分子荧光技术中至关重要的组成部分。
目前，已经开发出了各种各样的荧光探针，如有机荧光探针、量子点荧光探针、金属纳米颗粒荧光探针等。
这些新型的荧光探针可以使单分子荧光技术在更广泛的生物学领域中发挥更大的作用。
2. 光学成像光学成像是单分子荧光技术中的一个重要环节。
单分子荧光技术在生物医学中的应用
单分子荧光技术在生物医学中的应用随着时代的进步和科学技术的发展，越来越多的新兴技术在各个领域得到应用，其中就包括了单分子荧光技术。
作为一种新型的生物医学检测技术，单分子荧光技术在生物医学中的应用越来越广泛。
它以其高灵敏度、高分辨率的特点，为生物医学研究提供了更为细致和深入的探究手段。
下面将从单分子荧光技术的概念、原理、优势以及在生物医学中的应用展开讨论。
一、单分子荧光技术的概念与原理单分子荧光技术，是指在荧光探针的激发下，光子被不同分子中的单个荧光分子所吸收并重新辐射出来，利用光学显微镜等设备进行荧光分子的检测和分析的技术。
单分子荧光技术的原理在于在荧光探针激发下，不同分子中的单个荧光分子会吸收光子并重新辐射出来，利用光学显微镜等设备进行荧光分子的检测和分析。
利用单分子荧光技术可以获得一个分子单元的信息，通过这些信息来推断生物大分子相关反应的动力学、能量转移、空间结构以及数量等性质，从而更加深入的了解生物大分子的形态和特性。
二、单分子荧光技术的优势相比于传统的荧光显微镜技术，单分子荧光技术有以下几个优势：1.高灵敏度：单分子荧光技术能够检测出单独的荧光分子，因此具有非常高的灵敏度，即使是一个分子的表达量也可以被检测到。
2.高分辨率：单分子荧光技术可以在亚细胞级别的空间范围内，对荧光分子进行精确的定位和跟踪。
3.定量分析：可以通过单分子荧光技术获得荧光信号的定量信息，进而对分子的数量和活性状态进行研究。
4.快速便捷：单分子荧光技术可以在短时间内获得丰富的信息，而且几乎不需要对样品进行处理、操作简便。
三、1.生物大分子的形态研究单分子荧光技术可以通过对生物大分子中单个荧光分子的定位和跟踪，揭示生物大分子的形态，如其几何构型、聚集状态等。
通过对生物大分子的形态研究，可以更好地了解其功能和作用机制。
2.动力学研究单分子荧光技术可以通过对单个分子的跟踪，揭示生物大分子反应的动态过程。
如单分子的扩散、结合、解离、转化等反应过程，使我们了解到生物大分子反应中的动力学变化和机制，可以奠定生物医学研究的基础。
单分子荧光成像技术在生物学中的应用
单分子荧光成像技术在生物学中的应用生物学一直是人们关注的热门领域，通过不断地探索研究，人们能够更好地了解人类自身及其他生物的结构和功能。
而随着科学技术的不断发展，越来越多的高精度技术被引入到生物学研究中，从而推动了生物学的进一步发展。
其中，单分子荧光成像技术便是其中一种能够提供高精度信息的技术。
一、单分子荧光成像技术的原理单分子荧光成像技术是一种基于荧光原理的高分辨率技术，主要应用于生物领域的研究。
这种技术利用光子激发的原理，将待检测物的荧光标记（荧光染料）激发到激发态，并将其发射出光子。
利用荧光探针的口袋效应、分子旋转、溶液的黏滞度等参数的变化，可以研究分子内部微小结构的构成、生长路径、稳定性等细节信息。
通过综合测量多个信号点的位置和数值，可以图像化生物分子的单个或混合状态的空间分布。
这一技术在生物学研究领域受到广泛关注，是因为它提供了微观层次的生物物理信息，能够为生物学家提供详细的活细胞内高分辨率结构信息，探索分子机制和细胞生物学问题。
二、单分子荧光成像技术的应用领域1. 动态细胞成像单分子荧光成像技术可以实现对生物分子的单个分子的跟踪，因此广泛应用于细胞内运输和分配等相关研究，特别是在对蛋白质分子的组装和运动等过程的研究中应用广泛。
比如，可以通过标记蛋白质，考察它的表达、功能、互作以及空间关系。
