发酵工程菌种的来源及选育
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发酵工程(2)第二章 工业微生物菌种的选育与扩大培养
淀粉酶活力极强，多作糖 化酶使用；具有较强的蛋白质 分解能力，可用于制造腐乳。
华根霉 ( Rhizopus chinentis )
酿酒所必须的重要霉菌，也是 酸性蛋白酶和腐乳生产中的重要菌 种。
2、毛霉 ( Mucor )
鲁氏毛霉 ( Mucor rouxianus ) 能糖化淀粉且能生成少量酒精；能产生
6、醋酸菌 (Acetobacter)
➢ 不形成芽孢，G－，好气性 ➢ 可生产醋酸.
7、棒状杆菌 (Corynebacterium) ➢ 是谷氨酸和其他氨基酸的高产菌.
8、短杆菌 (Brevibacterium)
氨基酸、核苷酸工业生产中常用的菌种，也是酶法 合成生产辅酶A的菌种.
9、黄单胞菌 (Xanthomonas)
5、假丝酵母 (Candida)
➢能形成假丝，液体培养时能 形成浮膜。 ➢可生产SCP、甘油、脂肪酶。
6、红酵母 (Rhodotorula)
➢有明显的红色或黄色色 素，很多种因生荚膜而形 成粘质状菌落。 ➢可由菌体提取大量脂肪、 -胡萝卜素。
7、棉病针孢酵母 ( Nematspora gossypii )
2、葡萄汁酵母 (Saccharomyces uvarum)
与酿酒酵母相似，主要的区别在于葡萄汁酵母能发酵 棉子糖和蜜二糖。
3、汉逊酵母 (Hansenula)
此属酵母多能产生乙酸乙酯，从而增加产品的香 味，可用于酿酒和食品工业。
4、球拟酵母 (Toruiopsis)
此属酵母有些种能产生不同比例的甘油、赤藓 糖、阿拉伯糖；有的能利用烃类生产蛋白质。
复筛 不纯 第四次平板分离
第三次菌种保藏
第四次原种斜面
初步工艺条件摸索
再复筛
华根霉 ( Rhizopus chinentis )
酿酒所必须的重要霉菌，也是 酸性蛋白酶和腐乳生产中的重要菌 种。
2、毛霉 ( Mucor )
鲁氏毛霉 ( Mucor rouxianus ) 能糖化淀粉且能生成少量酒精；能产生
6、醋酸菌 (Acetobacter)
➢ 不形成芽孢，G－，好气性 ➢ 可生产醋酸.
7、棒状杆菌 (Corynebacterium) ➢ 是谷氨酸和其他氨基酸的高产菌.
8、短杆菌 (Brevibacterium)
氨基酸、核苷酸工业生产中常用的菌种，也是酶法 合成生产辅酶A的菌种.
9、黄单胞菌 (Xanthomonas)
5、假丝酵母 (Candida)
➢能形成假丝，液体培养时能 形成浮膜。 ➢可生产SCP、甘油、脂肪酶。
6、红酵母 (Rhodotorula)
➢有明显的红色或黄色色 素，很多种因生荚膜而形 成粘质状菌落。 ➢可由菌体提取大量脂肪、 -胡萝卜素。
7、棉病针孢酵母 ( Nematspora gossypii )
2、葡萄汁酵母 (Saccharomyces uvarum)
与酿酒酵母相似，主要的区别在于葡萄汁酵母能发酵 棉子糖和蜜二糖。
3、汉逊酵母 (Hansenula)
此属酵母多能产生乙酸乙酯，从而增加产品的香 味，可用于酿酒和食品工业。
4、球拟酵母 (Toruiopsis)
此属酵母有些种能产生不同比例的甘油、赤藓 糖、阿拉伯糖；有的能利用烃类生产蛋白质。
复筛 不纯 第四次平板分离
第三次菌种保藏
第四次原种斜面
初步工艺条件摸索
再复筛
发酵工程(菌种选育)重点
某些化学诱变剂常用浓度及处理时间
诱变剂 二乙酯 浓度 0.1～1% 处理时间(min) 18～24 60～120 中止方法
硫代硫酸钠或稀释 大量稀释
亚硝基胍 0.1～3㎎/ml
4）突变株的筛选
菌体细胞经诱变剂处理后, 要从大量的变异菌 株中，把一些具有优良性状的突变株挑选出来, 这
需要有明确的筛选目标和筛选方法, 需要进行认真
在生产过程中，不经人工处理，利用菌种的自然
突变而进行的菌种筛选过程。但突变的频率较低。
2.自然突变的两种可能
菌种衰退，生产能力下降；
