应用富含血小板血浆构建组织工程骨的研究

应用富含血小板血浆构建组织工程骨的研究目的探究富含血小板血浆（PRP）是否能成为接种骨髓间充质干细胞（BMSCs）于3D支架中的有效媒介，是否具有促进骨组织再生、新生骨成熟及血管化的作用，为组织工程骨的构建策略及动物实验和临床应用提供理论依据。

方法体外培养新西兰兔BMSCs至第三代作为种子细胞，分别应用PRP组、乏血小板血浆（PPP组）重悬BMSCs，双相接种法构建细胞/支架复合体，另设对照组，通过检测支架内DNA含量、碱性磷酸酶（ALP）含量，对比细胞的接种效率、增殖和分化情况。

结果PRP 组的成骨量较PPP组和对照组显著（P＜0.05）。

结论用PRP介导的双相接种法可以促进BMSCs在细胞/支架复合物中增殖并向成骨分化；PRP双相接种法是一种可行的构建组织工程骨的方法，具有很大的潜力和广阔的应用前景。

标签：组织工程骨；骨髓间充质干细胞；富含血小板血浆；3D-PLGA支架骨组织工程的核心在于“仿生”，即构建适合成骨的内环境，模拟自然成骨机制，实现骨移植物与宿主组织的生物学相容，在成骨的同时组织工程支架材料逐步降解成无毒害代谢物，移植物复合体最终被新生骨组织替代。

理想的组织工程骨应具有强大的骨诱导和血管生成潜能、生物学安全、低并发症、构建程序简便、使用寿命长等特征[1-2]。

目前的移植物尚未完全达到上述标准。

学者们在构建组织工程骨的尝试中，逐渐认识到细胞和生物活性因子的复合构建比单纯细胞或生物活性因子的构建成骨效果要好[3]。

在成骨系细胞的体外培养实验中，骨形态发生蛋白家族（Bmp）、血小板源生长因子（PDGF）、血管内皮生长因子（VEGF）、轉化生长因子（TGF）是已被证实的具有促进细胞增殖和诱导成骨作用的细胞因子[4-7]。

富含血小板血浆（platelets-rich plasma，PRP）是将全血离心后得到的血小板浓缩物，浓度通常为全血的4～6倍，其被凝血酶激活后，可以释放大量生长因子，如PDGF、TGF、VEGF、表皮生成长因子（EGF）、BMP等[8]。

因此，以PRP为媒介复合种子细胞构建组织工程骨理论上有如下优势：PRP源自宿主自体血浆，生物相容性好，不会产生免疫排斥反应；PRP在凝血酶激活下不仅可释放大量生物活性因子，凝血反应所引发的由液-固态转变过程有利于细胞黏附在支架上，提高种子细胞的接种效率[9]；PRP所含成分和血浆相似，在一定程度上模拟了细胞增殖分化的微环境[10]；提取PRP和添加凝血酶的过程较简单，实际应用上操作可行。

兔骨髓间充质干细胞（MSCs）是理想的种子细胞。

其有可以较容易地提取、具有强大的体外扩增能力和分化潜能、免疫排斥反应轻微等优点[11]。

为了探究PRP能否在组织工程骨支架材料上促进种子细胞的黏附、增殖、分化，本研究以MSCs为种子细胞设计了2个实验组，PRP组（MSCs+PRP+支架）和PPP组（MSCs+PPP+支架），另设一个空白对照组（MSCs+支架），比较MSCs的增殖和分化情况。

1 资料与方法1.1 实验动物新西兰白兔1只，2 月龄，体重2.0～2.5 kg，雄性，来源于山西医科大学实验动物中心，动物等级为清洁型。

1.2 主要实验试剂DMEM培养基（Low Glucose，Gibco）、胎牛血清（Hyclone）、β-甘油磷酸钠（10 mmol/L，Sigma）、L-抗坏血酸（50 μg/ml，Sigma）、地塞米松（10-8 mol/L，Sigma）、胰蛋白酶（0.25%，Sigma）、L-谷氨酰胺（Sigma）、青霉素-链霉素（100 U/ml）、TGF-β1（10 μg/L，Sigma）、吲哚美辛（50 μmol/L，Sigma）、IBMX（0.5 mmol/L，Sigma）、牛胰岛素（10 mg/L，来宝生物公司）、PBS缓冲液。