2. 分子及运动机理的研究单分子荧光成像技术可以对分子的动态行为进行高分辨率研究，比如分子的转换、分化、聚集，从而了解分子相互关系及机理。
比如，可通过标记多种互补基因突变体，研究它们的活动状态。
3. 细菌感染机理研究单分子荧光成像技术还可以用于研究细菌感染机理，了解细胞在感染中的覆盖方式，细胞如何在感染过程中与细菌互动以及细胞与细菌的互相传递需要的分子行为等。
4. 药物研究单分子荧光成像技术也被广泛应用于药物研究领域，可以测定药物和蛋白质之间的互动方式，从而优化药物的目标特异性和效果。
三、单分子荧光成像技术的应用前景随着技术的不断推进，单分子荧光成像技术的应用前景会越来越广阔。
单分子荧光技术在生命科学中的应用
单分子荧光技术在生命科学中的应用单分子荧光技术是一种非常重要的技术，在生命科学中有着广泛的应用。
它可以被用于许多生物学研究, 如细胞重构、蛋白质折叠、分子动力学、药物筛选和癌症预防等方面的研究。
这篇文章将探讨单分子荧光技术的基本原理、其对生命科学的意义以及当前在该领域的应用。
基本原理荧光是分子吸收光子后发出的光，这种光谱是分子的特征标志。
单分子荧光技术是指利用荧光来测量单个分子。
当一个分子被光激发时，它会发出特定的荧光光谱，这种光谱是标识分子的固有物理和化学属性的。
利用荧光来测量分子的主要方法是荧光共振能量转移（FRET）和单分子荧光成像（SMF）。
FRET是一种基于能量转移的现象的技术，通过测量一个分子与另一个分子之间共振接触时荧光能量的传输来确定它们之间的距离。
单分子荧光成像是单分子检测技术的进化版。
它可用于直接观察单个分子在某一时间内的运动，因此具有较高的灵敏度和分辨率。
单分子荧光技术在生命科学中的意义单分子荧光技术在生命科学中具有广泛的应用。
以下是它在生命科学中的几个主要应用。
1. 学习生物大分子的结构和功能单分子荧光学是一种研究分子生物学中分子结构和功能的重要方法。
利用单分子荧光技术，科学家们能够更好地了解分子的结构和功能，因为他们可以直接研究单个分子而不是整个群体。
2. 研究细胞重构以及蛋白质折叠单分子荧光技术被广泛应用于细胞结构研究领域，因为它能够提供更高沉积速度和高分辨率的图像。
这一技术也广泛应用于蛋白质折叠研究中，因为它能够提供有关蛋白质折叠的动力学信息。
3. 分子动力学在环境中动态观察单独荧光基团的动态行为是批准的详细描述所观察到的进程。
使用 SWNTs 为从单个高比表面-area 下挖掘正确，高亮度，稳健手法在不同芳香族串接和 ir-hgic 这个4- 苯乙炔萃取香精被观察到了类如有意义的动态行为的形式形成菜单。
提出通过对荧光时间跃迁进行分析可以比较直接确定透明指数键斑点没有添加 SECF，提供足够的灵敏度和分辨率来区分不同构体。
单分子荧光检测的原理、方法及应用
0 前言
随着生命科学的迅速发展，人们对生命现象 的研究已深入到单细胞、单分子层次，许多传统的 分析方法与手段面临极大的挑战。单分子检测是 近十年来迅速发展起来的一种超灵敏的检测技 术，为分析化学工作者打开了一扇新的大门。现 在，人们不仅可以在溶液中对单个分子进行检测 和成像，而且可以通过对单分子的光谱性质进行 测量，从而对化学反应的途径进行实时监测，特别 是能对生物大分子进行探测并提供分子结构与功 能之间的信息。单分子检测有电化学法与光学 法，本文仅就单分子荧光检测的原理、方法及应用 作一简单阐述。
分子荧光检测的原理、方法及其在生命科学中的应用。
关键词：单分子检测；荧光；评述
中图分类号：06 - 1
文献标识码：A
Fluorescence Detection of Single Molecule and Its Applications
WANG Yi-iin
（ COiiege Of Chemistry and Chemicai Engineering，Guangxi University，Guangxi Nanning 530004 PRC）
