细胞组织裂解(提蛋白)方法
蛋白质提取操作流程(细胞裂解)
蛋白质提取操作流程(细胞裂解)蛋白质提取操作流程（细胞裂解）
概述
细胞裂解是一种常用的方法，用于从生物样本中提取蛋白质。
本文档介绍了蛋白质提取的操作流程。
材料
- 细胞样品
- 细胞裂解缓冲液
- 蛋白酶抑制剂
- 蛋白质稳定剂
- 超声波处理设备
- 冷冻离心机
步骤
1. 将冷冻的细胞样品取出并迅速转移到冰上。
2. 加入适量的细胞裂解缓冲液，并配制成细胞样品的适当浓度。
3. 加入蛋白酶抑制剂和蛋白质稳定剂，以保护蛋白质的完整性
和稳定性。
4. 将样品放入超声波处理设备中，进行超声波处理，用于破碎
细胞并释放蛋白质。
5. 将超声波处理后的样品置于冷冻离心机中，以去除细胞碎片
和残余的细胞组分。
6. 将离心后的上清液收集，并继续进行后续的蛋白质提取实验。
7. 根据实验需要可以进一步对蛋白质进行纯化、浓缩和分析等
处理。
注意事项
- 在细胞裂解过程中，应确保样品保持在低温环境下，以避免
蛋白质的降解和失活。
- 在超声波处理过程中，应注意操作时间和功率，以免对蛋白
质造成过度破坏。
- 细胞裂解缓冲液的选择应根据实验需求和细胞类型进行优化。
- 在蛋白质提取过程中，应避免受到外部污染和杂质的影响，
以保证提取到高质量的蛋白质样品。
总结
本文档介绍了蛋白质提取的操作流程，包括细胞裂解、超声波
处理和离心等步骤。
正确的操作方法和注意事项对于获得高质量的
蛋白质样品至关重要。
提蛋白质的原理及步骤
蛋白质提取是一项基础实验，通常用于从组织或细胞中提取纯度较高的蛋白质样品，以便进行各种蛋白质研究。
常规的蛋白质提取步骤包括以下几个主要步骤：
1. 细胞或组织的裂解：将待提取的样品裂解以释放出蛋白质。
裂解方法取决于被裂解的细胞类型，可使用机械法、化学法、超声波或高压等方法进行裂解。
2. 蛋白质的分离：将蛋白质与非蛋白质组分进行分离，常用的方法有沉淀、过滤、离心和柱层析等。
3. 蛋白质的纯化：通过进一步的分离和纯化来获得高纯度的蛋白质。
这些步骤通常需要进行多次，每次都使用不同的方法来分离和纯化蛋白质。
提蛋白质的原理是基于蛋白质的化学和物理特性进行分离和纯化。
蛋白质分子量大小、电荷、亲水性等特性不同，容易与不同化学试剂、柱层析介质或生物酶相互作用。
通过调节这些条件和步骤，就可以使不同的蛋白质与其它组分分离出来，并得到纯度较高的蛋白质样品。
虽然蛋白质提取步骤较多，但因为各种蛋白质的特性不同，所以实验时需要根据需要选择不同的提取和分离方法以获得更理想的效果。
蛋白提取实验步骤
蛋白提取实验步骤：1、细胞总蛋白提取A、对于悬浮细胞: 离心收集细胞，每106细胞加250 ul RIPA （在使用前数分钟内加入蛋白酶抑制剂），振荡。
如果需要提高蛋白浓度，可以适当减少细胞总蛋白提取试剂体积。
B、对于贴壁细胞:a、用TBS冲洗细胞2-3次。
最后一次彻底吸干残留液。
b、加入适当体积的 RIPA（使用前数分内加入蛋白酶抑制剂）于培养板、瓶内3-5分钟。
期间反复晃动培养板、瓶，使试剂与细胞充分接触。
c、用细胞刮刀将细胞及试剂刮下，收集到1.5ml离心管中。
C、冰浴30min，期间用移液器反复吹打，确保细胞完全裂解。
D、12000g离心5min，收集上清，即为总蛋白溶液。
2、组织蛋白提取：A、组织块用冷TBS洗涤2-3次，去除血污，剪成小块置于匀浆器。
加入10倍组织体积本试剂（使用前数分钟内加入蛋白酶抑制剂）冰上彻底匀浆。
如果需要提高蛋白浓度，可以适量减少该试剂体积。
B、将匀浆液转移至1.5ml离心管中，振荡。
冰浴30min，期间用移液器反复吹打，确保细胞完全裂解。
C、12000g离心5min，收集上清，即为总蛋白溶液。
1、组织尽可能新鲜，若不能及时提蛋白，组织标本应保存在-80℃冰箱，并避免反复冻融。
2、全程必须在冰上进行，避免蛋白降解。
3、蛋白酶抑制剂在水溶液中不稳定，需在RIPA使用前数分钟加入蛋白酶抑制剂。
4、裂解过程中如有溶液粘稠现象可用移液器（200μl）反复吹打，或再加入适量裂解液以保证充分裂解。
5、总蛋白溶液不稳定（蛋白酶依旧有活性）可在-80℃短时间保存，建议立即加入蛋白上样缓冲液变性后与-20℃保存，避免反复冻融。
组织蛋白提取步骤