代谢更加旺盛，生产性能提高。 3.自然选育的方法——单菌落纯种分离
五、诱变育种（Mutation breeding）
1.诱变育种的含义 应用微生物遗传和变异理论，用物理或 化学诱变剂处理均匀分散的微生物细胞群, 促进其突变率大幅度提高, 然后采用简便、
诱变剂的含义： 凡能引起生物体遗传物质发生变异的因素， 统称为诱变因素或诱变剂。 分类： 物理诱变，如紫外线、γ-射线、X-射线、
快中子、激光、等离子体、高压等
化学诱变，如硫酸二乙酯、亚硝基胍、亚硝
酸、碱基类、吖啶类物质等
诱变剂量的选择：
一般来说，诱变率随诱变剂量的增高而提高，
因此，通常诱变剂量采用致死率90%～99%的剂量， 但是，对于经过一再诱变的高产菌，诱变剂量要低 得多（致死率在90%～99%）。 诱变处理的方法： 单一处理：一次用一种的诱变剂处理方法处理菌种 复合处理：两种以上的诱变处理方法处理菌种，这 种处理方法通常较单一处理的效果好。
菌悬液的细胞浓度一般控制为: 真菌孢子或酵母细胞 106～107 个/ml； 放线菌或细菌 108个/ml。 菌悬液一般用生理盐水(0.85% NaCl)稀释。 有时用化学诱变剂处理时，需要0.1mol/L 磷酸缓冲液稀释, 因为有些化学诱变剂处理时, 常常会改变反应液的pH值。
第二章生产菌种的来源
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工业发酵菌种必须具备的基本特征
能在廉价原料制成的培养基上迅速生长，并能生成较 多的发酵产物； 培养条件如温度、渗透压等易于控制； 抗杂菌和抗噬菌体能力较强； 遗传稳定性高、不易退化； 不产生有害的生理活性物质或毒素（食品或医药微生 物菌株）
33
4、性能测定（毒性试验）
自然界的一些微生物在一定条件下会产毒； 除啤酒酵母、脆壁酵母、黑曲霉、米曲霉和枯草杆菌作 为食用无须作毒性试验外，其他均需 2年以上的毒性试 验； 医药卫生上的产品，还须通过安全试验和临床试验，获 得国家的药品生产许可证，方能使用； 生产性能测定； 生理生化特性、发酵周期、产品品种和产量、温度、 pH值、提取工艺等； 经自然界分离筛选获得的有价值的菌种进一步进行人工 选育。
具体方法： 在固体选择培养基中加入酶作用的底物培养微生物，能够 利用此底物的酶产生菌得以生长，并且往往会在其菌落周 围形成一透明圈。 透明圈的大小与酶活力的高低成正相关，可以作为菌种初 筛的判断标准。 如：蛋白酶、脂肪酶、果胶酶、甘露聚糖酶、淀粉酶、纤 维素酶等
22
目的微生物筛选方法的研究进展 目前土壤中能够培养的微生物不到总数的1%。 微生物的多样性及资源的开发仍然是今后若干 年的研究重点。 －－陈文新院士 分子生物学的实验手段，在微生物鉴别及特定 目标产物的筛选方面发挥了着越来越重要的作 用。如 :16SRNA同源性分析，基因序列分析及 DNA/DNA杂交技术等。
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几种重要生物活性物质产生菌的分离方法 抗病毒药物产生菌：用小平板测定由病毒引起的细胞 变性效果，是一种有用的筛选方法；检测病毒复制中 特有的DNA复制酶和核酸合成酶的酶抑制剂，是另一 种选择性更高的筛选方法。
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生长因子产生菌：通过观察分离菌能否促进营养 缺陷型菌株的生长来检出。 免疫激活剂产生菌：可以用细胞表面酶的抑制法， 筛选免疫激活剂产生菌； 多糖产生菌：可以通过菌落外观的观察来识别 （黏稠)
微生物菌种
虽然遗传工程等新的育种方法迅速发展，但诱变育种仍是目 前广泛使用的育种手段。
《发酵工程》
第二章 微生物菌种选育
原始菌株（出发菌株）
活细胞计数 诱变剂处理 活细胞计数 中间培养
突变株分离
诱变预备处 理
初筛 复筛 生产性能试验
工业微生物来源
想菌种保藏机构索取有关的菌株，从中筛选所需
菌株。
从自然界采集分离。
从一些发酵制品中分离目的菌株。
