肠道干细胞分离方法
肠道干细胞分离方法
肠道干细胞是指存在于肠道上皮层基底膜下的一类具有自我更新与多向分化能力的干细胞。
研究肠道干细胞对于了解肠道组织发育、修复和肿瘤发生具有重要的意义。
在肠道干细胞研究领域，分离肠道干细胞是一项关键的技术，本文将介绍几种常用的肠道干细胞分离方法。
1.组织消化法：
该方法是通过消化肠道组织来分离肠道干细胞。
首先，将小鼠或人体肠道组织进行分离，并去除粘液和腺体组织。
然后，将组织切片并加入消化酶，比如胰蛋白酶和DNA酶等，将组织分解成单个细胞。
最后，通过离心将消化后的细胞分离成上清液和沉淀，上清液中含有肠道干细胞。
2.磁珠分离法：
该方法是利用特定的磁珠和抗体对肠道干细胞进行分离。
首先，将肠道组织分离并加入酶，消化组织为单个细胞。
然后，在单个细胞中加入特定的抗体-磁珠复合物，抗体能够结合肠道干细胞特定的表面标志物，如Lgr5、接着，将细胞溶液通过磁场，磁珠结合的肠道干细胞会被吸附在磁力架上。
最后，通过移除磁力架，可以将肠道干细胞从磁珠中分离出来。
3.流式细胞术：
该方法是通过细胞在流式细胞术仪中的特定性质进行分离。
首先，将肠道组织消化为单个细胞。
然后，使用特定的抗体标记肠道干细胞的表面标志物，如CD44、CD24和Epcam。
接着，将单个细胞溶液注入流式细胞术仪中，通过激光激发标记抗体，识别并分离出标记阳性的肠道干细胞。
4.聚集体培养法：
该方法是通过培养肠道组织形成三维聚集体，并从中分离出肠道干细胞。
首先，将肠道组织分离并切割成小块，然后进行体外培养。
在培养条
件下，肠道干细胞会自发地形成三维聚集体，称为小肠体外培养聚集体（intestinal organoids）。
最后，通过物理或酶解去除上清液中的肠道
干细胞。
这些是目前常用的几种肠道干细胞分离方法。
每种方法都有其优缺点，研究人员可以根据具体实验需求选择适合的方法。
肠道干细胞的分离方法
的进一步改进将有助于更好地研究肠道生物学和相关疾病的治疗。
基因治疗用于胃肠道疾病的最新研究现状
基因治疗用于胃肠道疾病的最新研究现状胃肠道疾病包括胃溃疡、炎症性肠病、肠易激综合征等多种消化系统疾病。
这些疾病给患者带来了巨大的健康负担，严重影响了他们的生活质量。
传统的治疗方法往往只能缓解症状，难以根治疾病。
然而，随着基因治疗技术的不断发展，人们开始关注基因治疗在胃肠道疾病中的应用前景。
基因治疗是利用基因工程技术来修复或治疗疾病的一种新兴治疗方法。
它通过改变人体基因的表达或功能，来达到治疗疾病的目的。
在胃肠道疾病的治疗中，基因治疗主要涉及以下几个方面的研究。
首先，基因治疗可以针对特定的致病基因进行修复。
研究人员发现，一些胃肠道疾病与特定的基因突变相关。
通过基因编辑技术，可以精确地修复这些突变基因，从而达到治疗疾病的效果。
例如，近年来的研究发现，炎症性肠病与NOD2基因突变密切相关。
科学家通过基因编辑技术成功修复了NOD2基因的突变，使其恢复正常功能，从而为炎症性肠病的治疗提供了新方向。
其次，基因治疗还可以通过调节免疫系统来治疗胃肠道疾病。
胃肠道疾病的发生往往与免疫系统失调有关。
通过改变某些关键基因的表达，可以调节免疫系统的功能，从而减轻炎症反应，改善胃肠道疾病的症状。
例如，最近的研究发现，调节肠道黏膜中的基因表达可以改变肠道免疫系统的平衡，从而减轻炎症性肠病的症状。
这一研究为基因治疗在炎症性肠病治疗中的应用提供了新思路。
此外，基因治疗还可以通过引导干细胞分化为胃肠道组织来治疗疾病。
一些胃肠道疾病由于组织损伤而导致功能障碍。
研究表明，通过基因治疗的方法，可以将患者自身的干细胞引导分化为胃肠道组织，实现组织的修复和再生。
这种方法被认为是治疗各种胃肠道疾病的一种潜在治疗途径。
目前，这一领域的研究已经取得了一些进展，但仍面临许多挑战，包括有效地引导干细胞分化为特定类型的胃肠道组织以及防止细胞异质性的发生等。
最后，基因治疗还可以通过基因转导技术来传递治疗基因。
基因转导技术是基因治疗中最常用的手段之一，可以将治疗基因传递到目标细胞中，从而改变细胞的功能和表达。
脂肪间充质干细胞提取方法
脂肪间充质干细胞提取方法脂肪间充质干细胞（adipose-derived mesenchymal stem cells，ADMSCs）是一种广泛存在于人体脂肪组织中的多潜能干细胞。
由于其易于获取、丰富来源以及多向分化潜能等优势，ADMSCs在再生医学和组织工程领域备受关注。
提取脂肪间充质干细胞的方法有多种，常用的包括机械消化法、酶消化法以及分离培养法。
本文将对这些方法进行介绍和比较。
1. 机械消化法机械消化法是一种较为简单直接的提取脂肪间充质干细胞的方法。
首先，将脂肪组织从捐赠者身体中获取，并去除血管和结缔组织。
然后，使用机械切割或研磨的方法将脂肪组织分解成小块。
接下来，使用胶原酶等酶类物质对脂肪组织进行消化。
最后，通过离心等方法将脂肪间充质干细胞与其他细胞分离开来。