组织蛋白提取步骤概述组织蛋白提取是一种重要的实验操作，用于研究生物体中的蛋白质组成和功能。
在这篇文章中，我们将深入探讨组织蛋白提取的步骤和方法。
准备工作在进行组织蛋白提取之前，需要进行一些准备工作，以确保实验的顺利进行。
1. 选择合适的组织样本选择合适的组织样本非常重要。
样本的选择应基于研究的目的和问题。
常用的组织样本包括肝脏、肾脏、心脏等。
2. 通过冰冻保存样本在进行组织蛋白提取之前，将组织样本冰冻以保持其蛋白质的完整性和稳定性。
样本应在-80°C的低温下保存。
3. 研磨组织样本在进行提取之前，将组织样本研磨以释放蛋白质。
可以使用试管中的研磨棒、液氮或机械研磨仪等方法进行研磨。
组织蛋白提取步骤下面将详细介绍组织蛋白提取的具体步骤。
1. 组织样本溶解首先，将冷冻的组织样本迅速解冻放入冷蛋白提取缓冲液中。
缓冲液的选择应根据研究的目的而定。
可以选择含有各种缓冲剂（如Tris-HCl和EDTA）和蛋白酶抑制剂的缓冲液。
2. 组织样本裂解接下来，需要将组织样本裂解，以使细胞膜破裂并释放细胞内容物。
可以通过以下方法进行组织样本的裂解： - 超声波裂解：使用超声波处理器将样本暴露在高频超声波中，以破裂细胞膜。
- 高压裂解：使用高压细胞破碎机将样本加压，使其破裂。
- 液氮冻融：将样本在液氮中冷冻并迅速解冻，通过重复操作破裂细胞膜。
3. 蛋白质提取在组织样本裂解后，可以使用离心等方法将细胞碎片与蛋白质分离。
主要的提取方法包括： - 离心：将组织样本在高速离心中离心，并采集上清液中的蛋白质。
- 柱层析：利用蛋白质的性质，将蛋白质从样本中提取出来。
- 倒置电泳：利用电泳的原理，将蛋白质从样本中分离。
4. 蛋白质的定量和分析最后，对提取得到的蛋白质进行定量和分析。
常用的方法包括： - 低丰度蛋白质的富集：通过使用富集柱等方法将低丰度蛋白质从样本中提取出来。
- SDS-PAGE：使用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质，并通过染色等方法进行定性或定量分析。
wb蛋白提取步骤
wb蛋白提取步骤WB蛋白提取步骤引言：WB蛋白提取是一种常用的实验技术，用于研究蛋白质的表达及其相互作用。
本文将详细介绍WB蛋白提取的步骤，包括细胞裂解、蛋白质提取、浓缩和检测等关键步骤。
一、细胞裂解细胞裂解是WB蛋白提取的第一步，旨在破坏细胞膜、细胞核膜以及其他细胞组分，释放出目标蛋白质。
常用的细胞裂解方法有机械法、化学法和生物学方法等。
其中，最常用的方法是使用细胞裂解缓冲液，通过冷冻-解冻或超声波等方式破坏细胞结构。
二、蛋白质提取蛋白质提取是WB蛋白提取的关键步骤之一。
在细胞裂解后，目标蛋白质以及其他细胞组分被释放到裂解液中。
为了提取目标蛋白质，需要将裂解液进行离心，分离出上清液。
上清液中含有目标蛋白质，可以用于后续的蛋白质浓缩和检测。
三、蛋白质浓缩蛋白质浓缩是WB蛋白提取的重要步骤之一，旨在提高目标蛋白质的浓度，便于后续的蛋白质检测。
常用的蛋白质浓缩方法有醋酸沉淀法、酒精沉淀法和尿素沉淀法等。
在浓缩过程中需要注意控制温度和pH值，以避免蛋白质的降解和聚集。
四、蛋白质检测蛋白质检测是WB蛋白提取的最后一步，用于确定提取的蛋白质是否含有目标蛋白以及其相对丰度。
常用的蛋白质检测方法有SDS-PAGE和免疫印迹等。
其中，SDS-PAGE是一种分离蛋白质的电泳方法，可以根据蛋白质的分子量将其分离成不同的条带；免疫印迹则是通过特异性抗体与目标蛋白质结合，然后使用酶标记的二抗进行检测。
总结：WB蛋白提取是一种重要的实验技术，用于研究蛋白质的表达及其相互作用。
其步骤包括细胞裂解、蛋白质提取、蛋白质浓缩和蛋白质检测等。
通过合理选择和操作这些步骤，可以获得高质量的蛋白提取物，为后续的蛋白质研究提供可靠的基础。
参考文献：[1] Bustin SA, Benes V, Garson JA, et al. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clin Chem. 2009;55(4):611-622.[2] Towbin H, Staehelin T, Gordon J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc Natl Acad Sci U S A.1979;76(9):4350-4354.[3] Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989.。
