乙型肝炎基因分型同耐药位点突变的关系研究
DNA测序线性反向探针杂交法检测HBV P基因耐药突变比较论文
DNA测序与线性反向探针杂交法检测HBV P基因耐药突变的比较【摘要】目的基于多重pcr和反向线性杂交原理，建立hbv基因分型及耐药突变检测的新方法。
方法对深圳地区的hbv进行基因分型，并对其常见耐药突变位点进行快速检测，了解其流行现状和流行规律。
结果在45份标本中dna序列测定法检测到碱基突变73个，其中与 lam相关突变24份（53.33%），与 adv 相关突变3份（6.66%），与ldt相关突变1份（2.22%），与etv相关突变1份（2.22%）；选取21份血清，其中与线性反向探针杂交检测结果一致的突变为85.71%（18/21），氨基酸位点一致为97.39%（224/230）。
结论检测hbv不同基因型与致病性及药物应答的关系，能够为研究hbv的流行病学规律提供新的方法，为hbv感染的治疗提供用药指导，从而也为hbv的感染控制提供新的诊断工具。
【关键词】慢性乙型肝炎；乙肝病毒；核苷/酸类药物；耐药性突变；dna测序；线性反向探针杂交法【中图分类号】r450【文献标识码】a【文章编号】1004-5511（2012）06-0346-02全世界大约有3.5亿乙型肝为病毒（hbv）携带者，每年约有80万人死于hbv 慢性感染所引发的重型肝炎、肝硬化和肝细胞癌等相关疾病。
乙型肝炎病毒（hbv）可在慢性持续性感染、机体免疫、压力或抗病毒治疗药物作用过程中发生变异［1］。
近年来，临床上开始广泛采用采用核苷/酸类药物治疗乙型肝炎，核苷/酸类药物方拉米夫定(lam)、阿德福韦酯(adv)、替比夫定(ldt)、恩替卡韦(etv)等简便、副作用少、能迅速抑制hbv复制。
但其耐药性问题也日益突出。
本研究采用基于巢式 pcr 的 hbv p 基因序列测定法检测慢性乙型肝炎患者血清 hbv 基因变异情况，并与线性反向探针杂交法检测结果比较，同时对新发现的若干 hbv dna 耐药突变位点进行分析。
现将实验结果报告如下。
结合基因型耐药突变检测与表型耐药分析探索乙肝病毒耐药的新认识
结合基因型耐药突变检测与表型耐药分析探索乙肝病毒耐药的新认识徐东平;刘妍【摘要】核苷(酸)类似物是临床上治疗慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染最常用的药物,但长期应用可引发病毒耐药,导致治疗失败.基因变异检测及表型耐药分析是发现和鉴定HBV耐药的基本方法,前者主要是应用基因测序或线性反向探针杂交等方法,检出已知的病毒耐药相关突变,后者则是在体外细胞水平确定携带有变异基因的HBV毒株对病毒复制力及核苷(酸)类药物敏感性的影响,是鉴定复杂与特殊HBV耐药变异的基本手段.我们通过技术创新,建立了敏感、特异、经济、高效的HBV基因型检测方法,进而建立了可靠的HBV复制力和表型耐药分析方法,广泛应用于临床样本分析,实现了对HBV耐药的早期发现及对新的非典型HBV耐药相关突变株的鉴定. 我们近期在核苷(酸)类似物耐药和应答不佳的患者中检测到多种特殊和复杂HBV耐药相关突变,并结合临床资料,进一步对代表性变异株进行病毒复制力和表型耐药分析,取得了多项重要发现:①从大样本中检出和鉴定了多种多重耐药HBV 变异株,并发现联合用药可协同抑制多重耐药HBV变异株的体外复制；②HBV rtL229替换可作为补偿变异,恢复拉米夫定耐药变异株rtM204I的病毒复制力；③rtM204Q是一种新的拉米夫定耐药相关突变；④r tAl81C+rtL180M+rtM204V与恩替卡韦耐药相关；⑤同一耐药患者血清HBV虽检出耐药变异,但外周血单个核淋巴细胞(PBMCs)中的HBV cccDNA仍以原始野生株为优势种群,提示PBMCs为体内HBV野生株的“存储库”,参与HBV肝外感染 . 上述发现对深入揭示HBV耐药变异的临床特点和发生机制,辅助临床合理制定并优化抗病毒治疗方案具有重要作用.%This work was supported by the National Twelfth Five-Year Special Grand Project for Infectious Diseases(2012ZX10004S03), the National Natural Science Foundation (81171617), and the Twelfth Five-Year Clinical High-tech Project of Military Hospital (2010gxjs009)rn[Abstract] Nucleoside and nucleotide