淋巴细胞分离液（Percoll，Sigma）、0.25%胰酶（Sigma）、枸橼酸葡萄糖抗凝剂ACD（0.48 g枸橼酸、1.32 g枸橼酸钠、1.47 g葡萄糖）、3D-PLGA支架、凝血酶溶液（10 000 U凝血酶，Sigma）、10%CaCl2（Sigma）、骨细胞消化液、小牛胸腺DNA标准液、碱性磷酸酶（ALP）试剂盒（南京建成生物工程研究所）、0.1%茜素红-Tris-HCl 染液、1%甲苯胺蓝染液、油红染液。

1.3 实验仪器超净工作台，高速低温离心机，孵箱，倒置相差显微镜，超声细胞破碎机，荧光酶标仪。

1.4 MSCs原代培养及传代于一只新西兰白兔无菌环境下用骨穿针抽取5 ml胫骨骨髓于10 ml注射器中（肝素钠溶液1000 U/ml预先润洗抗凝）。

将抽取的骨髓液注入15 ml离心管中，1000 r/min，离心5 min。

离心后可见液面上层淡黄色脂肪层。

抽弃位于最上层的脂肪层，将骨髓液注入预热的PBS缓冲液或DMEM培养基中，轻轻吹打混匀。

新鲜配制的Percoll淋巴细胞分离液10 ml，将混匀后的液体按等体积缓缓加入Percoll中，避免冲破液面。

2000 r/min离心，20 min。

吸出中间淡黄色单核细胞层，移至25 cm2培养瓶中，加入低糖DMEM 10 ml，其中含有10% FBS，100 U/ml青霉素-链霉素。

调整细胞接种密度1.0×104/ml，孵箱设定37℃，5%CO2，孵育1 d，半量换液，倒置显微镜观察细胞形态，继续孵育，第3天全量换液。

继续培养大约2周时，可见大量多角行及纺锤形细胞增殖，待细胞90%融合时，0.25%胰酶消化、收集细胞至15 ml离心管中，200×g离心10 min，弃上清液，DMEM重悬细胞团，以1.0×104/ml的密度接种于75 cm2培养瓶中，加入15 ml 培养基，37℃，5%CO2孵育，每3天换液一次。

细胞传代培养至第三代冻存于-80℃液氮瓶中，备用于MSCs细胞验证和细胞/支架复合体构建实验。

1.5 MSCs 细胞的验证1.5.1 成骨诱导分化及鉴定37℃水浴快速复苏第3代细胞，接种于6孔培养板，接种密度为1.0×104/ml，待细胞80%～90%融合时加入成骨诱导培养基（低糖全培养基中加入β-甘油磷酸钠10 mmol/L、L-抗坏血酸50 μg/ml、地塞米松10-8 mol/L）进行联合诱导培养，培养至14 d后，PBS冲洗2次，95%乙醇固定10 min，双蒸水冲洗3次。

0.1%茜素红-Tris-HCl（pH 8.3）37℃，30 min。

蒸馏水冲洗，干燥，封片。

倒置显微镜下观察染色结果。

1.5.2 成软骨诱导分化及鉴定细胞复苏及培养方法同上，待细胞80%～90%融合时加入成软骨诱导培养基（低糖全培养基中加入L-抗坏血酸50 μg/ml、地塞米松10-8 mol/L、TGF-β1 10 μg/L），培养至14 d后，用10%甲醛固定1 h，自来水冲15 min，蒸馏水洗一次，1%甲苯胺蓝染2～4 h。