蛋白提取实验步骤
蛋白提取实验步骤:1、细胞总蛋白提取A对于悬浮细胞：离心收集细胞，每106细胞加250 Ul RlPA （在使用前数分钟内加入蛋白酶抑制剂），振荡。
如果需要提高蛋白浓度，可以适当减少细胞总蛋白提取试剂体积。
B对于贴壁细胞：a用TBS冲洗细胞2-3次。
最后一次彻底吸干残留液。
b加入适当体积的RIPA （使用前数分内加入蛋白酶抑制剂）于培养板、瓶内3-5分钟。
期间反复晃动培养板、瓶，使试剂与细胞充分接触。
c、用细胞刮刀将细胞及试剂刮下，收集到1.5ml离心管中。
C冰浴30min，期间用移液器反复吹打，确保细胞完全裂解。
D 12000g离心5min,收集上清，即为总蛋白溶液。
2、组织蛋白提取：A组织块用冷TBS洗涤2-3次，去除血污，剪成小块置于匀浆器。
加入10倍组织体积本试剂（使用前数分钟内加入蛋白酶抑制剂）冰上彻底匀浆。
如果需要提高蛋白浓度，可以适量减少该试剂体积。
B将匀浆液转移至1.5ml离心管中，振荡。
冰浴30min,期间用移液器反复吹打，确保细胞完全裂解。
C 12000g离心5min,收集上清，即为总蛋白溶液。
1、组织尽可能新鲜，若不能及时提蛋白，组织标本应保存在-80 C 冰箱，并避免反复冻融。
2、全程必须在冰上进行，避免蛋白降解。
3、蛋白酶抑制剂在水溶液中不稳定，需在RIPA使用前数分钟加入蛋白酶抑制剂。
4、裂解过程中如有溶液粘稠现象可用移液器（200 μ l ）反复吹打，或再加入适量裂解液以保证充分裂解。
5、总蛋白溶液不稳定（蛋白酶依旧有活性）可在-80 C短时间保存，建议立即加入蛋白上样缓冲液变性后与-20 C保存，避免反复精品佳作，安心下载，放心使用冻融。
遇到失意伤心事，多想有一个懂你的人来指点迷津，因他懂你，会以我心，换你心，站在你的位置上思虑，为你排优解难。
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裂解液提蛋白说明书
RIPA裂解液(强)提蛋白(2007-07-18 11:31:26)转载▼对于培养细胞样品：1. 融解RIPA裂解液，混匀。
取适当量的裂解液，在使用前数分钟内加入PMSF，使PMSF的最终浓度为1mM。
2. 对于贴壁细胞：去除培养液，用PBS、生理盐水或无血清培养液洗一遍(如果血清中的蛋白没有干扰，可以不洗)。
按照6孔板每孔加入150-250微升裂解液的比例加入裂解液。
用枪吹打数下，使裂解液和细胞充分接触。
通常裂解液接触细胞1-2秒后，细胞就会被裂解。
对于悬浮细胞：离心收集细胞，用手指把细胞用力弹散。
按照6孔板每孔细胞加入150-250微升裂解液的比例加入裂解液。
再用手指轻弹以充分裂解细胞。
充分裂解后应没有明显的细胞沉淀。
如果细胞量较多，必需分装成50-100万细胞/管，然后再裂解。
3. 充分裂解后，10000-14000g离心3-5分钟，取上清，即可进行后续的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。
注：裂解液用量说明：通常6孔板每孔细胞加入150微升裂解液已经足够，但如果细胞密度非常高可以适当加大裂解液的用量到200微升或250微升。
对于组织样品：1. 把组织剪切成细小的碎片。
2. 融解RIPA裂解液，混匀。
取适当量的裂解液，在使用前数分钟内加入PMSF，使PMSF的最终浓度为1mM。
3. 按照每20毫克组织加入150-250微升裂解液的比例加入裂解液。
(如果裂解不充分可以适当添加更多的裂解液，如果需要高浓度的蛋白样品，可以适当减少裂解液的用量。
)4. 用玻璃匀浆器匀浆，直至充分裂解。
5. 充分裂解后，10000-14000g离心3-5分钟，取上清，即可进行后续的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。