analogs are most commonly-used agents in the treatment of hepatitis B virus (HBV) infection. However, long-term use of nucleoside/nucleotide analogs may induce HBV drug resistance, thereby leading to treatment failure. The genotyping and phenotyping are two basic methods for detection and identification of HBV drug resistance. Genotyping is used to detect well-known drug-resistant mutations mainly through DNA sequencing and reverse hybridization line probe. Phenotyping is an essential tool to identify "novel" and complex resistant mutations, based on comparison of HBV replication capacity and drug susceptibility between variants and wild-type counterparts. We have developed sensitive, specific, high cost-effectiveness assay for HBV genotypic resistance detection, thus developing reliable assays for analyses of HBV replication capacity and phenotypic resistance. These assays have been widely-applied in clinic, realizing early finding of classical drug-resistant mutations and identification of unusual drug-resistant mutations. In our recent studies, we detected some unusual and complex HBV mutations in the patients with resistance and without good response to nucleos(t)ide analogs. In combination with clinical information and phenotyping of replication capacity and drug susceptibility, we have acquired novel findings as follows, (l) Detected and identified several multidrug-resistant HBV strains by screening of a large number of patients; and multidrug-resistant HBVstrains could be synergistically suppressed by combined use of anti-HBV agents. (2) It was found that HBV rt229 substitutions could be a compensatory mutation to increase replication capacity of lamivudine-resistant rtM204I mutant. (3) rtM204Q,was found as a novel lamivudine-resistance-associated mutation. (4) rtA181C+rtL180M+rtM204V was found to be associated with entecavir resistance. (S) It was found that in the same patient with drug-resistant HBV strains in sera, wild-type HBV strains were