2. 酶消化法酶消化法是一种常用的提取脂肪间充质干细胞的方法。
首先，将脂肪组织从捐赠者身体中获取，并去除血管和结缔组织。
然后，使用胰蛋白酶等酶类物质对脂肪组织进行消化。
消化过程中，酶能溶解脂肪细胞膜，并释放出脂肪间充质干细胞。
最后，通过离心等方法将脂肪间充质干细胞与其他细胞分离开来。
3. 分离培养法分离培养法是一种较为复杂但效果较好的提取脂肪间充质干细胞的方法。
首先，将脂肪组织从捐赠者身体中获取，并去除血管和结缔组织。
然后，将脂肪组织切成小块，并加入胶原酶等酶类物质进行消化。
消化后，将细胞悬液进行离心分离，得到含有脂肪间充质干细胞的细胞沉淀。
接下来，将细胞沉淀进行过滤和洗涤，去除其他细胞和残留酶类物质。
最后，将脂肪间充质干细胞进行培养，促进其增殖和分化。
以上提取方法各有优劣。
机械消化法操作简单，但提取效率较低，且存在细胞破损的风险；酶消化法提取效率较高，但对酶的质量和浓度要求较高，且酶消化过程可能影响细胞活力；分离培养法提取效率较高，且可以得到纯度较高的脂肪间充质干细胞，但操作复杂且耗时较长。
为了获得高质量的脂肪间充质干细胞，提取过程中的无菌操作非常重要。
肠道干细胞与肠道损伤修复的研究进展
肠道干细胞与肠道损伤修复的研究进展耿艳霞【摘要】The intestinal mucosa epithelial cells are constantly self-renewing for a life time, this is realized by the stem cells through their continuous proliferation, differentiation and ultimate replacement of the lost epithelial cells. This dynamic balance plays an important role in normal intestine integrity maintenance, as well as intestinal restoration after injury. Right now, there is a lack of effective treatment after mucosal damage. In the natural wound repair process, intestinal stem cells (ISC) divide faster, and promote the restoration procedure. Understanding the biological characteristics of ISC such as its location, molecular marker, and mechanism of proliferation and differentiation, is meaningful in promoting the intestine structure and function regaining after injury.%肠黏膜上皮细胞终身不断自我更新,这一过程须凭借肠道隐窝干细胞(intestinal stem cell,ISC)持续增殖、分化,取代终末分化细胞来完成.这种动态平衡在正常肠道结构和功能的维持以及肠道损伤后的修复过程中起着重要作用.目前肠道黏膜损伤尚缺乏有效的治疗手段,ISC在肠道损伤后分裂加快,促进了损伤修复.了解ISC的相关生物学特性,例如定位、标记、分裂分化机制等对于促进肠道损伤后结构与功能的完全修复有着重大意义.【期刊名称】《医学研究生学报》【年(卷),期】2013(026)002【总页数】5页(P181-185)【关键词】肠道干细胞;定位;分裂;分化;损伤修复;信号通路【作者】耿艳霞【作者单位】210002,南京,南京大学医学院临床学院(南京军区南京总医院)解放军普通外科研究所【正文语种】中文【中图分类】R730.530 引言肠道上皮是成年哺乳动物机体代谢最活跃的场所，也是自我更新最快的组织之一。
结肠癌干细胞标记物及其相关通路的研究进展
结肠癌干细胞标记物及其相关通路的研究进展
结肠癌干细胞是一种特殊的肿瘤细胞亚群，具有自我更新、多向分化和肿瘤形成的能力。
研究表明，结肠癌中广泛存在着干细胞标记物，这些标记物可用于确定肿瘤干细胞，且与结肠癌的进展、复发和预后密切相关。
目前，已有许多干细胞标记物及其相关通路被用于研究结肠癌干细胞，本文将对其中较为重要的标记物进行综述。
1. CD133标记物及其相关通路
CD133（俗称AC133）是一种典型的肿瘤干细胞标记物，在结肠癌中表达量较高，被认为是结肠癌干细胞的标志物之一。
研究发现，CD133阳性的结肠癌细胞干细胞比例较高，具有很强的肿瘤形成能力和化疗耐药性。