6. 如果组织样品本身非常细小，可以适当剪切后直接加入裂解液裂解，通过强烈vortex使样品裂解充分。
然后同样离心取上清，用于后续实验。
直接裂解的优点是比较方便，不必使用匀浆器，缺点是不如使用匀浆器那样裂解得比较充分。
蛋白提取步骤
蛋白提取步骤准备裂解液、蛋白酶抑制剂。
1、取2mlEP管加入500ul裂解液（已加入蛋白酶抑制剂）2、取0.1g组织，充分剪碎后加入研磨器中，加入适量液氮，将组织研成粉末状。
3、将研磨后的组织转至加有裂解液的2mlEP管中。
4、冰上超声（超声3s，停6s）共计20个循环，30%能量。
5、冰上静置30min，每10min震荡1次。
6、12000rpm，4℃离心30min。
7、收集上清，测浓度后-70℃保存。
8、煮蛋白时加5微升上样缓冲液。
2．培养的细胞（定量）：⑴去培养液后用温的PBS冲洗2~3遍（冷的PBS有可能使细胞脱落）。
⑵加入适量的冰预冷的裂解液后置于冰上10~20min。
⑶用细胞刮刮下细胞，收集在EP管后超声（100~200w）3s，2次。
⑷12000g离心，4℃，2min。
⑸取少量上清进行定量。
⑹将所有蛋白样品调至等浓度，充分混合沉淀后加loading buffer后直接上样最好，剩余溶液（溶于1×loading buffer）可以低温储存，-70℃一个月，-20℃一周，4℃1~2天，每次上样前98℃，3min。
3．组织：⑴匀浆对于心肝脾肾等组织可每50~100mg加1ml裂解液，肺100~200mg加1ml 裂解液。
可手动或电动匀浆。
注意尽量保持低温，快速匀浆。
⑵ 12000g离心，4℃，2min。
⑶取少量上清进行定量。
⑷将所有蛋白样品调至等浓度，充分混合沉淀加loading buffer后直接上样最好，剩余溶液（溶于1×loading buffer）可以低温储存，-70℃一个月，-20℃一周，4℃ 1~2天，每次上样前98℃，3min。
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第一种方法蛋白匀浆缓冲液：50 mM Tris-HCl (pH7.5) 150 mM NaCl5 mM EDTA1 % NP-40 1 mM PMSF操作步骤直接用这个进行组织匀浆然后于10000 rpm 离心20分钟收集上清作SDS－PAGE电泳从染色的情况来看所得到的总蛋白纯度都不错条带比较清晰。
我是作的小鼠八种常规组织也包括肾脏在内。
将抽提好的蛋白分装后直接放在负八十保存。
上样大概3~8ul每孔都可以的具体看个人需要。
70v浓缩，150v分离第二种方法裂解液配方：尿素：8M CHAPS:4% DTT:65mM(现加）PMSF:1mM(现加）MiliQ 水操作步骤：取300mg样品在液氮环境下研磨，加入1ml裂解液混匀，室温静置1小时（实验证明改为匀浆更好，蛋白降解轻），15000g离心1小时，取上清测定蛋白质浓度。
在裂解液中加IPG buffer有两个作用:1,增强蛋白质的溶解性2,可以结合核酸,在沉淀的时候予以除去。
建议最好加，浓度从0.5-2%不等（这取决于您样品蛋白质的难溶程度）。
IPG buffer 是载体两性电解质，IPG buffer另外一个作用是促进蛋白质溶解的,所以IEF前一定要加，裂解液中没有IPG buffer可以么？（可以的，最后上胶条的时候可以再加）不过，我觉得液氮研磨以后，最好是粗离心一下，把一些结缔组织给离心掉（150g既可）然后再加裂解液。
裂解液加1ML应该没什么问题，主要取决你以后蛋白的浓度。
用这个方法最好经丙酮沉淀一次比较好）第三种方法建议最好加完裂解液后再用超声波破碎，我做肝脏蛋白提取时一般采取400W工作10秒，间歇10秒，次数15次，一次结束后大约30分钟再重复上述步骤一次（因为不同的样品用一根超声柱子，可能会导致污染，所以一定要用双蒸水冲洗干净，再用70%乙醇洗一下，再用水洗一次），另外样品超声时要置于冰浴中，以免产热做过的是用10ml蛋白裂解液来匀浆3克的组织，最终用考马斯亮兰染色法测得的蛋白浓度大概为30~50 ug/ul测595 OD值时，设定一个只用水的空白，把所有测得的值都减去这个空白。
再用减后的值做标准曲线。
查得未知蛋白浓度时，也要用减后的值在标准曲线上查得。