《发酵工程》
第二章 微生物菌种选育
微生物菌种的选择性分离
工业化菌种的要求
能够利用廉价的原料，简单的培养基，大量高效地合 成产物； 有关合成产物的途径尽可能地简单，或者说菌种改造 的可操作性要强；
分离耐高渗透压酵母菌，可到甜果、蜜饯、甘蔗渣堆积处采样
《发酵工程》
第二章 微生物菌种选育
目的微生物富集的一些基本方法
让目的微生物在种群中占优势，使筛选变 富集的目的： 得可能。
富集的三种方案：
定向培养:采用特定的有利于目的微生物富集的
条件（加热、膜过滤等），进行培养。
当不可能采用定向培养时，则可设计在一个分
能分解底物的微生物便会在菌落周围产生透明 圈，圈的大小初步反应菌株利用底物的能力。
分离水解酶产生菌时较多采用，如蛋白酶、淀粉酶、 脂肪酶、核酸酶等；
《发酵工程》
第二章 微生物菌种选育
例如用此法分离产生碱性蛋白酶的芽孢杆菌 土壤经巴氏消毒，以减少不产芽孢的微生物；然 后铺在pH8-9的琼脂培养基（含有均匀的不溶性蛋白 质）表面；碱性蛋白酶产生菌能消化平板上的不溶性 蛋白质，产生一透明圈。
遗传性能要相对稳定；
不易感染它种微生物或噬菌体； 产生菌及其产物的毒性必须考虑（在分类学上最好与 致病 菌无关）； 生产特性要符合工艺要求。
发酵工程(2)第二章 工业微生物菌种的选育与扩大培养
孢子丝盘卷成球形孢囊，内形成孢酵母菌
单细胞真核，主 分布于含糖质较多的 偏酸性环境中，如水 果、蔬菜、花蜜和植 物叶子上，以及果园 土壤中。
1、酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)
又称啤酒酵母。细胞多为圆形、 卵形，能产生子囊孢子。能发酵 葡萄糖、蔗糖、麦芽糖和半乳糖 等多种糖类，但不发酵乳糖和蜜 二糖。
5、白地霉 ( Geotrichum candidum )
➢ 节孢子单个或连接成链。
➢ 白地霉菌体蛋白营养价值很高，可供食用和饲 料用，也可用来提取核酸，在废料废水的利用上很 用价值。
6、产黄头孢霉 ( Cephalosporium chrysogen ) 头孢霉素、先锋霉素
3、游动放线菌属 （Actinoplanes）
➢ 一般不形成气生菌丝，孢子球形，有时端生1-40 根鞭毛，能运动。 ➢ 济南游动放线菌生产创新霉素(creatmycin; 1964).
4、诺卡氏菌属 (Norcadia)
➢ 菌落较小，边缘多呈树根 毛状。 ➢ 生产利福霉素、蚊霉素等
5、孢囊链霉菌属 (Streptosporangium)
4、青霉 ( Penicillum )
产黄青霉 ( Penicillum chrysogenum ) 生产青霉素，也可用来生产葡萄
糖氧化酶、葡萄糖酸、柠檬酸和抗坏 血酸。
娄地青霉 ( Penicillum roqueforti ) 属不对称青霉组，具有分解油
脂和蛋白质的能力，用于制造干酪； 该菌孢子能将甘油三酯氧化为甲基 酮。
第二章 工业微生物菌种的选育与扩大培养
第一节 发酵工业常用微生物 第二节 菌种来源 第三节 菌种选育 第四节 种子扩大培养 第五节 菌种保藏
单细胞真核，主 分布于含糖质较多的 偏酸性环境中，如水 果、蔬菜、花蜜和植 物叶子上，以及果园 土壤中。
1、酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)
又称啤酒酵母。细胞多为圆形、 卵形，能产生子囊孢子。能发酵 葡萄糖、蔗糖、麦芽糖和半乳糖 等多种糖类，但不发酵乳糖和蜜 二糖。
5、白地霉 ( Geotrichum candidum )
➢ 节孢子单个或连接成链。
➢ 白地霉菌体蛋白营养价值很高，可供食用和饲 料用，也可用来提取核酸，在废料废水的利用上很 用价值。
6、产黄头孢霉 ( Cephalosporium chrysogen ) 头孢霉素、先锋霉素
3、游动放线菌属 （Actinoplanes）
➢ 一般不形成气生菌丝，孢子球形，有时端生1-40 根鞭毛，能运动。 ➢ 济南游动放线菌生产创新霉素(creatmycin; 1964).