此外，CD133还与Wnt/β-catenin等信号通路的活化相关。
Lgr5（又称GPR49）是一种受体蛋白，被认为是肠道干细胞的特异性标志物。
近年来的研究显示，Lgr5在结肠癌中也表达较高，并且能够促进结肠癌干细胞的自我更新和肿瘤形成。
此外，Lgr5还与Wnt/β-catenin通路等信号通路密切相关。
EpCAM（也称TACSTD1）是一种单个跨膜型细胞表面糖蛋白，广泛分布于多种肿瘤中。
研究表明，在结肠癌中，EpCAM的表达量也较高。
EpCAM阳性的结肠癌细胞显示出肿瘤形成和转移能力高等特征，与Wnt/β-catenin等信号通路相关。
综上所述，结肠癌中广泛存在着干细胞标记物，这些标记物在结肠癌干细胞的识别、分离和研究中具有重要的应用价值。
此外，这些标记物所涉及的信号通路也成为了研究结肠癌干细胞的热点方向之一，为深入探究结肠癌的发生和发展提供了新的思路和方法。
干细胞提取方法与技巧
干细胞提取方法与技巧干细胞是一类具有自我更新能力和多向分化潜能的细胞，具有广泛的应用前景，被广泛研究和应用于生物医学领域。
为了有效地提取干细胞，研究人员发展了多种提取方法和技巧。
本文将介绍几种常用的干细胞提取方法及其相关技巧。
一、初级培养法初级培养法是一种常见的干细胞提取方法，适用于无需大量提取的情况。
该方法的步骤如下：1. 细胞准备：收集组织样品，将其分解为细胞悬液。
2. 培养基配制：根据所需提取的干细胞类型，选择适当的培养基并加入适量的细胞因子。
3. 细胞培养：将细胞悬液加入培养基中并进行培养，在适当的培养条件下促进干细胞分化与增殖。
4. 细胞分离：通过倒置显微镜观察，使用悬液中的细胞管控探测器将干细胞从其他细胞中分离出来。
5. 干细胞纯化：将分离出的干细胞用干细胞培养基培养并纯化，去除其他非干细胞杂质。
二、流式细胞术流式细胞术是一种常用的干细胞提取方法，利用细胞的免疫表型可以从复杂的细胞混合物中识别并分离干细胞。
其步骤如下：1. 细胞样品准备：提取组织样品并制备单细胞悬液。
2. 细胞标记：将单细胞悬液与特定的细胞表面标记物结合，可通过免疫磁珠或荧光标记等方法实现。
3. 流式细胞术分选：使用流式细胞术仪器进行细胞分选，根据标记物的不同发射光强度，将目标干细胞从混合物中分选出来。
4. 干细胞的检验与分离纯化：将目标干细胞从其他细胞中纯化出来，根据需要采取不同的分离纯化方法。
三、单细胞测序法单细胞测序法是一种快速有效的干细胞提取方法，可在单个细胞层面进行分析，帮助揭示不同类型干细胞的功能和特性。
其具体步骤如下：1. 单细胞捕获：通过微流控装置将单个细胞捕获和固定在特定位置。
2. 细胞裂解：采用细胞裂解酶对细胞进行裂解，释放出细胞内的RNA和DNA。
3. RNA/DNA扩增：使用逆转录酶和DNA聚合酶对捕获的RNA和DNA进行逆转录和扩增。
4. 测序准备：将扩增的RNA/DNA片段进行文库建立准备，包括文库构建、PCR扩增等步骤。
2024采用常用试剂构建胃肠道上皮和肿瘤类器官的参照标准
2024采用常用试剂构建胃肠道上皮和肿瘤类器官的参照标准胃肠道恶性肿瘤是威胁我国人民生命健康的公共卫生问题之一。
良好的实验模型是解析肿瘤发病机制和研发临床治疗新方法的有力工具。
高质量的生物医药研究需要实验模型尽可能再现来源组织的生理、病理状态。
类器官（Organoid）便是新近发展起来的一种新型实验模型。
类器官是指将部分活组织在体外3D培养基中扩增、传代形成的小器官样细胞团。
类器官在组织细胞构成、生物学功能及基因组变异谱上均与其来源组织有极高的相似性。
类器官具有制备周期短、可以长期低温保藏和可重复使用等诸多优势。
近年来，国内外较多机构开展该领域的工作并积累了一定的经验。
为了使胃肠道肿瘤研究中类器官相关技术得到有效利用和健康发展，作者以采用常用实验耗材与试剂为例，就类器官构建中组织样本前处理、类器官构建、类器官冻存与复苏、类器官生长状态评估以及类器官质量控制等关键技术提出可参照标准。
类器官构建的总原则此标准是基于酶消化法将人胃肠道正常黏膜上皮和胃肠道腺癌组织制备成单个细胞悬液,再将细胞与3D培养支架（此处指基质胶）混合形成3D胶滴,再加入市售的胃肠道上皮专用完全培养基进行培养（类器官专用特定培养基是指含有所培养组织细胞需要的生长因子、细胞因子以及小分子化合物）。
其目的是模拟胃黏膜上皮的生长微环境，促使胃肠道干细胞分化成为各种类型的胃肠道黏膜上皮细胞，同时还可维持胃肠道干细胞或多能干细胞的干性，实现体外长期培养、传代目的，便可培养出与胃肠道黏膜组织结构功能类似的活组织类器官。
类器官培养中涉及到的供体生物样本来源均以自愿同意参与科学研究为原则，并以签署知情同意书QnfOrmedConSent)为具体体现。
主要试验耗材与试剂主要耗材包括24孑麻、1.5mLEP管、15mL离心管、培养皿、50mL离心管、移液管、无菌吸头、冻存管、巴氏吸管、移液器、无菌棉球、银子、组织剪、70~100μm细胞过滤器(Coming)、细胞程序性冻存盒等。