predominant in cccDNA of their peripheral blood mononuclear cells (PBMCs), suggesting that PBMCs might be a storage pool of wild-type HBV associated with extra-hepatic HBV infection mechanism. These findings are important for a better understanding of clinical features and underlying mechanism of HBV drug-resistant mutations, capacitating clinicians to optimize antiviral schedule.【期刊名称】《解放军医学杂志》【年(卷),期】2012(037)006【总页数】4页(P535-538)【关键词】肝炎病毒,乙型;突变;抗药性,病毒;表型【作者】徐东平;刘妍【作者单位】100039北京解放军302医院全军传染病研究所/肝衰竭诊疗与研究中心病毒性肝炎研究室;100039北京解放军302医院全军传染病研究所/肝衰竭诊疗与研究中心病毒性肝炎研究室【正文语种】中文【中图分类】R512.62徐东平，医学博士，研究员，博士生导师。
武汉地区157例乙型肝炎病毒基因分型和耐药性分析
武汉地区157例乙型肝炎病毒基因分型和耐药性分析宋仕玲;桂文甲;周洪清;黄艺芬;尹淑芬;李靖;吴淑坤【期刊名称】《胃肠病学和肝病学杂志》【年(卷),期】2015(024)008【摘要】目的了解武汉市乙型肝炎病毒基因型分布特点和乙型肝炎病毒耐药情况.方法采用基因测序法检测武汉市区157例患者HBV基因型,目标检测基因型为A～H等8个基因型,检测HBV 11个耐药位点:rtL80、rtL169、rtV173、rtL180、rtA181、rtT184、rtA194、rtS202、rtM204、rtN236和rtM250,判断对HBV耐药的核苷类似物.结果武汉市区157例HBV感染者中,检出3种HBV基因型,其中B型占72.61％,C型占26.75％,D型占0.64％.共有68例(43.31％)耐药,其中B 型70.59％,C型29.41％,基因B型和C型的HBV相比,耐药发生差异无统计学意义(x2 =0.379,P＞0.05).对拉米夫定耐药41例,占全部耐药病例的60.29％,其中B型占73.17％,C型占26.83％;204I位点耐药17例,180M+204I位点耐药6例,180M+ 204V位点耐药12例,180M+ 204V/I位点耐药6例.对阿德福韦酯耐药20例,占全部耐药病例的29.41％,基因B型占75.0％,基因C型占25.0％,耐药位点为236T为9例,耐药位点为181T/V为7例,236T和181T/V联合耐药4例.对恩替卡韦耐药5例,占全部耐药病例的7.35％,基因B型3例,基因C型2例.拉米夫定和阿德福韦酯联合耐药2例,占全部耐药病例的2.94％,均为基因C型.替比夫定耐药与其他核苷类似物耐药分析结果重复,共32例,占47.06％,基因B型75.0％,基因C型25.0％.结论武汉市区157例乙型肝炎病毒感染者中男性较多,感染HBV 主要基因型为B型,其次为C型,患者主要表现为拉米夫定、替比夫定和阿德福韦酯耐药.临床应根据患者HBV基因型和耐药情况个体化制定治疗方案.【总页数】4页(P969-972)【作者】宋仕玲;桂文甲;周洪清;黄艺芬;尹淑芬;李靖;吴淑坤【作者单位】武警湖北总队医院感染科,湖北武汉430061;武警湖北总队医院感染科,湖北武汉430061;武警湖北总队医院感染科,湖北武汉430061;武警湖北总队医院感染科,湖北武汉430061;武警湖北总队医院感染科,湖北武汉430061;武警湖北总队医院感染科,湖北武汉430061;武警湖北总队医院感染科,湖北武汉430061【正文语种】中文【中图分类】R512.6+2【相关文献】1.武汉地区丙型肝炎病毒基因分型与慢性丙型肝炎患者肝功能和血液指标分析 [J], 周泉;李艳;童永清;汪明;徐万洲2.武汉地区254例丙型肝炎患者HCV基因分型结果分析 [J], 吴泽刚;李艳;郑红云3.某地区献血人群乙型肝炎病毒携带者基因分型与耐药性变异研究 [J], 肖泽斌;林树波;甘小洪;郑泽旋;李娟;Allen Chan;温国强4.乙型肝炎病毒的基因分型及其多药耐药位点变异与耐药性的相关性研究 [J], 张宝;李世龙;葛保民;秦莉;田珊红;周秀艳;李霞5.武汉地区女性人乳头瘤病毒感染及基因分型分析 [J], 黄景涛;白莉;李艳因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