培养细胞细胞培养于100 mL/L FCS+RPMI1640培养基中，待生长至对数生长期密度约为80%时用细胞括括下细胞离心收集．按细胞/裂解液体积比1:10加入细胞裂解液(7 mol/L尿素，2 mol/L硫脲，40 g/LCHAPS，65 mmol/L DTT)，同时加入 1 mmol/L苯甲基磺酰氟(Phenylmethylsufosyl，PMSF)，旋涡振荡，反复液氮快速冻融4次，加DnaseⅠ50 mg/L和Rnase A 25 mg/L室温作用15 min，4°C 15 000 g离心1 h，收集上清液-80°C冻存备用，Bradford法测定蛋白浓度[17]．第四种方法哺乳动物组织一般采用机械分散法：1 取脑组织称重，研钵预冷，边加液氮边研磨，至非常细小的干粉。
2 0℃PBS洗剂组织碎片，4℃3000g离心5分钟，估算离心管底部沉淀物的体积。
3 在5倍组织体积预冷的悬浮缓冲液中迅速用镊子分开或用剪刀剪碎组织碎片（最好加用蛋白酶抑制剂），大多数哺乳动物组织可以在悬浮缓冲液液面之下迅速用剪子分开或用用剪刀剪碎.悬浮缓冲液：0.1mol/L NaCl0.01mol/L Tris Cl (PH 7.6)0.001mol/L EDTA (PH8.0)1ηg/ml Aprotinin100ηg/ml 苯甲基磺酰氟（PMSF）4 尽快加入等体积的2×SDS凝胶加样缓冲液。
5 样品置于沸水浴中加热10分钟。
6 采用带有浸入尖头或能在冷却杯中同时处理多个样品的超声处理仪对DNA进行剪切。
以最大功率处理0.5—2分钟一般能有效将裂解液粘度降至可控水平。
7 室温10,000g将样品离心10分钟，取上清。
8 计算使用Western法检测靶蛋白所需样品量。
在细胞总提取液中加入已知量的靶蛋白同时进行Western blotting检测，可为分析未知样品提供阳性对照，并可精确估计采用所选抗体时该法的灵敏度。
可否换成DNase 1 和RNase A? 可省去超声操作我也是一名初学者，我将要做的是大鼠脑膜蛋白的抽提。
我拿到的裂解液的配方如下:1% SDS40 mM Tris65 mM DTT(现加）ddH2O而且在匀浆后，似乎还需要加入50ug/ml RNase和200ug/ml DNase,在4℃放置15min;1 5000离心1h.取上清。
我想请诸位高手指点一下，上面的配方和步骤中有无欠妥之处。
谢谢！你的配方较适合水溶性蛋白的提取。
8M尿素的加入能使膜蛋白更多地溶解，现在很多文献提倡用7M尿素，2M硫脲提取膜蛋白。
另外CHAPS、TritonX100、NP40等去垢剂的使用是否也要考虑？还有提取蛋白以后的下一步将做什么也很重要，如果是做IEF则最好不要用SDS，这会影响等电点，如果还要做DIGE的话，在标记荧光以前不能加DTT，标好后可以加1．IPG buffer是载体两性电解质2．WB时loading buffer 里DTT和巯基乙醇的作用？都是还原剂，防止二硫键形成3．PAGE 上样buffer中为什么要加DTT？作用是什么？？DTT能增加杂质的溶解，最主要的是DTT起还原剂的作用，用来打开肽内或肽间的二硫键，促进蛋白的完全溶解。
还是加的好。
加入DTT可打开二硫键，基本成线性结构；非还原状态下，二硫键未被破坏，蛋白中由二硫键形成的双体（如抗体的轻重链）或二级结构不能打开，有时样品会出现沉淀现象。
在进行WESTERN BLOT实验时，有的抗体识别非还原状态的条带，但不识别还原态下的蛋白条带，就是由于非还原状态下还保持了一定的空间表位，这在有些抗体的WB鉴定中很重要。
所以你的SDS－PAGE是否加DTT还是取决于你实验的目的。
4．做SDS-PAGE 电泳前,一定要把原核表达后的蛋白煮沸几分钟吗煮蛋白的作用是让蛋白充分变性，这样才能使蛋白在SDS-PAGE中完全靠分子量分离，测定的分子量准确性才高。
5. 怎样去除蛋白里的核酸？去除核酸可以用酶法（DNase，RNase）、超声，建议使用超声。
做WB什么的，抽提出的蛋白很粘稠就是因为有核酸，超声把核酸降解了就可以了。