干细胞提取过程
干细胞提取过程Document number：NOCG-YUNOO-BUYTT-UU986-1986UT一、实验准备1通知来血后，就应开始做实验准备，准备采集盒里面要有一个采血袋、采血管、温度计放置于有冰袋的保温箱里交给运输人员，保持运输温度高于4℃低于20℃.2实验室要事先做好清洁，打开传递窗口的紫外灯和生物安全柜的紫外灯，需照射30min，吹风10min。
3准备的物品：信息采集室要有无尘布、酒精棉球、棉签、喷壶、手套、储物盒、垃圾桶、垃圾袋、最好有热合机；在洁净室要准备，5ml、10ml、20ml、50ml注射器各2-3个，冷冻袋1个，剪刀3把，止血钳3把，EP管2-3个。
二、信息采集1接收到采集盒，带上手套，并喷上酒精消毒，打开盒子检查里面的物品，采血袋，采血管是否破损，有无漏血现象，并把各个管道的夹子夹紧。
2填写各种信息表格。
《脐血接收登记表》、《脐血交接记录》、《脐血采集信息等记表》、《脐血供者健康信息调查登记表》。
3按照公司规定打印标签，等酒精干后在采血袋上贴标签。
4把采血袋放入储物盒里放到传递窗中。
（传递窗口应用紫外照射30min，吹风10min）三、脐血制备1到洗手间把采集室所带的手套扔掉，用洗手液彻底把手洗干净。
2在一更换鞋，并脱掉日常穿的白大衣放在衣柜里；二更换洁净服，戴上帽子、口罩、手套。
3进入洁净室，从传递窗口把脐带拿到天平工作台上，称重采集袋毛重，称重时应注意管子别掉到天平外面，以免称重不准确。
脐血重量=采血袋毛重-采血袋净重4计算应加入HESPAN的体积，按照HESPAN:脐带血=1:4加入HESPAN。
5把采血管热合掉（就是连接针头的那一根长管）。
6用托盘把采血袋和HESPAN放入生物安全柜，放入之前应用酒精喷洗一遍。
拿一只5ml的注射器从采血袋的热合掉的端口扎入，抽取1ml的全血打入EP管中用于提取前细胞计数，然后再把针孔热合掉。
拿一只20ml的注射器从装HESPAN袋的黄色端口扎入抽取相应体积的HESPAN溶液，注入到采血袋中，并热合掉针孔。
想了解肠道菌检测的不同方法优劣点及价格三甲医院可以提供什么样的检测
想了解肠道菌检测的不同方法优劣点及价格三甲医院可以提供什么样的检测正好控叔写过科普什么是肠道菌检测顾名思义，就是采集样本对肠道中微生物（包括细菌，真菌和病毒）进行一次非常深度、系统和全面的检测。
假设我们每天排出一公斤的粑粑，有二两的“干货”都是肠道菌，所以粑粑中包含了肠道细菌全部的资料。
只要收集很少一点粑粑样本，经过分离提取DNA，上机测序和生物信息学分析后，就可以了解你肠子里到底住了哪些菌和他们的“菌口数量”大概是怎样。
与肠镜等体内检查完全不同的是，肠道菌检测没有任何痛感，不需要专程到医院，只需要在家中使用专业的采样管，1分钟内即可轻松完成对粑粑的取样，so easy。
为什么要测肠道菌？认识你的肠道君，为不盲目服用益生菌很多妈妈喜欢给孩子补充益生菌和益生元，认为益生菌就是对人体有益无害的好东西，惭愧的说几年前甚至我和丁妈也是这么认为的。
近一两年，国际上肠道菌研究突飞猛进，在跟进了一系列最前沿的科学文献后，我们认为很有必要提醒大家：不要盲目服用益生菌。
每个人的身体的情况差别很大，可能对大多数人有益处的菌，对少数人来说反而是致病菌。
比如下面两个最常见的菌，你一定不陌生，大家感受一下它的差别。
01乳酸杆菌就是能够发酵糖类并且产生乳酸的细菌，是典型的益生菌，最常见的就是存在于各类酸奶中。
如果体内乳酸杆菌数量大幅减少，就可能导致很多疾病的发生，此时补充一定量的乳酸菌，肠道生态又能很快恢复平衡。
但乳酸杆菌也不是一直扮演“好人”的角色，因为就在这个月发表的重磅研究表明，乳酸杆菌过量很可能是疾病的罪魁祸首【1】。
过量繁殖的乳酸杆菌会分泌大量乳酸，从而激活肠道NADPH氧化酶No某，生成巨量的活性氧（ROS）【2】。
活性氧的富集会加速肠道老化，在一些人体内引发剧烈的肠道黏膜损伤及肠干细胞的发育紊乱，从而导致结肠炎和肠道衰老【3，4】。
所以，即使如乳酸杆菌这样的良好市民，也并不是量越大越好。
02屎肠球菌这个听上去就“味儿很正”的细菌，其实就是“妈某爱”中的活性菌之一、而严格来说，肠球菌尚不能算在益生菌之列，应该是人体的共生菌。
干细胞治疗结肠炎
