酶工程制药
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第2章第五节 酶工程制药技术基础
⒊化学合成法 采用合成仪进行酶的化学合成和人工合成 改造。 化学合成成本高。 只能合成化学结构清楚的酶。 应用在酶的化学修饰和人工模拟方面。
三、药用酶的修饰
酶的分子修饰：通过各种方法使酶分子的 结构发生改变，从而改变酶的某些特性和 功能的技术过程。 酶的变化：①提高生物学活性 ②增强稳定性 ③降低生物识别能力
第五节 酶工程制药技术基础
一、概述
酶工程是酶学和工程学相互渗透结合、发展 而成的生物技术，是通过人工操作获得人们 所需的酶，并通过各种方法使酶发挥其催化 功能的技术。 酶工程制药包括药用酶的生产和酶法制药。 药用酶是指具有治疗和预防疾病作用的酶。 酶法制药是在一定条件下利用酶的催化作用， 将底物转化为药物的技术过程。
酶修饰主要方法
⑴侧链集团的化学修饰 巯基的化学修饰
烷基化试剂：碘乙酸和碘乙酰胺，在发生羧甲基 化，防止半胱氨酸的降解。 N-乙基马来酰亚胺：专一性强并伴随光吸收的变 化，可以通过光吸收的变化确定反应的程度 5，5-二硫-2-硝基苯甲酸（DTNB) DTNB可以与巯基反应形成二硫键同时释放一个TNB 阴离子，可以通过光吸收监测反应的程度
修饰后，可导致蛋白质活性丧失，需要去除。去除时用强
碱进行处理。
⑵交联修饰
利用双功能试剂可以将不同的蛋白质连接在一起。
常用的方法是将双功能的接头与两个蛋白质分子
中的赖氨酸残基侧链相连接。
⑶定点突变与化学修饰结合法 基因突变技术是通过在基因水平上对其编 码的蛋白质分子进行改造，在其表达后用 来研究蛋白质结构功能的一种方法。 根据其特点，基因突变分为两类： 定点突变 区域定向突变
⒉酶的固定化方法
⑴吸附法 物理吸附和离子交换吸附。 条件温和，酶的构象变化小，酶与载体之间结合 力弱，易脱落。 ⑵包埋法 载体与酶溶液混合后，借助引发剂进行聚合反应， 通过物理作用将酶固定在载体的网格中。 不涉及酶的构象以及酶分子的化学变化，反应条 件温和，酶的回收率高。 扩散限制，催化反应受影响。
第6章 酶工程制药(二)
基因工程技术：通过基因工程技术对酶的基因进行改造和优化，提高酶的产量和稳定性
细胞培养技术：通过ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ胞培养技术，在细胞内高效表达酶，提高酶的生产效率
发酵工程技术：利用微生物发酵技术，通过优化发酵条件，提高酶的产量和纯度
蛋白质工程技术：通过蛋白质工程技术，对酶的蛋白质结构进行改造和优化，提高酶的活性 和稳定性
酶的提取：从生物材料中分 离和纯化酶的过程
提取和纯化的方法：沉淀法、 色谱法、电泳法等
提取和纯化的目的：获得高纯 度、高活性的酶，用于药物研
发和生产
微生物发酵法：通过微生物发酵产生酶，是最常用的生产方式 基因工程法：通过基因工程技术生产酶，具有更高的生产效率和特异性 化学合成法：通过化学合成方法生产酶，但成本较高且难以大规模生产 提取法：从动植物或微生物中提取酶，但提取量有限且成本较高
酶的化学修饰：通过化学方法对酶进行修饰，改变酶的性质和功能 单击此处输入你的项正文，文字是您思想的提炼，言简意赅的阐述观点。
酶的组合生物合成：通过组合生物合成技术，将不同酶的基因组合在一起， 形成具有新功能的酶
单击此处输入你的项正文，文字是您思想的提炼，言简意赅的阐述观点。
酶工程在疾病诊断中的应用
蛋白质工程：通过基因工程技术对 酶的蛋白质结构进行改造，提高酶 的催化效率和稳定性
蛋白质与小分子结合：通过将小分 子与酶结合，改变酶的活性和选择 性