4、诺卡氏菌属 (Norcadia)
➢ 菌落较小，边缘多呈树根 毛状。 ➢ 生产利福霉素、蚊霉素等
5、孢囊链霉菌属 (Streptosporangium)
4、青霉 ( Penicillum )
产黄青霉 ( Penicillum chrysogenum ) 生产青霉素，也可用来生产葡萄
糖氧化酶、葡萄糖酸、柠檬酸和抗坏 血酸。
娄地青霉 ( Penicillum roqueforti ) 属不对称青霉组，具有分解油
脂和蛋白质的能力，用于制造干酪； 该菌孢子能将甘油三酯氧化为甲基 酮。
第二章 工业微生物菌种的选育与扩大培养
第一节 发酵工业常用微生物 第二节 菌种来源 第三节 菌种选育 第四节 种子扩大培养 第五节 菌种保藏
《发酵工程》02 工业发酵菌种选育
（2）增殖培养
➢目的： 富集目的微生物，让目的微生物在种群中 占优势，使筛选变得可能。
富集方法 1、养分 3、培养时间
2、pH条件 4、培养温度
等一切能提高目的微生物相对生长速度的手段，培养（固体、 液体；分批连续）后使目的微生物在种群中占优势。
（３）纯种分离
•
尽管通过增殖培养效果显著，但还是处于微
真菌（青霉素、头孢等）
一些产芽孢的细菌 植物或动物来源
问题：生产抗生素的微生物能不能用于生产氨基酸？
微生物（包括动、植物细胞）几乎可以生产 我们所需的一切产品，但是涉及到工业化生 产对于某一种特定的产品，只有特定的微生 物才具有大量表达的潜力。
例： 礼来(Eli lilly),花了10年的时间从40万株微 生物中，发现了三种有潜力的新抗生素。
• 细菌（bacteria）：常用的有枯草芽孢杆菌、 醋酸杆菌、棒状杆菌、短杆菌等。
短杆菌：GA、Gln、lys…… 枯草芽孢杆菌：淀粉酶（BF7658）、碱性蛋白酶等 地衣芽孢杆菌：HASS(耐高温α-淀粉酶) αAmylase 苏云金芽孢杆菌短：杆B菌T生物农药…棒…状杆菌 梭状芽孢杆菌：丙酮、丁y酸ea等sts的发酵
啤棒酒状酵杆母菌
• 酵母菌（yeast）：属单细胞真核生物，主 要分布于含糖较多的酸性环境中。常用的 有：啤酒酵母、假丝酵母、类酵母等。
啤酒酵母：酿酒、辅酶类物质的发酵
酒香酵母：酿酒
汉逊酵母：酿酒，用于乙酸乙酯的发酵
假丝酵母：单细胞蛋白生产，石油发酵
霉菌
• 霉菌（mould）：喜偏酸性环境。可用于生产多种 酶制剂、抗生素、有机酸及甾体激素等。
黑曲霉：柠檬酸工业、酿酒业、糖化酶 黄曲霉：酱油生产，面酱 青霉菌：青霉素的生产 红曲霉：红曲制造，南方红曲酒（女儿红）；红色；豆腐 乳 赤霉菌：赤霉素的生产
发酵工程设计菌种筛选方案
发酵工程设计菌种筛选方案第一步：确定目标产物在菌种筛选之前，首先需要确定目标产物是什么。
这个产物可以是食品添加剂、药物、化学品等。
确定目标产物后，可以确定需要的菌种类型，例如革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、真菌等。
此外，还需要确定产物的生产条件，例如温度、pH值、氧气需求等。
第二步：收集菌种资源在进行菌种筛选之前，需要先收集各种潜在的菌种资源。
这些资源可以通过从自然环境中进行采集、从已有的菌种库中获取或者通过其他方式获取。
一般来说，我们需要收集大量的菌株资源，以便进行后续的筛选工作。
第三步：菌种初步筛选在收集到菌株资源后，需要进行初步的筛选。
这一阶段的目标是快速地排除那些不太可能产生目标产物的菌株。