干细胞移植在炎症性肠病中的治疗摘要炎症性肠病(inflammatory bowel disease, IBD)是一组病因未明的慢性肠道炎症性疾病, 包括溃疡性结肠炎(ulcerative colitis, UC)和克罗恩病(Crohn's disease, CD). IBD的病因仍不明确, 传统治疗主要是控制活动性炎症和调节免疫紊乱, 常用药物包括5-氨基水杨酸、糖皮质激素和免疫抑制剂等, 部分病例最终需手术治疗. 目前治疗IBD应针对多种发病机制, 采取综合性措施. 随着治疗研究的进一步发展出现了生物制剂、转基因方法、抗凝治疗、干细胞移植, 使治愈IBD成为可能. 其中干细胞移植是一种新兴的IBD治疗方法, 近年来成为治疗研究领域的热点之一, 本文就干细胞移植治疗IBD的研究现状及作用机制进行概述.0 引言炎症性肠病(inflammatory bowel disease, IBD)病因未明, 发病机制复杂, 患者数量呈逐年增加趋势, 发达国家发病率高于发展中国家. 据调查, 10%-20%的患者中其家庭成员至少有1人患IBD[1,2], 患病时间超过10年者具有发生结肠癌的高风险率. 2003-2005年在一些发达国家(例如丹麦, 瑞典)的调查研究发现, 克罗恩病(Crohn's disease, CD)和溃疡性结肠炎(ulcerative colitis, UC)每年发病率分别为8.6/10万、13.4/10万[3], 发病高峰年龄为10-40岁人群, 年轻患者较普遍; 同时, IBD首次发作也可见于任何年龄段, 15%的患者在确诊时年龄已超过60岁[1,2,4,5]. IBD病程迁延、反复发作, 多数患者因疼痛生活质量受到严重影响[6]. 近年来随着人们生活水平的不断提高IBD在我国的发病率也渐呈上升趋势, Lok等[2]对我国UC患者人口流行病学及临床学特征进行调查研究后发现, UC患者在我国正逐年增加并对年轻患者影响较大, 其中一部分呈严重暴发起病, 虽多数患者病情可为内科药物治疗所缓解, 但少数病例仍需手术治疗或者死亡. 由于IBD病因未明, 迄今为止还没有彻底治愈IBD的方法, 这使得广大学者寻求一种新的治疗途径, 其中干细胞移植给IBD的临床治疗带来了全新的思路, 干细胞移植可调节或重建患者免疫系统, 修复受损肠道黏膜并可恢复肠道黏膜正常功能, 拥有其他治疗方法无法替代的作用. 干细胞移植将有望成治愈IBD的重要方法, 本文就干细胞移植在IBD的治疗研究进展及作用机制方面作一综述.1 IBD的治疗研究现状目前, IBD的治疗主要着眼于控制活动性炎症和调节免疫紊乱, 传统药物包括5-氨基水杨酸、糖皮质激素、免疫抑制剂等. 上述药物对CD与UC的缓解率分别为70%和80%, 但临床疗效欠佳, 长期应用不良反应多, 难以维持长期缓解, 不能有效缩短IBD的自然病程, 对危重病例疗效有限, 存在停药后复发等问题. 与过去30年相比, 免疫抑制剂在IBD的治疗中使用更加频繁, 但并未有效降低CD的肠道并发症[7], 对患者长期的生活质量并没有明显改善. Lix等[8]研究发现, 随着时间的推移CD患者较UC患者具有较高的心理压力、焦虑情绪及病痛灾难感, 这些负面情绪可加重IBD的自然病程, 进一步降低患者的生活质量. 在手术治疗方面, 该疗法主要用于内科治疗无效、合并严重并发症及结肠炎癌变患者, 最终目的是挽救生命、改善患者健康状况, 但术后存在不同程度复发, 其中CD复发率很高. 随之, 在传统药物治疗的基础上出现了生物制剂、转基因方法、抗凝治疗及干细胞移植等新的治疗方法. 在生物治疗方面, 最常使用新型生物制剂Infliximab作为IBD的治疗药物, 该药较多数传统药物起效迅速, 不良反应小, 研究表明Infliximab可有效治疗CD, 愈合瘘管提高患者生活质量[9-11], 对IBD的治疗具有积极作用, 但其临床效果明显时间仅持续2-4 mo, 部分治疗有效的患者可能出现急性肠梗阻, 对可产生Infliximab抗体的患者疗效较差, 在长期用药过程中部分患者可能会产生严重的不良反应[12-14]. 传统IBD的治疗目标主要是控制发作、维持缓解、预防复发、防治并发症及保证生活质量. 近年出现的新型治疗目标主要是早期控制发作、长期维持缓解、改变自然病程、使肠黏膜愈合并试图最终恢复肠道黏膜正常功能、甚至治愈疾病.2 干细胞移植与IBD的关系在诸多治疗IBD的研究中, 干细胞移植作为治疗IBD的新方法主要起源于对造血系统恶性肿瘤合并IBD患者进行干细胞移植后, 观察发现IBD病情在临床及内镜下得到了长期维持缓解, 再次启发了人们研究治疗IBD的新思路, 当前干细胞移植治疗IBD在实验动物研究和临床观察方面均取得了一定的进展.2.1 干细胞与肠黏膜损伤修复干细胞根据发育阶段不同分为胚胎干细胞和成体干细胞. 成体干细胞包括造血干细胞、间充质干细胞、肠道干细胞等. 肠道干细胞即肠道上皮干细胞, 位于肠道隐窝内, 越靠近肠隐窝基底部其增殖能力越强, 越近肠腔增殖能力越弱. 肠道上皮干细胞具有持续更新与分裂增殖能力, 能修复受损肠道黏膜并恢复正常功能, 对维持肠道黏膜的更新及内环境稳定发挥着重要作用, 近两年研究报道, 肠道上皮干细胞移植后可持续生长并稳定表达基因产物[15,16]. 在结合基因技术的基础上, 肠道干细胞可望作为基因载体细胞治疗肠道疾病. 采用干细胞移植治疗IBD造成的肠道黏膜损伤中, 最佳干细胞来源为肠道上皮干细胞, 但由于其数量来源有限, 在体外不能长期培养扩增, 因此可采用造血干细胞作为移植来源. 