添加标题
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蛋白质进化：利用进化算法对酶进 行优化，提高酶的适应性和催化效 率
蛋白质与蛋白质结合：通过将不同 的酶结合在一起，形成具有协同作 用的复合酶
酶作为药物的诊断工具：酶可以作为药物的诊断工具，通过催化特定的化学反应，产生信号或 标记，用于诊断疾病或监测治疗效果。
05—酶工程制药
一般健康人体内所含有的某些酶的量是
恒定在某一范围的。当人们患上某些疾病时， 则由于组织、细胞受到损伤或者代谢异常而引 起体内的某种或某些酶的活力发生相应的变化。 故此，可以根据体内某些酶的活力变化情况，
而诊断出某些疾病。
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（二）用酶测定体液中某些物质的变化诊断疾病：
人体在出现某些疾病时，由于代谢异常或者
在酶液中加入某些物质，使它与酶形成复合物而沉淀 下来 选择一定的条件使酶液中存在的某些杂质变性沉淀， 而不影响所需的酶
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复合沉淀法 选择性变性沉 淀法
三、酶的纯化
过滤与膜分离 电泳
离子交换层析
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第三节 酶和细胞的固定化
水溶性酶 水不溶性载体 固定化技术
水不溶性酶
（固定化酶）
酶应用过程中的一些不足
酶的基础知识
（一）酶是生物催化剂
酶是生物细胞产生的、具有催化能力的生物催 化剂。 催化高效性 专一性：结构专一性；立体异构专一性 酶具有不稳定性 反应条件温和
（二）酶的化学本质
单纯酶
酶 蛋白质 结合酶 辅酶 辅因子 辅基 （全酶）= 酶蛋白 + 辅因子 与酶蛋白结合得比较松的小分子有机物。 与膜蛋白结合得紧密的小分子有机物。
的一种。
多数是蛋白质水解酶，分解发炎部位纤维蛋白的
凝结物，消除伤口周围的坏疽、腐肉和碎屑。
其中有些酶能够分解脓液中的核蛋白使成简单的
嘌呤和嘧啶，降低脓液的粘性、达到净洁创口、
消除痴皮、排除脓液抗炎消肿的目的。
主要有胰蛋白酶、糜蛋白酶、双链酶，α-淀粉酶、
胰脱氧核糖核酸酶等。
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血凝和解凝类：这类酶都是从血液中提取出来的。
第六章酶工程制药
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B、微囊型：将酶或细胞包埋在高分子半透膜中。通常为直径几微米到几百微米 的球状体。颗粒比网格型要小得多，比较有利于底物与产物的扩散，但反应条件要 求高，制备成本也高。 （4）选择性热变性法：将细胞在适当温度下处理使细胞膜蛋白变性但不使酶变 性而使酶固定于细胞内的方法。此法专用于细胞固定化。
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(四)、固定化酶的形状与性质
1、固定化酶的形状 （1）颗粒状：包括酶铢、酶块、酶片、酶粉。每种固定化方法均可制 备颗粒状，方法简单，比表面积大，转化效率高，适用各种反应器。如酵母酶 铢。 （2）纤维状：三醋酸纤维素用适当的溶剂溶解后与酶混合，再用喷丝 的方法就可制成酶纤维。比表面积大，转化效率高，但只适用于填充床反应器。 此外，纤维酶可以织成酶布用于填充床反应器。 （3）膜状固定化酶：可通过共价结合的方法将酶偶联在滤膜上。也可 用其他方法制膜酶。酶膜比表面积大，渗透阻力小，可用于酶电极，破碎后也 可用于填充床。目前已有木瓜酶、葡萄糖氧化酶、过氧化物酶、脲酶等酶膜。