菌株的筛选可以通过观察菌落形态、生长速度、色素产生等方法进行。
第四步：菌种培养条件的优化在进行初步筛选后，我们需要对筛选出来的菌株进行培养条件的优化。
这包括温度、pH 值、培养基成分等。
通过优化培养条件，可以进一步筛选出对目标产物生产更为适合的菌种。
第五步：菌种产量的筛选在确定了合适的菌种后，需要进行产量的筛选工作。
这一阶段的目标是确定哪些菌株在相同的培养条件下可以产生最高的目标产物产量。
这一步通常需要进行大规模的培养实验。
第六步：菌种稳定性的筛选最后，需要对筛选出来的菌株进行稳定性的评估。
确定哪个菌株在不同培养条件下都能稳定地产生目标产物。
这一步通常需要进行长期的培养实验。
综上所述，菌种的筛选是一个复杂而又关键的工作。
通过以上的步骤，可以有效地筛选出适合生产目标产物的菌株，为发酵工程的成功提供保障。
发酵工程第二章发酵工业微生物菌种
施加选择性压力分离法 随机分离法 这两种方法都是针对菌种从样品中分离所采用的
方法，实际发酵工业上菌种分离的步骤要有很多 步骤。
新种分离与筛选的步骤
定方案：首先要查阅资料，了解所需菌种的生长 培养特性。
采样：有针对性地采集样品。 增殖：人为的通过控制养分或培养条件，使所需
菌种增殖培养后，在数量上占优势。 分离：利用分离技术得到纯种。 发酵性能测定：进行生产性能测定。这些特性包
工业上常用的微生物菌种
③ 霉菌： 工业上常用的霉菌有根霉、毛霉、红曲 霉、青霉等，主要生产酶制剂、抗生素、有机酸 和甾体激素等。
④ 放线菌： 工业上常用的有链霉菌属、小单胞菌 属和诺卡菌属，主要用于生产多种抗生素。
⑤ 担子菌： 即常说的蕈菌，主要用于生产多糖、 药物开发。
⑥ 藻类： 工业上常用的藻类有螺旋藻、单烈藻等， 主要用于生产食品，替代能源等。
新种分离与筛选的步骤
（三）培养分离 尽管通过增殖培养效果显著，但还是处于微生物
的混杂生长状态。因此还必须分离，纯化。在 这一步，增殖培养的选择性控制条件还应进一 步应用，而且控制得细一点，好一点。纯种分 离的方法有划线分离法、稀释分离法。
施加选择性压力分离法
施加选择性压力分离法：利用不同种类微生物生 长繁殖对环境和营养要求不同，人为控制这些条 件，使之利于某类或者某种微生物生长，不利于 其他微生物生存，以达到使目的菌占优势，从而 快速分离纯化的目的。
括形态、培养特征、营养要求、生理生化特性、 发酵周期、产品品种和产量、耐受最高温度、生 长和发酵最适温度、最适值、提取工艺等。
新种分离与筛选的步骤
从自然界中分离培养微生物是菌种选育的重要和基础的 步骤。
到目前为止，还没有一种分离培养方法能揭示一个试样 中所包含的所有微生物总数和种类。
方法，实际发酵工业上菌种分离的步骤要有很多 步骤。
新种分离与筛选的步骤
定方案：首先要查阅资料，了解所需菌种的生长 培养特性。
采样：有针对性地采集样品。 增殖：人为的通过控制养分或培养条件，使所需
菌种增殖培养后，在数量上占优势。 分离：利用分离技术得到纯种。 发酵性能测定：进行生产性能测定。这些特性包
工业上常用的微生物菌种
③ 霉菌： 工业上常用的霉菌有根霉、毛霉、红曲 霉、青霉等，主要生产酶制剂、抗生素、有机酸 和甾体激素等。
④ 放线菌： 工业上常用的有链霉菌属、小单胞菌 属和诺卡菌属，主要用于生产多种抗生素。
⑤ 担子菌： 即常说的蕈菌，主要用于生产多糖、 药物开发。
⑥ 藻类： 工业上常用的藻类有螺旋藻、单烈藻等， 主要用于生产食品，替代能源等。
新种分离与筛选的步骤