在干细胞中, 间充质干细胞是一种无造血功能的干细胞, 他有助于组织损伤的修复, 具有较高的可塑性及可移植性, 成人的任何器官组织中均存在该细胞, 在特定条件下间充质干细胞能诱导分化为脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞等多种非造血组织细胞. 2007年Philipe在UC大鼠动物模型中进行骨髓间充质干细胞移植实验中, 发现这类干细胞能定居于受体的肠道上皮[17,18]. 具有正常功能的肠道组织能使炎症所导致的急性肠道损伤得以修复, 间充质干细胞在控制炎症活动、修复肠道黏膜、恢复肠壁完整中起着重要作用. 研究表明, 间充质干细胞可促进放射性损伤的肠上皮的修复[19,20]. 间充质干细胞在修复肠道损伤过程中, UC患者通常能恢复正常的肠道组织结构, 但CD患者则由于过度纤维化常导致肠腔狭窄和梗阻, 这与间充质干细胞持久增生、组织破坏和胶原纤维沉积有关. 目前, 间充质干细胞已成功应用于循环系统、骨关节病等自身免疫性疾病的治疗.2.2 干细胞移植的理论基础干细胞移植的实践与概念始于造血干细胞, 并被几十年的动物实验所支持, 在对患有血液系统疾病或恶性肿瘤的患者进行干细胞移植后发现他们原来患有的IBD得到了意想不到的缓解[21,22]. 目前, 干细胞移植在造血系统疾病方面应用较成熟, 在治疗自身免疫性疾病方面也得到了进一步发展. 自身免疫性疾病的治疗以提高宿主的免疫耐受性为重点, 而IBD患者对肠道共生菌的免疫耐受发生障碍, 这促使我们考虑从促进免疫细胞耐受性治疗入手, 改变IBD的自然病程. IBD是多基因病, 易感点位于第3、7、12、16号染色体上. 研究表明, 突变是IBD的易感因素, Hugot等[23]和Inohara等[24]在2001年报道了IBD的第1个易感基因NOD2/CARD15, 该基因主要存在于单核细胞、巨噬细胞、潘氏细胞、树突状细胞、肠道上皮细胞以及T、B淋巴细胞内[25-27], NOD2/CARD15编码的蛋白质仅在外周血单核细胞中表达, 其作用是介导细胞凋亡以及诱导核因子κB(nuclear factor-κB, NF-κB)的激活. NOD2/CARD15存在3个突变位点, 突变在IBD肠黏膜的严重损伤中具有重要作用, 使患者体内合成大量蛋白, 其蛋白表达可能在造血干细胞内. 因此, 通过造血干细胞移植可重建患者免疫系统从而达到治疗目的.在骨髓源性干细胞中含有多种干细胞组分, 具有多向分化能力, 可直接定居于肠道或与肠道干细胞融合并促进受损微循环的重建等多种机制修复黏膜、恢复正常的肠上皮功能, 也可能其中还参与了肠道的免疫调节, 研究证明骨髓干细胞移植能使IBD模型小鼠受损的肠黏膜组织微循环得以重建, 最终加速受损组织的修复[28], 骨髓干细胞可能成为肠上皮再生的可替代来源.3 干细胞移植治疗IBD的机制及临床试验研究3.1 造血干细胞移植在干细胞移植中造血干细胞移植(hematopoietic stem cell transplantation, HSCT)应用的较为普遍, HSCT指通过大剂量放、化疗或其他免疫抑制剂的预处理方法清除受体异常的造血和免疫系统, 阻断其发病机制, 然后将供者的造血干细胞移植入受体内, 以替代原有的病理性造血干细胞, 使受体质量建造血及免疫功能, 最终达到治疗目的. HSCT按造血干细胞的来源分为骨髓移植、外周血造血干细胞移植、脐带血干细胞移植和纯化CD34+细胞移植等. 据造血干细胞供者和受者关系及遗传背景分为自体移植、同基因移植和异基因移植. 在进行异基因HSCT时首先要经过移植前预处理, 要求受者和供者具有相匹配的人类白细胞抗原(human leucocyte antigen, HLA)系统, 并有一定数量的造血干细胞作为前提. IBD肠道炎症的发生、发展和转归过程与肠道黏膜免疫系统密切相关. 在人体免疫调节中, T淋巴细胞是重要的免疫细胞, 分为辅助性T淋巴细胞(helper T cells,Th)、细胞毒T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte, CTL)和调节性T淋巴细胞, 其中调节性T淋巴细胞对自身免疫调节起着重要作用[29], 主要使机体的自身免疫耐受与自身免疫反应维持平衡[6]; T淋巴细胞功能异常可导致多种疾病[30-32], 同时也是IBD发病的重要因素; IBD患者受累肠段能产生大量抗体, 当T淋巴细胞产生免疫应答时: Th1为主的免疫应答发展为CD, 此时促炎介质IL-2、INF-γ、TNF释放增加, 引起炎症反应或迟发型超敏反应; Th2为主的免疫应答发展为UC, 此时抗炎介质IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13释放增加, 从而增强体液免疫应答. 