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• （二）固定化细胞的制备 • 1、固定化细胞的定义 • 将细胞限制或定位于特空间位置的 方法，是第二代固定化酶。
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2、固定化细胞的特点 （1）无需进行酶的分离纯化； （2）细胞保持酶的原始状态，固定化过程中酶的回收率高； （3）细胞内酶比固定化酶的稳定性高； （4）细胞内酶的辅因子可以自动再生； （5）细胞本身含多酶体系，可催化一系列反应 （6）抗污染能力强。 3、固定化细胞的制备技术 （1）载体结合法制备技术：将细胞悬浮液直接与水不溶性载体相结合。载 体主要为阴离子交换树脂、阴离子交换纤维素、聚氯乙烯。 优点：操作简单，符合细胞的生理条件，不影响细胞的生长及酶 活性。 缺点：吸附容量小结合强度低。 （2）包埋法制备技术：与包埋酶法相同。 （3）交联法制备技术：由于所用交联剂戊二醛等对细胞有毒性，一般很少 用。 （4）无载体法制备技术：靠细胞自身的絮凝作用制备固定化细胞的技术。 23 通过助凝剂或选择性热变性的方法实现细胞的固定化。缺点是机械强度差。
B、微囊型：将酶或细胞包埋在高分子半透膜中。通常为直径几微米到几百微米 的球状体。颗粒比网格型要小得多，比较有利于底物与产物的扩散，但反应条件要 求高，制备成本也高。 （4）选择性热变性法：将细胞在适当温度下处理使细胞膜蛋白变性但不使酶变 性而使酶固定于细胞内的方法。此法专用于细胞固定化。
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(四)、固定化酶的形状与性质
1、固定化酶的形状 （1）颗粒状：包括酶铢、酶块、酶片、酶粉。每种固定化方法均可制 备颗粒状，方法简单，比表面积大，转化效率高，适用各种反应器。如酵母酶 铢。 （2）纤维状：三醋酸纤维素用适当的溶剂溶解后与酶混合，再用喷丝 的方法就可制成酶纤维。比表面积大，转化效率高，但只适用于填充床反应器。 此外，纤维酶可以织成酶布用于填充床反应器。 （3）膜状固定化酶：可通过共价结合的方法将酶偶联在滤膜上。也可 用其他方法制膜酶。酶膜比表面积大，渗透阻力小，可用于酶电极，破碎后也 可用于填充床。目前已有木瓜酶、葡萄糖氧化酶、过氧化物酶、脲酶等酶膜。
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• （二）固定化细胞的制备 • 1、固定化细胞的定义 • 将细胞限制或定位于特空间位置的 方法，是第二代固定化酶。
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2、固定化细胞的特点 （1）无需进行酶的分离纯化； （2）细胞保持酶的原始状态，固定化过程中酶的回收率高； （3）细胞内酶比固定化酶的稳定性高； （4）细胞内酶的辅因子可以自动再生； （5）细胞本身含多酶体系，可催化一系列反应 （6）抗污染能力强。 3、固定化细胞的制备技术 （1）载体结合法制备技术：将细胞悬浮液直接与水不溶性载体相结合。载 体主要为阴离子交换树脂、阴离子交换纤维素、聚氯乙烯。 优点：操作简单，符合细胞的生理条件，不影响细胞的生长及酶 活性。 缺点：吸附容量小结合强度低。 （2）包埋法制备技术：与包埋酶法相同。 （3）交联法制备技术：由于所用交联剂戊二醛等对细胞有毒性，一般很少 用。 （4）无载体法制备技术：靠细胞自身的絮凝作用制备固定化细胞的技术。 23 通过助凝剂或选择性热变性的方法实现细胞的固定化。缺点是机械强度差。