从单分子水平上研究蛋白质与核酸的相互作 用可为人类基因组的研究提供许多新机会。实时 观察单个酶分子在 DNA 上的结合和运动可揭示 许多新问题，如 DNA 结合蛋白在许多非特异性结 合位点中如何找到特异性位点的，RNA 聚合酶在 转录时是如何运动的。单分子检测技术已用于直 接观察基因表达过程［24］。研究表明，荧光标记的 RNA 聚合酶分子沿 DNA 链作直线滑行，为滑动 是寻找启动子的机制提供了直接证据。研究表 明，在转录过程中 RNA 聚合酶分子沿 DNA 链移
图 1 分子能级图
2 方法
单分子荧光检测的技术关键在于确保被照射 的体积中只有一个分子与激光发生作用以及消除 杂质荧光的背景干扰。采用高效滤光片，利用共 焦、近场和消失波激发，可达此目的。根据所用仪 器及对样品激发方式的不同，单分子荧光检测大 体可分为以下 4 种。 2. 1 近场扫描光学显微镜
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单分子荧光检测技术涂熹娟B200425010【摘要】单分子检测技术有别与一般的常规检测技术，观测到的是单个分子的个体行为，而不是大量分子的综合平均效应。
近年来随着相关学科的技术进步，单分子研究已经在从分子生物学到细胞生物学等生命科学领域有了迅速的发展和应用。
本文简要介绍了单分子荧光检测技术的研究背景、意义、原理，以及该项技术进展和应用。
【关键词】单分子荧光寿命荧光偏振单分子FRET1. 单分子检测技术的意义和发展背景1.1单分子检测技术的意义在统计力学的各态遍历假设中，系综个体物理量轨迹的时间平均等于该物理量在给定时间的系综平均[1]。
在一个包含完全相同个体的系综，当测量时间足够长的时候，系综测量和单分子测量结果相同（例如对于稀溶液中小分子的核磁共振谱线的测定，由于测量时间远大于小分子的翻滚时间，这时体系就可以看成是一个均匀的体系，并看作静态）；但是即使在均相体系中，分子本身并不是处于静态，而是在不断地运动，测量的参数具有涨落现象，而测量时间可能会小于分子的涨落时间；另一种情况是在非均相体系中，个体轨迹平均本来就不等于系综平均（实际上几乎所有生物体系都不是均相体系）。
这以上考虑到的两点都导致系综测量结果和单分子测量结果不等。
一般系综测量结果表示的是大量由一种或多种对象组成的一个整体所表现出来的平均效应和平均值。
这一平均效应掩盖了许多特殊的信息。
而这些特殊的信息有时是非常重要的，尤其在研究具有非均匀特性的凝聚相物质和生物大分子结构时。
而相比之下，单分子检测就可做到对体系中单个分子的行为进行研究，可以得到在特定时刻，特定分子的特殊位置和行为，因为在某一时刻，集团中的任何成员只能处于一种状态。
将此再与时间相关，还可得到单个分子的行为的分布状况。
这样我们就可以同时得到所研究的对象的整体行为和个体行为了，然后将数据综合处理，得到更为全面的信息。
1.2单分子检测技术的意义和发展背景既然单分子检测技术有这么多的好处，为什么直到近年来才逐渐发展起来呢？这与光学系统的进展有很大的关系。
其实人类很早以前就有探索微观世界奥秘的要求，但是苦于没有理想的工具和手段。
直到世界上第一台可以被称为显微镜的仪器在1675年由荷兰生物学家列文虎克制作出来。
在以后的几百年，人们一直用光学显微镜观察微观和探索眼睛看不到的世界，但是光具有波动性使光学显微镜的分辨率只能达到光波的半波长左右，人类的探索因此受到了限制。
即使消除掉透镜形状的缺陷，任何光学仪器仍然无法完美的成像。
人们花了很长时间才发现，光在通过显微镜的时候要发生衍射，即物体上的一个点在成像的时候不会是一个点，而是一个衍射光斑。
如果两个衍射光斑靠得太近，你就没法把它们分辨开来。
显微镜的放大倍数再高也无济于事。
对于使用可见光作为光源的显微镜，它的分辨率极限是0.2微米。
任何小于0.2微米的结构都没法识别出来。