正常情况下, 肠道成纤维细胞可产生基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMPs), 其作用可降解细胞外基质阻止其大量沉积, 而活化的具有正常功能的T淋巴细胞可激活成纤维细胞产生MMPs[33], 研究表明, IBD病变肠黏膜中MMPs的表达均明显高于正常的肠黏膜, MMPs在IBD的发病机制中起着重要作用[34]. IBD肠道成纤维细胞与正常肠道成纤维细胞相比具有显著的增殖和胶原分泌能力, 这表明IBD患者肠道产生免疫反应时功能异常的T淋巴细胞激活成纤维细胞,使MMPs产生异常, 从而导致病程的进一步发展. 因此, 造血干细胞移植治疗IBD的可能机制为: (1)移植后的干细胞能参与IBD患者受损肠黏膜的修复, 取代肠黏膜中受损的细胞成分, 还可参与调节肠道内的免疫反应; (2)调节T淋巴细胞功能使肠道正常表达MMPs; (3)移植的前提是摧毁机体病态免疫, 在此基础上进行自体或异体HSCT, 可恢复正常免疫, 阻止了机体对自身组织的免疫攻击, 使IBD的免疫发病机制根除; 与此同时, 在干细胞动员及预处理时应用的超常剂量免疫抑制剂对IBD的治疗具协同作用. 针对IBD的发病机制采用HSCT, 当IBD患者接受HSCT治疗后全身免疫系统得以恢复正常、异常的T淋巴细胞会消失, 通过免疫系统重建可恢复全身正常的免疫反应, 从而治愈IBD.3.2 骨髓间充质干细胞移植骨髓间充质干细胞 (bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs) 是骨髓基质细胞的前体细胞, 是由中胚层分化而来的一种具有多向分化潜能的非造血成体干细胞, 主要存在于骨髓, 可塑性很强, 在不同诱导条件下可分化为多种细胞[35-37], 诸如心肌细胞、肝细胞、神经细胞、血管内皮细胞等. BMSCs移植治疗IBD的可能机制为: 首先, 受损肠道对BMSCs可能有特异性趋化作用, 可释放趋化性细胞因子使BMSCs归巢, 对UC大鼠模型进行BMSCs 移植后发现, 迁移至受损结肠的BMSCs高于正常结肠[38]. 在修复消化系损伤过程中, BMSCs随损伤的加重迁移率增加, 恢复期则明显下降[39]. 研究还证实, 移植后的BMSCs能在大鼠UC模型的肠道中定位[40], 从而分化成具有一定功能的肠道上皮细胞, 可参与消化系损伤修复和功能重建[41], 与此同时BMSCs可抑制T、B淋巴细胞增殖, 降低树突状细胞抗原呈递作用以及改变自然杀伤(natural killer, NK)细胞的功能[42,43], 从而抑制肠道的异常免疫反应, 还可调节细胞因子IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8和 TNF-α[44]等的分泌, 进一步调节受损肠道的炎症反应; 其次, BMSCs还可参与受损肠道微环境的重建, 促进新生血管形成[45], 从而有利于肠道黏膜的修复过程; 最终达到治愈IBD的目的, 移植后重建的免疫系统功能替代了原有的导致肠道慢性炎症的异常的免疫系统功能. BMSCs移植后并发症少、骨髓采集安全方便、对机体损伤小, 易于分离、纯化和体外扩增, 不涉及伦理道德问题, 因此是干细胞移植治疗IBD的理想细胞.3.3 HSCT治疗IBD的临床试验研究 1993年, Drakos报道了第1例淋巴瘤合并CD患者在接受同种异体HSCT后其CD病情得到了改善. 随后, 至少有22例癌症合并CD患者在接受自体造血干细胞移植(autologous hematopoietic stem cell transplantation, AHSCT)后病情得到缓解, 其中19例移植后中位随访时间7年达长期缓解, 18例在中位随访时间超过20 mo后仍达到临床缓解, 18例中有2例同时服用传统药物[46]. 这表明在不服用任何药物的情况下AHSCT也能带来长期的临床缓解疗效, 这引起了人们极大的关注, 使IBD临床治疗方法出现了全新的思路. 2003年报道, 对2例Infliximab疗效较差的CD患者进行HSCT发现CD活动指数(Crohn's disease activity index, CDAI)完全正常[47]; 同时, Burt等[48]也作了报道; 在IBD的治疗中, 有两例关于AHSCT作为CD主要治疗方法的报道, 第1例来自于芝加哥的Ⅰ期临床试验, 包括12例活动性中重度CD患者, 在使用传统治疗和抗TNF-α单克隆抗体治疗无效情况下, 用环磷酰胺联合粒细胞集落刺激因子动员后采集外周血干细胞, 经CD34+纯化处理, 在移植前用环磷酰胺和抗胸腺球蛋白进行预处理, 结果发现出院时CDAI和CD症状均得到改善, 在随访7-37(中位时间为18.5) mo后发现影像学及内镜异常均逐渐改善, 其中11例获得维持缓解(CDAI≤150)[49]; 另1例报道来自米兰的Ⅰ-Ⅱ临床试验, Cassinotti等[50]对4例难治性CD患者进行自体造血干细胞移植后, 撤出所有传统治疗药物, 4例患者有3例经中位随访时间16.5 mo后临床和内镜评估达到了维持缓解; 在这2例报道中进行HSCT后均无患者死亡. 