酶工程制药
五、产酶菌株的制备和优化
1、产酶菌株的培养条件
2、菌种的分离筛选 3、菌种的变异诱导技术 4、原生质体诱导实际生产例子
1、产酶菌株的培养条件
（1）产酶促进剂 （2）影响酶产量的各种因素 （3）诱导剂和抑制剂
（1）产酶促进剂
在酶制剂的生产过程中，如果添加少量的某种物 质就能增加酶的产量，则这类物质就称为产酶 促进剂。 产酶促进剂多数是酶的诱导物、或者是表面活性 剂，常用的产酶促进剂有： （A）吐温-80 （B）脂肪酰胺磺酸钠 （C）聚乙烯醇 （D）糖脂 （E）乙二胺四乙酸（EDTA）
4、裂合酶 天冬氨酸-β -脱羧酶 β -酪氨酸酶 延胡索酸酶 谷氨酸脱羧酶 5、异构酶 氨基酸消旋酶 葡萄糖异构酶
（来源于细菌） （来源于细菌） （来源于细菌） （来源于细菌）
（来源于细菌、霉菌、酵母） （来源于细菌、放线菌
四、酶的生产菌种
1、对生产菌种的要求 （1）产酶量高、酶的性质应符合使用要求，最好是产 生胞外酶的微生物菌种 （2）不能含有致病菌，系统发育应该与病原体无关， 也不会产生毒素 （3）菌种稳定，不易产生变异退化，不易感染噬菌体 （4）能利用廉价的原料，发酵周期短，易于培养
第四章
酶工程制药
第一节 酶工程制药概论 第二节 药用酶的来源和生产
第三节 固定化酶工程
第四节 酶工程研究进展 第五节 酶工程应用实例
第一节 酶工程制药概论
一、酶的定义和分类 二、酶的特性 三、酶的来源 四、酶的生产菌种
五、产酶菌株的制备和优化
酶工程制药是将细胞或活细胞固定化后用于药 品生产的技术。 现代酶工程制药的基本技术主要包括酶和细胞 固定化、酶的非水相催化、酶法的手性药物合 成、酶的化学修饰技术
第七章 酶工程制药
酶由国际酶学委员会分为六大类： 氧化还原酶类、转移酶类、水解酶类、 裂合酶类、异构酶类、合成酶类。
二、酶工程简介 酶工程是酶学和工程学相互渗透结合发 展而形成一门新的技术学科。 它是从应用的目的出发研究酶、应用酶 的特异性催化功能，并通过工程化将相应 原料转化成有用物质的技术。
20世纪20年代初出现，当时主要是自然 酶制剂在工业上的大规模应用，1953年提 出固定化酶技术，1969年利用该技术成功 拆分了混旋氨基酸。 1971年第一届国际酶工程会议提出的酶 工程主要内容是：酶的生产、分离、纯化、 固定化、固定化的反应器、酶与固定化酶 的应用。
五、提高药用酶产量的措施 1、添加诱导物 诱导酶的发酵生产，在发酵培养基中添 加适当的诱导物，可使产Байду номын сангаас量显著提高。 乳糖诱导β -半乳糖苷酶，纤维二糖诱 导纤维素酶。 诱导物可分为三种：酶的作用底物、酶 的反应产物、酶的底物类似物。
2、控制阻遏物浓度 有些酶的合成受到阻遏物的阻遏作用， 应设法解除阻遏作用来提高酶的产量。 3、添加表面活性剂 表面活性剂的离子型对细胞有毒害作用， 只能使用非离子型表面活性剂， 表面活性剂可聚集在细胞膜上，增加细 胞通透性，有利于酶的分泌，可增加酶的 产量。
酶和细胞固定化模式
4、酶和细胞的固定化载体 （1）吸附载体：（物理吸附、离子吸附）矾 土、膨润土、活性炭、氧化铝、纤维素、 碳酸钙等。 （2）包埋载体：卡拉胶、海藻胶等。 （3）共价结合载体：纤维素、琼脂、聚丙烯 酰胺等。
5、固定化酶制备技术 （1）吸附法制备固定化酶技术 （2）包埋法制备固定化酶技术 ①界面沉降法；②界面聚合法 （3）交联法制备固定化酶技术 （4）共价结合法制备固定化酶技术
第七章
第一节 第二节 第三节 第四节 第五节
第4讲酶工程制药技术1