提高显微镜分辨率的途径之一就是设法减小光的波长，或者，用电子束来代替光。
根据德布罗意的物质波理论，运动的电子具有波动性，而且速度越快，它的“波长”就越短。
如果能把电子的速度加到足够高，并且汇聚它，就有可能用来放大物体。
进人20世纪，光电子技术得到了长足的发展，1938年，德国工程师Max Knoll和Ernst Ruska制造出了世界上第一台透射电子显微镜（TEM）。
几十年来，又有许多新型的显微镜问世，1952年，英国工程师Charles Oatley制造出了第一台扫描电子显微镜（SEM）。
电子显微镜是20世纪最重要的发明之一。
由于电子的速度可以加到很高，电子显微镜的分辨率可以达到纳米级（10-9m）。
很多在可见光下看不见的物体——例如病毒——在电子显微镜下现出了原形。
用电子代替光，这或许已经是一个反常规的主意，但是还有更令人吃惊的：1983年，IBM公司苏黎世实验室的两位科学家Gerd Binnig和Heinrich Rohrer发明了所谓的扫描隧道显微镜（STM）。
这种显微镜比电子显微镜更激进，它完全失去了传统显微镜的概念。
正是近年来这些在光谱学和光学显微镜方面的进展，使得在表面和溶液中检测和成像单分子成为了可能，而且可以对单分子的光谱性质进行检测并实时监控其动态过程。
使得我们终于可以看清单个分子与时间相关的行为，排除测量中的平均效应，发展单分子检测技术。
2. 单分子检测技术的原理2.1单个分子的荧光产生原理Fig.1 单个分子的荧光产生原理单分子的荧光产生原理如Fig.1所示[2]：S0，S1，S2分别为基态、第一激发单重态、第二激发单重态，T1为激发三重态。
分子吸收一个光子hνA后，被激发到较高的电子态S1或S2以上的能级后又快速弛豫到S1的最低振动能级，然后发射一个荧光光子ｈνF，同时使分子弛豫到S0的较高振动能级，最后快速弛豫到S0最低振动能级。
由于弛豫过程造成了能量损失，因此荧光光谱发生红移。
同时，分子也可能从S1无辐射系间窜跃到T1，由于自旋禁阻，其速度远低于从S1到S0的辐射跃迁时间。
然后从三重态弛豫到基态并发射一个磷光光子ｈνP。
单重态向三重态的跃迁会降低分子的荧光量子产率和缩短分子的荧光寿命，当处于S1态的电子弛豫到T1态时，分子的荧光很弱，乃至没有荧光，形成荧光暗态。
一旦当电子从T1态回到S0态时，分子处于新的一轮激发和发射的循环过程。
因而形成一个发射－暗态交替的量子跳跃过程，这种量子跳跃过程是单分子荧光的主要特征之一[3]。
这一重要特征导致了实验中观察到的单分子荧光光谱和荧光强度的涨落现象，并主要取决于单分子的局域环境及其淬灭途径。
因而测量单分子的荧光量子跳跃过程、荧光寿命和荧光量子产率可以提供很多关于单个荧光分子所在的局域环境的特性和变化情况的信息.单个荧光分子还具有唯一的固有荧光吸收跃迁偶极矩，分子只吸收那些偏振方向与其吸收跃迁偶极矩方向一致的光子，然后发出具有一定偏振方向的荧光。
荧光的偏振特性是单分子的另一重要特征[4]。
在单分子探测的广泛应用中，人们正是利用这种单个分子跃迁偶极矩的方向以及分子所处的环境的差异来研究和推测生物大分子的结构和功能。
以上是单个分子的荧光产生原理。
在单分子的实际荧光检测中是用激光激发荧光分子或用染料分子标记了的其他分子，分子发出荧光。
由于荧光物质通过激光束的时间( ms 级)比荧光的激发态寿命( ns 级)大得多，因此一个荧光物质分子在通过激光束的过程中可以被反复激发而在基态S0和电子激发态S1之间反复循环，发射出大量的荧光光子，即“光子爆发”。
通过这种在短时间内发出大量光子的“光子爆发”现象[5]可以把单个荧光物质分子的荧光同很强的背景杂散光区别开来，从而有效地探测单个荧光分子，并从这样的爆发中获取研究对象的相关信息。
荧光分子在激发光的照射下，反复经历多次激发、发射过程后，往往造成分子内部结构发生不可逆的变化，不能吸收更多的光子而进一步发射荧光。