乙型肝炎病毒基因耐药变异的研究现状
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（ 稿 日期 ：０ １— ３—１ 编 辑 ： 晓文 ） 收 ２１ ０ １ 庄
乙型 肝 炎 病 毒 基 因耐药 变 异 的研 究 现 状
廖艳霞▲ 杨光 ，
广东 省佛 山市第一人 民医院临床 医学研 究所（ ２０ ０ ５８０ ） 乙型病毒 性肝 炎是 全球最 常见 的感染性疾病之 一， 全球
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乙型肝炎病毒分型(B型、C型、D型)和耐药突变基因检测.doc
乙型肝炎病毒分型(B型、C型、D型)和耐药突变基因检测一．检验项目：乙型肝炎病毒分型(B型、C型、D型)和耐药突变基因检测二．检验目的：在进行抗病毒治疗前和抗病毒治疗中进行乙型肝炎病毒分型和耐药突变基因检测，能够：1). 区分中国和其他亚洲国家常见的HBV-B、C、D基因型；2). 检测HBV抗病毒药物5个热点突变位点的6种突变类型；3). 对HBV实行动态监控，辅助确定个性化的临床诊疗方案，进行HBV流行病学研究。
三．临床意义：HBV基因型分为9种（A-I），其分布具有地域性，中国乃至亚洲流行的乙型肝炎病毒几乎都是B、C型，此外还有少量D型，不同的基因型易发生的突变类型不同，与病情转归也密切相关，如基因型C较B更容易引起严重的肝炎或肝癌，对干扰素的应答率A型高于D型，B型高于C型，C型高于D型。
与C型患者相比，B型患者较早出现HBeAg血清学转换，较少进展为慢性肝炎，肝硬化和原发性肝细胞癌。
核苷（酸）类似物，如拉米夫定（Lamivudine，LMV），替比夫定（Telbivudine,LdT），阿德福韦酯（Adefovir,ADV）和恩替卡韦（Enticavir,ETV）等是抗HBV常见药物。
但这些药物都无法彻底清除大多数乙肝病人体内的HBV，患者需要长期维持治疗。
HBV在宿主体内感染以及抗病毒治疗的过程中会发生基因变异，并在宿主体内免疫系统的压力下和在治疗干预过程中进行变异的优势选择，以达到逃逸免疫、对抗药物、实现物种生存的目的，进而发生耐药。
乙肝病人一旦出现耐药突变，其肝功能恶化的比例将显著增高，甚至快速进展至肝衰竭。
四．标本送检要求：4ml黄色帽血清管，空腹采集后立即送检，室温放置不宜超过2小时，如不能立即送检可于4℃保存一周，如需长期保存请放入－20℃冻存，运输过程中请注意保持低温。
五．开单名称：乙型肝炎病毒分型和耐药突变基因检测进入本科室“医生工作站”→选择开单病人“姓名”→选择“项目类别”→选择“检验”→选择“乙型肝炎病毒分型和耐药突变基因检测”→确定或进入本科室“医生工作站”→选择开单病人“姓名”→选择“项目类别”→选择“检验”→选择“实验室”→选择“乙型肝炎病毒分型和耐药突变基因检测”→确定六．收费：570元/例七．送检时间：周一至周日8：00am－12：00am八．送检地点：检验科三楼服务台九．报告时间：抽血后，7个工作日后进入我院计算机检查报告系统，查看检测结果。
乙型肝炎病毒耐药基因及分型检测
乙型肝炎现状如何？乙型病毒性肝炎是由乙肝病毒（hepatitis B virus，HBV）感染引起的、以肝脏炎性病变为主，并可引起多器官损害的一种疾病，主要存在于肝细胞内，可引起肝细胞炎症、坏死和纤维化。
乙型肝炎病毒（HBV）感染呈世界性分布,全球约有3.6亿感染者，每年约有100万人死于与HBV相关的肝脏疾病.我国属于感染的高发区，现有的慢性HBV感染者约9300万例。
乙型肝炎病毒（HBV)基因分型的临床意义HBV根据DNA差异可分为A、B、C、D、E、F、G、H八种类型，不同型别在流行特征，致病性，对药物治疗反应等方面存在差异，其中，我国以B型和C型为主,感染HBV基因型B的患者发生肝纤维化及肝细胞癌的平均年龄要比感染HBV基因型C的患者的年龄大。
通过分型检测，可判断病毒复制活跃程度及突变发生率情况.研究表明，与HBV—B型相比,C型复制较活跃，不易发生HBeAg血清转换；HBV—B型易产生前C区突变，C型核心启动子区变异发生率更高，与重型肝炎发病机制密切相关，可作为肝癌高危指标之一.同时,HBV-B、C型患者易产生拉米夫定耐药突变，通过分型检测，可指导临床治疗方案制定，有针对性进行临床治疗，更大程度上提高患者的生活质量.乙肝的治疗方式有哪些?HBV感染主要的治疗方法是抗病毒治疗，国内外普遍使用的药物有干扰素和核苷（酸）类。