若只是做WB，我觉得用RIPA可能更好一些，因为RIPA使用的三去污剂，裂解更完全些50mmTirs-Hcl 缓冲液（PH 7.5）,含：1、150mm Nacl2、1% NP-403、1% 脱氧胆酸钠4、0.1%SDS5、10mmEDTA6、2.5mmEGTA7、1mm钒酸钠8、50mmNaF 9、其它蛋白酶抑制剂(无水乙醇溶解配成100X浓度，下述给出的为终浓度Aprotinin (20 ug/ml)Benzamidine (1mm)Pepstatin (20ug/ml)PMSF (1mm)Leupetin (20ug/ml)TPCK (100Ug/ml)2.RIPA buffer:50 mM Tris-HCl pH 7.4150 mM NaCl1 mM PMSF1 mM EDTA5 礸/ml Aprotinin5 礸/ml Leupeptin1% Triton x-1001% Sodium deoxycholate(脱氧胆酸钠) 0.1% SDSTris buffered saline (1x TBS): 10 mM Tris-HCl, pH 8.0; 150 mM NaCl3.RIPA buffer:1x PBS,1% Nonidet P-40 or Igepal CA-630,0.5% sodium deoxycholate, 0.1% SDS.This may be made in large volumes. Add inhibitors at time of use from the following stock solutions:a) 10 mg/ml PMSF (sc-3597)(in isopropanol (add at 10 μl/ml RIPA)b) Aprotinin (sc-3595)c) 100 mM sodium orthovanadate (cat # sc-3540) in frozen aliquots (add at 10 μl/ml RIPA)Phosphate buffered saline (1x PBS): 9.1 mM dibasic sodium phosphate, 1.7 mM monobasic sodium phosphate, and 150 mM NaCl. Adjust pH to 7.4 with NaOHTISSUE SAMPLES1. Weigh tissue and dice（切）into very small pieces using a clean razor blade. Frozen tissue can be sliced very thinly and thawed in lysis buffer containing proteaseand/or phosphatase inhibitors. Use 3 ml of ice cold RIPA buffer per gram of tissue.2. Further disrupt and homogenize（使均匀）tissue with a dounce homogenizer（高速搅拌器）or a sonicator（超声仪）, maintaining temperature at 4°C throughout all procedures. (Optional: Add 30 μl of 10 mg/ml PMSF (cat # sc-3597 stock per gram of tissue.) Incubate on ice for 30 minutes.3. Transfer to microcentrifuge tube(General Laboratory Support Products) and centrifuge at 10,000xg for 10 minutes at 4° C. Remove supernatant and centrifuge again. The supernatant（漂浮）fluid is the total cell lysate（溶解产物）. A longer centrifugation may be necessary to obtain a clear lysate.THANKS !!!致力为企业和个人提供合同协议，策划案计划书，学习课件等等打造全网一站式需求欢迎您的下载，资料仅供参考。