（三）培养分离 尽管通过增殖培养效果显著，但还是处于微生物
的混杂生长状态。因此还必须分离，纯化。在 这一步，增殖培养的选择性控制条件还应进一 步应用，而且控制得细一点，好一点。纯种分 离的方法有划线分离法、稀释分离法。
施加选择性压力分离法
施加选择性压力分离法：利用不同种类微生物生 长繁殖对环境和营养要求不同，人为控制这些条 件，使之利于某类或者某种微生物生长，不利于 其他微生物生存，以达到使目的菌占优势，从而 快速分离纯化的目的。
括形态、培养特征、营养要求、生理生化特性、 发酵周期、产品品种和产量、耐受最高温度、生 长和发酵最适温度、最适值、提取工艺等。
新种分离与筛选的步骤
从自然界中分离培养微生物是菌种选育的重要和基础的 步骤。
到目前为止，还没有一种分离培养方法能揭示一个试样 中所包含的所有微生物总数和种类。
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细菌分离：以乳酸菌为例
放线菌的分离
(一)采样
菜园土或林地土
土壤中放线菌最丰富，品种齐全。 可以筛选新的放线菌。
从堆肥或过热的材料中如干 草或蔗渣中可分离到大量的嗜热 放线菌，从淡水和海洋环境中分 离到嗜碱性的和嗜酸性的菌种。
自然风干，备用
气生孢子能耐干燥，耐湿热能力 高于营养体，室温保存20天， 放线菌的数量和组成变化不大， 细菌大部分死亡。
(二)生态学参数及培养基的组成原则
1、加入培养基中的天然提取物种类和用量、环境生物物 理学参数以及用于平板涂布分离样本的溶剂都会影响 实验中所要分离的细菌的数量和种类。
2、就分离培养基的组成而言，部分培养基中必须含有 10-50%的天然提取物。加入培养基中的天然提取物， 部分培养基中则应含有多种碳、氮源，如几丁质、纤 维素或果胶。
随机分离原理与技术
从产物入手，通过设计高产培养基和建立快速 灵敏专一的筛选方法，从随机分离的菌落中筛 选出所需的目的菌。
技术关键：产物合成条件的选择与控制及相应 筛选方法的确定。
随机分离技术举例
药理活性化合物产生菌的筛选
药理活性化合物是指能抑制人类代谢中某一 个关键酶的微生物产物即酶抑制剂，从而达到 治疗的目的。
样本采集时所需的工具通常有无菌刮铲、土样采集器、 镊子、解剖刀、手套、无菌小塑料袋和塑料瓶等。
采样的注意事项
1、采样时应尽可能保持相对无菌； 2、所采集的样本必须具有某种代表性； 3、采好的样必须完整地标上样本的种类及采集日期、
地点以及采集地点的地理、生态参数等； 4、应充分考虑采样的季节性和时间因素，因为真正的
（2）化学法
通过培养基中添加某些化学成分来增加微生物的数量。 如：用添加CaCO3稳定培养基的PH来分离嗜碱性的放线菌。
（3）诱饵法
将某些固体物质如石蜡、花粉、蛇皮、毛发等加到分离的土 壤或水中做成诱饵富集目的菌，待菌落长出后再进行分离。
3. 富集培养
富集培养
利用不同微生物生长繁殖对环境和营养的不同要求，如温度、 PH、渗透压、溶氧浓度、碳源和氮源类型及浓度等，使目的微 生物在最适宜条件下迅速繁殖，数量增加，成为人工环境下的 优势种。
1. 采样
(2) 采样对象
土壤、水、空气及枯枝落叶等，以土壤为主。
从土壤中采样要考虑土壤的以下特点：
① 有机质含量和通风状况
耕地、菜园 山坡上的森林
（有机质丰富、通气保水性能好）——细菌、放线菌
（有机质丰富、பைடு நூலகம்暗潮湿）——霉菌、酵母菌
沙土、无植被土壤、新开垦的生土、贫瘠的土地