由于干扰素需要反复注射，且副作用较多,近年来,核苷(酸）类似物（NA)已成为抗HBV感染的主要方法之一，NA因其抑制病毒复制能力强、使用方便、耐受性好且疗效确切，适用于不同阶段的肝病患者,是长期治疗的合理选择.但随着治疗时间的延长,往往会出现病毒耐药株，从而需要监测乙型肝炎病毒耐药基因型，指导临床用药。
乙肝病毒产生耐药的机理是什么?HBV对某种药物的耐药性一般是指由HBV基因组上某些位点的变异导致这种药物对HBV的抑制作用减弱或无作用。
通常分为以下几种：(1）原发性耐药变异：指药物作用靶位的基因及其编码的氨基酸发生变异,导致变异病毒株对治疗药物的敏感度下降；（2）继发性耐药变异(又称补偿性耐药变异)：指由于原发性耐药变异病毒株复制能力下降,在原发性耐药变异的基础上，病毒株也可在其他位点发生变异,这些变异可部分恢复变异病毒的复制能力或可导致变异病毒对药物敏感度的进一步下降；（3）基因型耐药:指检测到已在体外的表型分析研究中被证实与抗病毒药物耐药相关的HBV变异；（4)表型耐药：通过体外复制系统证实检测到的HBV变异会降低其对抗病毒药物的敏感度。
乙型肝炎病毒基因型与YMDD变异关系的研究进展(文献综述)
ＹＤ Ｍ Ｄ变异 尤为突 出 ， 得 Ｈ Ｖ感 染后 的临床表 现与临 并使 Ｂ
床过程呈现多样 化 、 复杂化 。由于 Ｈ Ｖ不 同分离 株 间核苷 Ｂ 酸序列有差异 。｛ Ｅ前根据 ｔ Ｖ核苷 酸全序列 异质 性分 为 ８ ｔ Ｂ 个基 因型 ， 问的基因型与病毒复制、 不 变异 、 疾病 的预后及治 疗药物的选操均有一定 的关系。
上升趋势 Ｊ 。
突变。１８ 年 日 学者 Ｏ ａ ｏ － 首先提 出了 乙型肝炎 病 ９８ 本 ｋｍ ｔ １ ｏ
毒基因分型法 ， １ 株不 同亚型的 Ｈ Ｖ基因序列两两 比较 对 ８ Ｂ 后， 根据核苷 酸序列异 源性 ≥８ ％将 ｌ ８株不 同亚型 的 ｔ Ｖ ｔ Ｂ 基因序列分为 Ａ Ｃ 个基 因型 ， Ｂ Ｄ４ 随后 Ｎ ｒｅ 证实 了这 一 ｏｄｒ 结果 ， 同时还发现 了两个新 的基 因型 Ｅ和 Ｆ 目前 ， 。 人类 已 发现的 Ｈ Ｖ基因型共 ８种 ， 分型标准是全 基 因序 列 同源 Ｂ 其 性 Ｉ９ ％ ， Ｓ基 因序 列 同源性 ９９ ％， ＞２ 或 ６ 以此 为标准 将 乙肝 病 毒分为 Ａ～ｉ ８个基 因型 ， ｛ 不同基因型对各种抗病 毒药物
同样 ， 欧美 国家对 Ｈ Ｖ基 因型及其 与 Ｙ Ｄ相关性 的 Ｂ ＭＤ 研究结果显 示存 在地 区差异 。Ｍｏｋｖｔ ａｏｉ ｚ等 于 １９ ９ ８年 ～
异 与基 因型无关 。
主 ， 以 Ｂ型为 主， 南方 Ｄ型仅见于少数民族地 区， 西藏和新 如
疆 ， 型偶 有 发 班 ， Ｅ型 和 Ｆ型 。 Ａ 无
２ ＩＢ ＭＤ 变 异及 产生 机制 － ＶＹ Ｄ Ｉ
Ｈ Ｖ基 因组 由 ｓ Ｃ Ｐ Ｘ４个开放 阅读框组 成 ， Ｂ Ｂ 、、 、 Ｈ Ｖ变
深圳地区乙肝病毒基因分型与耐药性研究
（ 深 圳 市人 民 医 院
涟
５ １ ８ ０ ２ ０ ）
摘 要 ： 目的 了解 深 圳 地 区 乙肝 患 者 ＨＢ Ｖ 基 因型 分 布 情 况 ， 分析 ＨＢ Ｖ 基 因型 、 耐 药性 与 ＨＢ Ｖ Ｄ ＮＡ 载 量 、 Ｈｂ ｅ Ａｇ之 间 的
Ｒｅ ｓ ｕｌ ｔ ｓ ９ ０ ｃ ａ ｓ ｅ ｓ ｗｅ ｒ ｅ ｄ ｅ ｔ ｅ ｃ ｔ ｅ ｄ ｇ ｅ ｎ ｏｔ ｙｐ ｅ Ｂ ｉ ｎ １ ５６ ｐａ ｔ ｉ ｅ ｎｔ ｓ ｗｉ ｔ ｈ ＣＨ Ｂ， ａ ｃ ｃ ｏ ｕｎｔ ｉ ｎｇ ｆ ｏｒ ５７ ．６ ９ ．５ ８ ｃ ａ ｓ ｅ ｓ ｗｅ ｒ ｅ ｄ ｅ ｔ ｅ ｃ ｔ ｅ ｄ ｔ ｈｅ Ｃ ｇｅ ｎ ｏ—
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者 选择 适 合 的 治 疗 方 案 。
关键词 ： 肝 炎病 毒 ， 乙型 ； 基 因 型 ； 抗 药性 ， 微 生 物
Ｄ ＯＩ ： １ ０ ． ３ ９ ６ ９ ／ ｊ ． ｉ ｓ ｓ ｎ ． １ ６ ７ ３ — ４ １ ３ ０ ． ２ ０ １ ３ ． １ ４ ． ０ ０ ５ 文献标识码 ： Ａ 文章编号 ： １ ６ ７ ３ － ４ １ ３ ０ （ ２ ０ １ ３ ） １ ４ — １ ７ ８ ７ — ０ ２
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乙型肝炎基因分型同耐药位点突变的关系研究
