骨髓间充质干细胞治疗肠道疾病的研究进展
CX3CR1对骨髓间充质干细胞修复受损肠上皮细胞的影响
■背景资料研究显示骨髓间充质干细胞(bone marrow- m e s e n c h y m a l stem cells, BM-MSCs)具有促进小肠缺血再灌注损伤的修复和增生作用, 但单纯输注BM-MSCs 存在到达受损部位数量及活性偏低等问题. 为提高受损组织内定向迁移BM-MSCs 的数量、增强其对受损组织的保护作用, 本研究目的是探讨趋化因子C X 3C 亚族是否在BM-MSCs 修复受损组织中发挥作用.曹毅, 尹明丽, 张博雅, 天津医科大学一中心临床学院 天津市 300070刘涛, 宋红丽, 天津市第一中心医院器官移植科 天津市器官移植重点实验室 天津市 300192曹毅, 在读硕士, 主要从事消化系统疾病的研究.国家自然基金面上基金资助项目, Nos. 81270528, 81441022天津市应用基础及前沿技术研究计划(重点)基金资助项目, Nos. 11JCZDJC27800, 12JCZDJC25200天津市卫生局科技基金(攻关)资助项目, No. 2011KY11作者贡献分布: 此课题由宋红丽设计; 实验由曹毅完成, 刘涛、尹明丽及张博雅协助完成; 统计分析由曹毅完成; 论文撰写由曹毅完成; 论文审校由宋红丽完成.通讯作者: 宋红丽, 教授, 主任医师, 300192, 天津市南开区复康路24号, 天津市第一中心医院器官移植科, 天津市器官移植重点实验室*****************电话*************收稿日期: 2015-05-04 修回日期: 2015-07-02接受日期: 2015-07-13 在线出版日期: 2015-08-18Role of CX3CR1 in repair of injured intestinal epithelial cells by bone marrow mesenchymal stem cellsYi Cao, Tao Liu, Ming-Li Yin, Bo-Ya Zhang, Hong-Li SongYi Cao, Ming-Li Yin, Bo-Ya Zhang, the First Central Clinical College, Tianjin Medical University, Tianjin 300070, ChinaTao Liu, Hong-Li Song, Department of Organ Transplantation, Tianjin the First Central Hospital; Tianjin Key Laboratory of Organ Transplantation, Tianjin 300192, ChinaSupported by: National Natural Science Foundation of China, Nos. 81270528, 81441022; Tianjin Application and Advanced Technology Research Program, Nos. 11JCZDJC27800, 12JCZDJC25200; Science and Technology Foundation of Tianjin Municipal Health Bureau, No. 2011KY11Correspondence to: Hong-Li Song, Professor, Chief Physician, Department of Organ Transplantation, Tianjinthe First Central Hospital; Tianjin Key Laboratory of Organ Transplantation, 24 Fukang Road, Nankai District, Tianjin300192,**********************Received: 2015-05-04 Revised: 2015-07-02Accepted: 2015-07-13 Published online: 2015-08-18AbstractAIM: To investigate the role of chemokine receptor CX3CR1 in the repair of injured intestinal epithelial cells by bone marrow mesenchymal stem cells (BM-MSCs).METHODS: BM-MSCs were cultured and identified in vitro . Caco-2 cells were exposed to tumor necrosis factor alpha (TNF-α) to establish a cell model of injured intestinal epithelium. Cells were divided into six groups: BM-MSCs, Caco-2 cells, Caco-2 cells treated with TNF-α, co-cultured BM-MSCs and Caco-2 cells, co-cultured