——微生物少
② 取样的土层深度：5-25cm
3. 富集培养
富集培养的策略
（2）控制培养条件
➢ 溶氧浓度——好氧/厌氧 ➢ 高温——嗜热微生物 /非嗜热微生物 ➢ PH——嗜酸性/嗜碱性
4. 菌种分离
平板划线分离法 稀释分离法 毛细管分离法 小滴分离法
• 稀释倒 平板法
稀释分离法
• 平板 涂布法
注意：必须要做多个浓度的稀释分离平板。
筛选模型：目标酶
生长因子产生菌的筛选
筛选模型：营养缺陷型试验菌 筛选方法：利用被分离的微生物产物能否促进
营养缺陷型试验菌生长
氨
样品
复印平板法：首先在完全培养基琼脂平板上制
备密度适当的菌落，然后把平板上的菌落转移到
基
预处理生长丝 的圈绒 直法上 径， 应丝 比绒 培绷 养在 皿一 稍个 小圆 ）柱，的再光把滑它顶当面作上印（章圆，柱复
原地菌群的出现可能是短暂的；
5、采好的样应及时处理，暂不能处理的也应贮存于 4℃下，但贮存时间不宜过长。这是因为一旦采样结 束，试样中的微生物群体就脱离了原来的生态环境， 其内部生态环境就会发生变化，微生物群体之间就 会出现消长。
1．土样采集方法
森林、旱地，草地可先掘洞，由土壤下层向上层顺 序采集；
3．水样采集方法
用于细菌检测的水样应收集于100m1干净、灭菌的广口 塑料瓶中。
由于表层水中含有泥沙，故在采样时应在较深的静水 层中采集水样。
方法是：握住采样瓶底浸入水中30-50cm处，然后瓶口 朝下打开瓶盖，让水样进入。如果有急流存在的话， 应直接将瓶口反向于急流。采集瓶从水中取出时应迅 速并带有较大的弧度。水样不应装满采样瓶。所有水 样都应在24h之内迅速进行检测，或者4℃下贮存。
水田等浸水土壤在不损土层结构的情况下插入圆筒 采集。如果层次要求不严格，可取离地面5～15cm处 的土。将采集到的土样盛入聚乙烯袋或玻璃瓶中。
在采集植物根际土样时，一般方法是自土壤中慢慢 拔出植物根，在大量无菌水中浸渍约20min，洗去粘 附在根上的土壤，然后再用无菌水漂洗下根部残留 的土，这部分上却为根际土样。
植物体上细菌的分离：无菌富集，加植物浸出 液适度培养取样，洗涤，取1ml经适度稀释后涂 布平板。
水中细菌的分离：水样通过0.22μm无菌滤膜， 取出滤膜用1ml无菌稀释液将滤膜上的沉积洗下。 用样本稀释液适度稀释,涂布平板倒置培养或滤 纸压印分离法。
水中细菌分离的简易富集技术
在无菌的、用棉团塞好的广口三角烧瓶中连续培养，定期 取样涂布适宜分离琼脂平板上；
但对某些少数细菌则要求特殊的富集或 选择技术才能很好地被分离培养。
富集方法
运用细菌的酶诱导性，在分离培养基中添加若 干抗生素、复杂底物及生长因子的前体物质来 激活细菌某一特殊基因组，可以建立起若干富 集技术。
富集可以促进抗性的产生并维持下来。
土样中细菌的富集：适度稀释后，取0.1m1涂布 已添加及未添加富集底物(如几丁质、纤维素等) 的土浸出汁平板。
土中真菌的分离：稀释法，混入法，压贴法，粘附法， 浮选法，注射器采集法，土过筛法，庶糖密度梯度离 心法。
植物材料中真菌的分离：植入法，压贴法，洗涤法， 浸泡法。
水中真菌的分离：水样稀释后涂布分离。饵诱技术常 用于水中真菌的富集。
子实体直接分离培养担子菌：新采集的子实体组织植 入平板内或在放于液体培养基表面放一小块无菌滤纸 上培养。
1. 采样
（1）采样原则 广泛性 充分了解目标微生物的性质（种类、生理特征等）
如根据微生物的营养类型：