目前欧洲正进行Ⅲ期临床试验, 旨在调查大剂量免疫抑制剂加用AHSCT所带来的潜在临床疗效. 国外报道了1例出生后10 mo患有IBD合并CD3γ缺陷的患儿, 出生后2 mo时经常发生顽固性腹泻、反复肺部感染、口腔念珠菌病, 在进行严格的移植前准备后为该患儿进行第1次异基因HSCT, 并在5 mo后进行第2次移植, 在第2次移植后的第19天患儿由IBD导致的严重腹泻、肛周病变、直肠瘘得到了显著改善[51]. 国内报道, 2004年对5例复发性CD患者进行自体AHSCT治疗, 有4例缓解, 1例术后6 mo复发[52]. 所有这些相关报道在HSCT治疗IBD的进一步研究中给人们产生了巨大鼓舞.4 结论干细胞移植治疗IBD具有广阔的应用前景, 他可从遗传和免疫方面对IBD起到治疗作用, 能够改变IBD的自然病程、达到长期维持缓解、愈合受损肠道黏膜、恢复肠道正常功能并显著提高患者生活质量. 当前干细胞移植对IBD的治疗还处于试验性阶段, 主要用于对难治性CD试验性治疗的研究, 尚缺乏大量的临床资料, 有待于更多病例研究和长期随访. 随着干细胞移植技术的迅速发展, 成纤维细胞、骨髓细胞诱导成多能干细胞相继报道, 给干细胞移植治疗IBD的研究和应用打开了新的前景. 此外, 干细胞移植在基础和临床研究方向上仍存在着有待解决的问题, 如干细胞移植治疗最佳时机的选择; 移植适应证的选择; 合理的预处理方案; 自体移植物去除T淋巴细胞的利弊; 如何进行个体化治疗; 并发症的防治; 移植后激素减量的方法; 移植后免疫重建的研究; 干细胞移植后在体内的转化过程及机制; 如何进一步提高移植成功率等都是未来研究的方向, 随着基础研究的深入和临床实践经验的不断积累, IBD患者有望得到彻底的治愈. 我们期待着干细胞移植能在IBD的治疗中得到广泛和有效的应用. 在未来的一段时间内, 随着技术的不断创新, 治疗经验的不断丰富, 会有越来越多的患者得到更好的救治, 重获健康. 干细胞移植治疗在IBD中的应用将仍是消化系疾病的研究热点, 相信不远的将来应用干细胞移植治疗IBD将会成为必然趋势.背景资料 IBD病因未明, 迄今为止还没有彻底治愈IBD的方法, 药物及手术治疗均不能获得满意疗效.同行评议者郁卫东, 副研究员, 北京大学人民医院临床分子生物学研究所/中心实验室研发前沿目前, 干细胞移植治疗IBD的研究主要集中于造血干细胞和骨髓间充质干细胞移植, 在基础和临床研究方面均取得了一定的进展, 但移植后免疫重建的研究、干细胞在体内的转化过程及机制、移植适应证的选择、个体化治疗方案、如何进一步提高移植成功率等都是未来研究的关键.相关报道研究表明干细胞移植后可迁移至受损肠道参与损伤组织修复和功能重建, 并可恢复肠道正常的免疫功能, 国内外仍在进行临床研究探索.创新盘点本文就干细胞移植治疗IBD的研究进展进行综述, 并对其治疗的可能机制进行了概括总结.同行评价本文科学性较好, 综述全面, 为读者了解干细胞移植治疗炎症性肠病的研究进展奠定基础.。
大鼠肠神经干细胞分离和体外培养的初步研究
（ 州医学院 浙江 温州 ３ ５ ２ ，１ 附属育 英儿童医院 外科 ； 生物 学实验教 学中心 ） 温 ２ ０７ ． ２．
胡
［ 摘
要］ 目的： 探索和建立大鼠肠神 经干 细胞分离与体 外培 养的方 法。方法 ： 取胎龄 ２ 的 ｓ ０ ｄ Ｄ大鼠肠道 ，
ｎ ｔ ｐ ｒｔ ｏ Ｅ Ｓ ｂ ｏｌ ｇｉ ａｌ ｈ ａ ｄ ｈｅ ａ ｓ ｆ Ｎ Ｃｓ ｉ ｏ ｃ ｃ ａ ａ ｅ ｗ ｅ ａｌ ａ ｅ ｒ ｃｔ ｒ ａｓ ｖ ｕ ｔ ｄ． Ｒ ｕ ｔｓ： Ｔ ｄ ｙｓ ａｔ ｒ。 ｃｈ ａ ｅｒ ｓ ｃ ｅｓ ｌ ｗｏ ａ ｌ ｅ ｒ ａ ｃｔ ｉ ｔｉ ｃ ｏ ｅ ｐ ｅ ｅ ｎ ｄ ｅ ， ｎ ｅ ｉ Ｌ ｓ ｗｅ ｅ ｅ ｎ ｙ ｄ ｙ １ ｗ ｃ ｘ ｒ ｓ ｅ ｓ ｉ ｏｌ ｎｉ ｓ ａ ｐ ａｒ ｄ ｉ ｍ ｉ ｅ ｍ ｅ ｔ ｒ ｃ Ｎ Ｂ ｒ ｓ ｅ ｂ ａ ０， ｈｉ ｈ ｅ ｐ ｅ ｓ ｄ ｎｅ ｔ ｎ； ｄｉ ｆ ｒ ｎ ｉ ｔ ｄ Ｎ Ｂ ｆ ｅ ｅ ｔ ａ ｅ Ｌ ｓ
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第３ ７卷 第 １期 ２０ ０ ７年 １月
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学Hale Waihona Puke 院学报 Ｖｂ１ ． Ｎｏ． ３７ １ Ｊ ｎ ２ ０７ ａ ．０