加入95%乙醇，洗去多余的染液，倒置显微镜下观察。

1.5.3 成脂诱导分化及鉴定细胞复苏及培养方法同上，待细胞80%～90%融合时加入成脂诱导培养基（低糖全培养基中加入0.25 μmol/L地塞米松，50 μmol/L 吲哚美辛，0.5 mmol/L IBMX，10 mg/L牛胰岛素），诱导2周后，细胞经PBS洗涤，10%甲醛固定30 min，稀释油红储存液，油红∶去离子水=3∶2，滤纸过滤，室温放置10 min，染色10 min左右。

脱色，复染，甘油明胶封片。

倒置显微镜观察。

1.6 细胞/支架复合体构建1.6.1 PRP和PPP的制备配置抗凝劑ACD：0.48 g枸橼酸，1.32 g枸橼酸钠，1.47 g葡萄糖溶于100 ml双蒸水中，0.45 μm过滤消毒，冷藏备用。

于一只新西兰白兔心脏抽取全血40 ml，其中加入40 ml ACD，摇匀，移入50 ml离心管，1000 r/min离心15 min。

取上层血浆，弃红细胞，二次离心，3000 r/min离心20 min。

上层为清亮的PPP，移入另一个15 ml离心管中备用。

中间层为白色的血小板，轻轻用吸管搅动吸出移至另一离心管中，下层红细胞弃之。

用少量PPP 将血小板重悬，人工血小板计数，调节成浓度为106/μl的PRP备用。

1.6.2 支架的预处理3D-PLGA支架规格为100 mm×30 mm×3 mm，PLA∶PGA=75∶25。

空隙率为85%～90%，孔径大小100～300 μm。

用11号尖刀片将大块PLGA 切成长宽均为10 mm，厚3 mm的立方体。

将3D-PLGA小块浸泡于75%乙醇中24 h，PBS缓冲液反复漂洗3次，然后将其多余水分吸干，经预湿处理后，再滴加细胞悬液，以增加支架的亲水性。

1.6.3 构建细胞/支架复合体将上述支架分3组，分别为PRP、PPP、空白对照组，每组8个样本。

将第三代种子细胞MSCs低速离心后，PRP组采用成骨诱导培养基加PRP溶液重悬细胞，PPP组采用成骨诱导培养基加PPP溶液重悬细胞，空白对照组单纯采用成骨诱导培养基重悬细胞。

运用细胞计数法调整细胞密度至5.0×107/ml，制成高密度细胞悬液。

用微量移液枪吸取细胞悬液缓缓滴加于支架材料上，随即滴加0.05 ml凝血酶溶液（10 000 U凝血酶加入10%CaCl2中），做到不使细胞溢出，移入六孔板中，每孔5 ml诱导培养基，放置孵箱中，37℃，5%CO2，孵育1 h后，再次滴加细胞悬液于支架上，形成二次沉淀，以提高接种数量。

接种后48 h倒置显微镜下观察。

第3天半量换液，以后每隔2～3 d全量换液。

1.7 细胞/支架复合体DNA定量分析培养至第15天时，PBS缓冲液漂洗细胞/支架复合体2次，放入15 ml离心管中，剪成小块，加1 ml骨细胞消化液，37℃水浴2 h。

将消化混合液吸入15 ml 离心管，超声细胞破碎机处理5次，6 s/次，共30 s，离心200 r，5 min，取上清液待用。

上清液50 μl置于48孔黑色不透光酶标板内，每个样本2个副孔，每孔加150 μl Hoechst33258测试液（1 mg/ml），放入荧光酶标仪样品槽，震荡混匀30 s，选择激发波长360 nm，发射波长460 nm，以小牛胸腺DNA作标准曲线，测定样品的荧光强度。

1.8 细胞/支架复合体ALP活性定量分析取方法6中的上清液，用ALP试剂盒（中国南京建成生物工程研究所）定量测定ALP活性。

空白管加入双蒸水0.05 ml、缓冲液和基质液各0.5 ml，标准管加入0.05 ml 0.1 mg/ml酚标准应用液、缓冲液和基质液各0.5 ml，测定管加入0.05 ml血清、缓冲液和基质液各0.5 ml。