纤维素酶产生菌——森林土壤 蛋白酶和脂肪酶产生菌——肉类加工厂和饭店潲水沟中的污水、污泥 利用碳氢化合物为碳源的菌株——油田附近
极端菌的筛选要根据其特殊的生理特征：
高温酶产生菌——南方、温泉、火山爆发处及北方的肥堆 耐压菌——油井或海洋深处
真菌的分离筛选：以啤酒酵母的分离为例
稀释分离法
取发酵液少许以10倍稀释成10-1-10-7 取0.1ml 加入固体培养基铺平皿（×2）
在麦芽汁固体培养基上，25℃培养48-72h
形态筛选 根据正常株特点进行挑选，接种斜面备用
纯化，采用平板分离法进一步纯化，至少反复三次
性能测定
①生成子囊孢子速度测定 ②发酵力测定 ③热死温度测定 ④凝集力测定 ⑤双乙酰含量测定
第三节 发酵工业菌种分离和筛选
一、菌种的来源
根据资料直接向有科研单位、高等院校、工厂 或菌种保藏部门索取或购买；
从大自然中分离筛选新的微生物菌种。
从自然界筛选
二、新种分离与筛选的步骤
制定方案：首先要查阅资料，了解所需菌种的生长培养特性。 采样：有针对性地采集样品。 预处理：提高菌种分离的效率 富集培养：人为地通过控制养分或培条件，使所需菌种增殖培
2．植物体采集方法
在采集叶面时，一般是用灭菌的剪刀、打孔器、安 全刀片等，由几片新鲜叶片的同一部位切取一小块， 并注意不要损伤周围边缘。
选择叶面时应考虑叶位、叶龄、叶片正反面和在一 片叶上的取样部位。
采集植物根及根系时，方法与根际土样采集方法相 似。将洗净的根装入采样袋中，采集根系时，一般 与根际土样一起保存。
0.5mL的笨酚，室温下振荡30分钟，静止5分钟，取上清液用无菌水稀释 10倍。同时另取土样5g，不加热和笨酚处理，余步骤同上，作为对照。
（4）用移液管分别吸取原液和10倍稀释液各0.1ml标志稀释倍数的平板上， 涂抹均匀，倒置，28℃培养。
（5）培养10~14d，观察比较不同处理方法的生长情况、菌落特征。挑取红 色，无气生菌丝的小菌落以及其它菌落形态菌株接种斜面，进一步用于 形态观察和鉴定。
真菌分离
真菌分离
1、利用低碳／氮比的培养基可使真菌生长菌落分散， 利于计数，分离和鉴定。这里主要是利用营养成分 的减少而使生长减慢，并由此限制真菌的迁涉生长。
2、改变培养温度将有利于不同嗜温区真菌的分离。 3、有时真菌子实体形成必须有光线，这在分离培养
时应加以考虑。
4、选择性富集：是通过一定的方式使样本中一种或一群微 生物数量上的增加而利于分离的一种技术。
放线菌分离操作步骤
培养基添加重铬酸钾的方法减少细菌和真菌的数量
（1）取体积为300ml的高氏一号培养基，加入0.1%的重铬酸钾15mL，使之终 浓度为50ppm，摇匀，倒平板，待用。
用干热和苯酚处理减少链霉菌数量
（2）取土样5g，摊平于大号培养皿上，在恒温干燥箱中120℃干热处理1h。 （3）土样热处理后，加入装有45mL无菌水和少量玻璃珠的三角瓶中，加入
1、涂布的平板经培养后，如生长出菌落，则按涂布 不同稀释度的稀释液所得的单菌菌落和多菌菌落对 琼脂平板进行分类。
2、用无菌牙签将菌落转接到筛选平板上及转接至添 加有少量天然浸出液的适宜保藏琼脂斜面上。
3、筛选平板经培养后，按生长出菌落的形态学特征 如色素、菌落形态等进行最初分组。
4、将认为有希望的菌落用牙签转接到另一模拟分离 琼脂平板上进行筛选。
在不同水体的水样中加入一定的底物如蔗糖、多糖及蛋白 质等，同样可以促进水中微生物的增殖。
培养过程中可加入低浓度的抗真菌剂以抑制真菌的生长。 另一富集方法是在培养烧瓶中添加细菌“附着材料”，如