从猪心中提取辅酶Q10，从槐花米中提取芦丁， 从提取链霉素后的废液中提取B12等。
维生素C的生产工艺
❖ VC是细胞氧化-还原反应中的催化剂，参与机体 新陈代谢，增加机体对感染的抵抗力。用于防止 坏血酸和抵抗传染性疾病，促进创伤和骨折愈合， 以及用作辅助药物治疗。
VC化学结构和性质
白 色 粉 末 ， 无 臭 、 味 酸 、 熔 点 190192℃，易溶于水，略溶于乙醇，不溶 于乙醚，氯仿及石油醚等。它是一种还 原剂，易受光、热、氧等破坏，尤其在 碱液中或有微量金属离子存在时，分解 更快，但干燥结晶较稳定。
❖ 又称为连接酶，能够催化一切必须与ＡＴＰ分解 相偶联的，并由两种物质合成一种物质的反应。
❖ A + B + ATP + H-O-H → A3/4B + ADP +Pi
核酸类酶（R酶）的分类与命名
❖ 核酸类酶的分类原则
❖ （1）根据酶作用的底物是其本身RNA分子还是 其他分子，将核酸类酶分为分子内催化R酶和分 子间催化R酶两大类。
❖ （2）在每个大类中根据酶的催化类型不同，将 R酶分为若干亚类。
1、分子内催化R酶
❖ 分子内催化酶是催化本身RNA分子进行反应的一 类核酸类酶。
❖ （1）自我剪切酶：在一定条件下催化本身RNA 分子进行剪切反应的R酶。它们都是RNA前体， 可以在一定条件下进行自我催化，使RNA前体生 成成熟的RNA分子和另一个RNA片断。
蛋白类酶（P酶）的分类
❖ 根据酶的催化作用类型，将已知蛋白类酶分为六 大类：
❖ （1） 氧化还原酶类 ❖ （2） 转移酶类 ❖ （3） 水解酶类 ❖ （4） 解（合）酶类 ❖ （5） 异构酶类 ❖ （6） 合成酶类
❖ （1） 氧化还原酶类
维生素C的生产工艺
❖ VC是细胞氧化-还原反应中的催化剂，参与机体 新陈代谢，增加机体对感染的抵抗力。用于防止 坏血酸和抵抗传染性疾病，促进创伤和骨折愈合， 以及用作辅助药物治疗。
VC化学结构和性质
白 色 粉 末 ， 无 臭 、 味 酸 、 熔 点 190192℃，易溶于水，略溶于乙醇，不溶 于乙醚，氯仿及石油醚等。它是一种还 原剂，易受光、热、氧等破坏，尤其在 碱液中或有微量金属离子存在时，分解 更快，但干燥结晶较稳定。
❖ 又称为连接酶，能够催化一切必须与ＡＴＰ分解 相偶联的，并由两种物质合成一种物质的反应。
❖ A + B + ATP + H-O-H → A3/4B + ADP +Pi
核酸类酶（R酶）的分类与命名
❖ 核酸类酶的分类原则
❖ （1）根据酶作用的底物是其本身RNA分子还是 其他分子，将核酸类酶分为分子内催化R酶和分 子间催化R酶两大类。
❖ （2）在每个大类中根据酶的催化类型不同，将 R酶分为若干亚类。
1、分子内催化R酶
❖ 分子内催化酶是催化本身RNA分子进行反应的一 类核酸类酶。
❖ （1）自我剪切酶：在一定条件下催化本身RNA 分子进行剪切反应的R酶。它们都是RNA前体， 可以在一定条件下进行自我催化，使RNA前体生 成成熟的RNA分子和另一个RNA片断。
蛋白类酶（P酶）的分类
❖ 根据酶的催化作用类型，将已知蛋白类酶分为六 大类：
❖ （1） 氧化还原酶类 ❖ （2） 转移酶类 ❖ （3） 水解酶类 ❖ （4） 解（合）酶类 ❖ （5） 异构酶类 ❖ （6） 合成酶类
❖ （1） 氧化还原酶类
第五章 酶工程制药技术
抗炎净创类：目前在治疗上发展最快。 多数为蛋白水解酶，分解发炎部纤维蛋白的凝结物，
消除伤口周围坏疽、腐肉和碎屑。 有些可以分解脓液中核蛋白，达到净洁创口、消炎
目的。 主要有胰蛋白酶、糜蛋白酶、双链酶。
➢ 血凝和解凝类：这类从血液中提取。 凝血酶 使血液凝固，防止微血管出血