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长期应用易导致耐药性 突 变 # 严 重 影 响 药 物 作 用 效 果' 4 > 区# 研究指出 RN Y 病毒 药 物 靶 位 氨 基 酸 替 代 是 耐 药 性 突 变 的 基
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但关于耐药位点突变与乙肝基因分型间关系的研究并不多见 ' 基于此 # 本研究首先建立了一 套 可 有 效 检 测 RN Y 基因分型及 耐药位点突变的方法 # 并探讨 了 耐 药 位 点 突 变 与 RN Y 基因分 型及其他临床信息的相关性 # 现报道如下 ' ? 资料与方法 参考, 慢性 ?# ? 一般资料 " ( ! '年%月 至 " ( ! =年 %月 入 院#
) =* 乙型肝炎防治指南 确诊为慢性乙型 肝 炎 $ 的患者' SRN& $ %
目的 探讨耐药位点突变与乙型肝炎病毒 基因分型及其他临床信 息 的 相 关 性 方 法 以 ' RN Y $ %例慢性乙型肝 摘 要 炎 患者为研究对象 采用聚合酶链反应 反向点杂交法 检 测 耐 药 位 点 及 基 因 分 型 收 集 患 者 血 清 SRN ) S 4, RN Y+ 05 载 量 丙氨酸氨基转移酶 水平 以及乙型肝炎病毒 @抗 原 性 别 年 龄 核苷 酸 类 似 物 用 药 时 间 等 临 床 资 料结 果 5 T > RN @ 5 所有标本均成功扩增阳性条带 RN 为 主 其次为 S 型 使用核苷 酸 类似物的 Y 基因型以 N 型 " & <例 % !例 + 型 ! (例 未用药的 = ' ! ! 患者中完全野生型 " & 8例 < 例患者均未见耐药突变 耐 药 位 点 突 变 以 " ( =及! % ( " ( =位点突变为主耐药突变 与患者性别 年龄 血清 RN 病毒基因型 用药 时 间 越 长 耐药突变率 Y+ 05 载量 5 T > 水平及 RN @ 5 C(# ( $ - 无明显相关性 越大 结 论 ) 反 向 点 杂 交 技 术 可 有 效 检 测 RN C(# ( $ ! % ( 位点突变与 " ( = 位点突变有一定相关性 C(# ( $ S 4 , Y 基因型 可有效指导临床用药 及突变位点 关键词 乙型肝炎 反向点杂交 , 聚合酶链反应 耐药位点突变 ! " # 2 : : ; # ! & < ' , = ! ' (# " ( ! $# ! '# ( = ' ! " # ! (# ' 8 & 8 9 文献标识码 5 文章编号 ! & < ' , = ! ' ( " ( ! $ ! ' , ! 8 ( $ , ( '
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替卡韦 ( 替比夫定等 & 将患 者 分 为 用 药 组 $ 及未用药组 $\' ! !& $ & ' 本研究已得到院伦理委员会批准 ' $\= < ?# @ 仪器与试剂 RN Y 检测试剂盒由亚能生物有限公司提 供# 湘仪公 + 05 提取用离心柱法 ' 主要仪器包括低温离心 机 $ 司& ( 聚合酶链反应 $ 仪$ 德国 U ( 恒温杂交 ) S 4& @ ; G ? C I公 司 & B B 仪$ 亚能生物技术有限公司 & 等' ?# A 方法 $ 提 取 RN ?# A# ? 试 验 方 法 一 般 流 程 如 下 ! !& Y+ 05' 将 RN Y+ 05 提取液 ( 及待测标本 " ( (" T 置入 !# $3 T 离心管 # 高速 离 心 $ 3 # 弃 上 清 液# 置 入 提 取 液 )# 低速离心后行 2 ; 再 行 数 秒 低 速 离 心 后# 加 入 三 氯 甲 烷# 高速离 ! ( ( [ 沸水浴 # 取上清液 '$ & 做好标记# 心# " ) S 4 扩增 ') S 4 反应管稍离心# 置入 !# 为 质 量 控 制# 另取 ) $" T 待测样 品 # S 4 反应管加入阳 杂 交'取 性及阴性质控品 ' 按 试 剂 说 明 书 行 ) S 4 扩 增 '$ '& 放 入 标 记 后 的 膜 条# 加 入 5 液# 并将 ) ! $3 T塑 料 离 心 管 # S 4 产物放入 5 液底 ' 沸 水 浴 ! # 置入= % (3 2 ; < [杂交管8 (3 2 ; 另取 $ 置 入 N 液# 预 热 '$ 同时行洗膜及孵育 (3 T ; % ( &, . ) * + 5 ' & 1 4 5 . + 2 . . &4 . * + 5 + 5 1P: 5 , % 16 . & ' + . 1* & (( , % . 1 5 1 + * & 0 .$ % + * + 5 ' & -' 38 3 3 6,