BM-MSCs and Caco-2 cells treated with TNF-α, and co-cultured BM-MSCs and Caco-2 cells treated with anti-CX3CR1 and TNF-α. The expression of tight junction proteins and mRNAs in Caco-2 cells, and CX3CR1 protein and mRNA in BM-MSCs was detected by immunofluorescence, Western blot and RT-PCR.RESULTS: We selected 100 ng/mL TNF-α for 48 h to establish the injured model, because the expression of zonula occluden 1(ZO-1) and Occludin was reduced significantly at this time point (P < 0.05). The protein and mRNA levels of ZO-1, Occludin and CX3CR1 had no significant changes when BM-MSCs were co-cultured with untreated Caco-2 cells, but increased when BM-MSCs were co-cultured with injured Caco-2CX3CR1对骨髓间充质干细胞修复受损肠上皮细胞的影响曹 毅, 刘 涛, 尹明丽, 张博雅, 宋红丽在线投稿: /wcjd/ch/index.aspx 帮助平台: /esps/helpdesk.aspx DOI: 10.11569/wcjd.v23.i23.3670世界华人消化杂志 2015年8月18日; 23(23): 3670-3682ISSN 1009-3079 (print) ISSN 2219-2859 (online)© 2015年版权归百世登出版集团有限公司所有.基础研究 BASIC RESEARCH®■同行评议者王阁, 教授, 中国人民解放军第三军医大学第三附属医院曹毅, 等. CX3CR1对骨髓间充质干细胞修复受损肠上皮细胞的影响■研发前沿BM-MSCs 具有多向分化、免疫原性弱等优势, 已被广泛应用在组织修复、重建中, 但单纯输注BM-MSCs 存在数量和活性偏低问题, 如何提高BM-MSCs 修复受损组织的作用仍是目前研究的重点. 因此, 希望寻找特定基因能够增加受损组织内BM-MSCs 的定向迁移能力.cells (P < 0.05). Whe n CX3CR1 was blocked, the protein and mRNA levels of ZO-1 and Occludin decreased significantly.CONCLUSION: CX3CR1 participates in the repair of injured intestinal epithelial cells by BM-MSCs.© 2015 Baishideng Publishing Group Inc. All rights reserved.Key Words: Bone marrow mesenchymal stem cells; CX3CR1; Caco-2; Tight junction protein; Chemokine receptorCao Y, Liu T, Yin ML, Zhang BY, Song HL. Role of CX3CR1 in repair of injured intestinal epithelial cells by bone marrow mesenchymal stem cells. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi 2015; 23(23): 3670-3682 URL: /1009-3079/23/3670.asp DOI: /10.11569/wcjd.v23.i23.3670摘要目的: 探讨趋化因子受体C X3C R1对骨髓间充质干细胞(bone marrow-mesenchymal stem cells, BM-MSCs)修复受损肠上皮细胞的影响.方法: 体外分离培养、鉴定BM-MSCs. 采用肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor alpha, TNF-α)处理结肠癌上皮细胞(colon adenocarcinoma epithelial cell line, Caco-2)建立肠上皮损伤模型. 实验分为6组: (1)单纯BM-MSCs 组; (2)单纯Caco-2组; (3)Caco-2+TNF-α组; (4)BM-MSCs+Caco-2组; (5)BM-MSCs+Caco-2+TNF-α组; (6)anti-CX3CR1-BM-MSCs+Caco-2+TNF-α组, 利用Transwell 培养板将各组共培养, 通过免疫荧光、Western blot 及荧光定量RT-PCR 方法检测Caco-2上ZO-1(zonula occluden 1)、Occludin 和BM-MSCs 上CX3CR1蛋白及mRNA 表达水平. 