这时就称该分子被光漂白了。
我们希望一个荧光物质分子在通过探测灵敏区时能够辐射尽可能多的荧光光子，这需要提高激光功率。
而当激光功率高时，荧光分子有可能在通过探测灵敏区的途中被漂白了，信噪比反而下降。
因此，在通过“光子爆发”提高荧光信号的同时，选择一个好的荧光分子和选取合适的激光功率以避免“光漂白”[6]也是非常重要的。
2.2单分子检测技术的关键将荧光基团标记在生物大分子上，可以通过其各种特性的变化来反映有关分子间的相互作用、酶活性、反应动力学、构象动力学、分子运动自由度及在化学和静电环境下活性改变等信息。
并且标记上去的荧光团对宿主的性质影响很小。
在稀溶液中，吸光光度法检测单个分子的吸光值的准确度较低，而荧光发射检测因背景值较低，所以较为灵敏，信噪比较高。
正如Keller所说“单分子检测能力的高低与其说是检测灵敏度的提高，不如说是背景噪音的降低”[7]对单分子荧光的探测必须满足两个基本要求[8]：（1）在被照射的体积中只有一个分子与激光发生相互作用，这一点可以很方便地通过调整研究体系的浓度（密度）来达到；（2）确保单分子的信号大于背景干扰信号。
可以通过减少拉曼散射、瑞利散射及其杂质荧光所造成的干扰来达到。
杂散光背景是影响单分子荧光检测信号的重要因素。
为了有效地检测单个分子，必须大大降低杂散光的干扰。
背景杂散光的主要来源为：溶液瑞利散射光、拉曼散射光和光学器件的散射光。
单分子检测在降低由瑞利散射、拉曼散射及溶剂杂质荧光产生的背景干扰时，因为单分子信号与探测体积无关，而背景则正比于探测体积，所以为减少单分子检测时背景杂散光的干扰，采用了降低探测体积这一有效途径。
因此，要获得理想的信噪比需要将激发体积最小化。
目前文献报道的流体聚焦法的检测体积可达到1～10pL的级别；微滴法也可达到pL级，共聚焦显微法的探测体积则在fL至亚fL级，因此背景可忽略不计，具有很高的信噪比，但这种方法由于布朗运动导致分子进入探测区域的概率较小，使得分子检测的效率较低。
如何平衡检测体积的减小与检测效率的提高亦是单分子检测技术亟待解决的问题之一。
另外，还有人使用毛细管和微通道来达到降低检测体积的目的。
为了消除杂散光，还可以采用的方法[5]：(a)光谱滤波：有滤光片去掉其它颜色的杂散光（如瑞利散射光，光学器件散射光，溶液杂质的荧光）；(b)利用荧光和杂散光在时间特性上的区别来消除拉曼散射光。
由于荧光强度是一条指数衰减曲线，荧光发射有几个ns的延迟，因此采用高重复频率的激光器并结合时间门符合技术可以把单个染料分子的荧光信号同很强的背景杂散光区别开来。
3. 单分子检测技术目前用于单分子研究的技术很多，包括观察其构象的变化、功能活动，以及与其它分子相互作用的动力学过程，可揭示出过去检测多分子集体行为平均化所掩盖的“个性”和蕴藏的丰富信息，从而深入了解生命活动的微观规律。
可将其归纳成以下两个方面：扫描探针技术和光学和光谱技术。
在扫描探针技术中，主要有扫描隧道显微技术(SEM)、原子力显微技术(AFM)和扫描离子电导显微镜技术(SICM)等相似技术家族。
而在光学和光谱技术中，则包括了扫描近场光学显微技术(SNOM)、光钳技术(OT)和荧光技术(Fluorescence)。
而且现在根据需要，还发展出各种组合技术，如AFM/光钳、SNOM/共焦显微术、SNOM/FRET等。
STM利用针尖与样品在近距时的隧道电流，AFM利用针尖与样品直接接触时的力，SICM利用针尖与样品间的电导达到成像的目的。
由于这类技术可在常温常压下进行，而且分辨率很高(10-9－10-10m水平)，因此对于显示单个分子的形貌具有很大的优越性。
目前应用AFM比较普遍，它不仅可以观察处于溶液状态的单个分子，更接近于生理状态，而且可以测量力谱，即和大分子一部分接触，并通过施力与距离的关系了解分子的力学性质，特别适合于对生物分子折叠与解折叠的研究。