纤维蛋白溶解酶 溶解血块，治疗血栓静脉炎、 冠状动脉栓塞。
➢ 作用力：离子键
➢ 常用载体：DEAE-纤维素、DEAE-葡聚糖 凝胶、CM-纤维素
优点：条件温和，操作简便，酶活力损 失少。
缺点：结合力弱，易解吸附。
➢ 2.共价偶联法
借助共价键将酶 的活性非必需侧 链基团和载体的 功能基团进行偶 联。
➢ （1）载体：亲水载体优于疏水载体
如:天然高分子衍生物:
➢ （3）水解酶：
催化由水分子介入使基质共价键水解反应，切断键有酯键、糖苷键、醚键、 肽键。
➢ （4）裂解酶：
催化用水解以外的方法使原子团和基质分离，在基质上生成双键反应，
➢ （5）异构酶：
催化不伴有基质分子水解、转移、氧化还原的分子异构反应。
➢ （6）连接酶：
催化将ATP或类似三磷酸化合物的焦磷酸键切断，使连个分子连接反应。
第五章 酶工程制药技术
重点内容：酶固化技术；
第一节 酶工程概述
➢ 一、酶工程简介（Enzyme Engineering） 酶工程是酶学和工程学相互渗透结合和
发展而成的一门新的技术学科。它是从应 用的目的出发研究酶、应用酶的特殊催化 性能，并通过工程化将相应原料转化成有 用物质的技术。
➢ 酶工程这个名字出现在20世纪20年代，主 要指自然酶制剂在工业上的规模应用。
纤维素
葡聚糖凝胶
消除伤口周围坏疽、腐肉和碎屑。 有些可以分解脓液中核蛋白，达到净洁创口、消炎
目的。 主要有胰蛋白酶、糜蛋白酶、双链酶。
➢ 血凝和解凝类：这类从血液中提取。 凝血酶 使血液凝固，防止微血管出血
纤维蛋白溶解酶 溶解血块，治疗血栓静脉炎、 冠状动脉栓塞。
➢ 作用力：离子键
➢ 常用载体：DEAE-纤维素、DEAE-葡聚糖 凝胶、CM-纤维素
优点：条件温和，操作简便，酶活力损 失少。
缺点：结合力弱，易解吸附。
➢ 2.共价偶联法
借助共价键将酶 的活性非必需侧 链基团和载体的 功能基团进行偶 联。
➢ （1）载体：亲水载体优于疏水载体
如:天然高分子衍生物:
➢ （3）水解酶：
催化由水分子介入使基质共价键水解反应，切断键有酯键、糖苷键、醚键、 肽键。
➢ （4）裂解酶：
催化用水解以外的方法使原子团和基质分离，在基质上生成双键反应，
➢ （5）异构酶：
催化不伴有基质分子水解、转移、氧化还原的分子异构反应。
➢ （6）连接酶：
催化将ATP或类似三磷酸化合物的焦磷酸键切断，使连个分子连接反应。
第五章 酶工程制药技术
重点内容：酶固化技术；
第一节 酶工程概述
➢ 一、酶工程简介（Enzyme Engineering） 酶工程是酶学和工程学相互渗透结合和
发展而成的一门新的技术学科。它是从应 用的目的出发研究酶、应用酶的特殊催化 性能，并通过工程化将相应原料转化成有 用物质的技术。
➢ 酶工程这个名字出现在20世纪20年代，主 要指自然酶制剂在工业上的规模应用。
纤维素
葡聚糖凝胶
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二、固定化细胞的制备
2.固定化细胞的特点
3.固定化细胞的制备技术
三、固定化方法与载体的选择
1.固定化方法的选择
2.载体的选择
四、固定化酶（细胞）的性质与指标
第三节 固定化酶和固定化细胞的反 应器
第七节 制造实例
第六章 酶工程制药
第二节 酶和细胞的固定化
一、ห้องสมุดไป่ตู้定化酶的制备
3.酶的固定化方法与制备技术
• 4.酶和细胞的固定化载体 • 载体满足的条件：固定化过程中不引起酶 变性；对酸碱有一定的耐受性；有一定的 机械强度；有一定的亲水性及良好的稳定 性；有一定的疏松网状结构，颗粒均匀； 共价结合时具有可活化基团；有耐受酶和 微生物细胞的能力；廉价易得。