结果: 选择100 ng/mL TNF-α处理Caco-2细胞48 h 建立损伤模型后, 检测ZO-1和Occludin 表达水平明显降低(P <0.05). 在BM-MSCs 与未受损的Caco-2共培养时ZO-1、Occludin 和CX3CR1蛋白及mRNA 的表达不受影响, 而在BM-MSCs 与受损Caco-2共培养时, 其表达增加(P <0.05). 阻断CX3CR1后, ZO-1、Occludin 蛋白及mRNA 的表达与未阻断前相比明显减少(P <0.05).结论: CX3CR1参与BM-MSCs 对受损肠上皮的修复.© 2015年版权归百世登出版集团有限公司所有.关键词: 骨髓间充质干细胞; CX3CR1; Caco-2; 紧密连接蛋白; 趋化因子受体核心提示: 本文应用肿瘤坏死因子-α(t u m o r necrosis factor alpha)处理结肠腺癌Caco-2细胞, 成功建立肠黏膜上皮细胞损伤模型, ZO-1(zonula occluden 1)和Occludin 表达水平明显降低, 将BM-MSCs 和受损Caco-2共培养, ZO-1、Occludin 和CX3CR1蛋白及mRNA 的表达水平增加, 阻断CX3CR1后, ZO-1、Occludin 蛋白及mRNA 的表达与未阻断前相比明显减少, 揭示了CX3CR1能够参与骨髓间充质干细胞对受损肠上皮的修复作用.曹毅, 刘涛, 尹明丽, 张博雅, 宋红丽. CX3CR1对骨髓间充质干细胞修复受损肠上皮细胞的影响. 世界华人消化杂志 2015; 23(23): 3670-3682 URL: http://www.wjgnet.com/1009-3079/23/3670.asp DOI: /10.11569/wcjd.v23.i23.3670 0 引言炎症性肠病、肝硬化、严重烧伤、缺血休克等疾病状态都会使肠道结构和功能遭到严重损害, 引发肠黏膜屏障功能障碍, 甚至全身炎症反应综合征和多器官功能障碍综合征等严重并发症[1-4]. 而在这些疾病的治疗中, 对于肠道的保护尤为重要. 研究[5,6]表明, 骨髓间充质干细胞(bone marrow-mesenchymal stem cells, BM-MSCs)对受损肠上皮组织有修复、支持作用. 但其定向分化修复作用主要是在其到达受损位点的前提下发挥的. 由于受损部位释放细胞信号, 如趋化因子、选择素、整合蛋白和其他黏附分子可与间充质干细胞上的细胞信号受体结合, 促使其到达受损部位发挥治疗作用[7-12]. 其中趋化因子发挥重要作用. 趋化因子被分为C 、CC 、CXC 、CX3C 4个亚家族, 其受体对应为CR 、CCR 、CXCR 、CX3CR. 对于哪种趋化因子及其受体相互作用调控BM-MSCs 迁移到受损肠道组织发挥作用目前尚不清楚. 大量研究[13-15]指出, 当肠道组织受到炎性刺激时, CC 、CXC 亚族趋化因子及其配体会参与其中. 但关于CX3C 亚族及其配体是否发挥作用尚无报道. CX3C 类目前只发现CX3CRl-CX3CLl 存在, 而CX3CRl 表达■相关报道炎性介质导致肠黏膜间紧密连接处通透性增加的报道很多, 如肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor alpha, TNF-α)能够通过激活核因子-κB(nuclear factor-κB, NF-κB)通路抑制ZO-1(zonula occluden 1)和Occludin的表达等, BM-MSCs 能够对异位肠道移植和肠道缺血灌注时造成的肠黏膜屏障损伤产生修复作用的研究也有报道, 但研究趋化因子在其中的作用较少.在BM-MSCs表面, 故本实验旨在探讨CX3CRl在BM-MSCs修复受损肠上皮细胞过程中是否发挥作用.1 材料和方法:1.1 材料实验动物选用SPF(Specific PathogenFree)级健康、♂Wistar大鼠, 体质量60-80 g, 购自军事医学科学院实验动物中心. Caco-2细胞株购自美国模式生物典藏中心(AmericanType Culture Collection, ATCC). DMEM/F12培养基、L-DMEM/F12培养基、RPMI-1640培养基、胰蛋白酶/E D T A细胞消化液(Gibco, 美国)、胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)(PAA, 奥地利); DMSO(Sigma-Aldrich,美国)、抗大鼠C D34-异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate, FITC)、CD29-PE、CD45-PE、CD90-FITC、RT1A-PE、RT1B-FITC(Biolegend, 美国)、Transwell小室(CORNING, 美国)、FACSCalibur流式细胞仪(BD, 美国)、重组人类肿瘤坏死因子-α(tumornecrosis factor alpha, TNF-α)(PeProTech, 美国)、兔抗O c c l u d i n抗体、兔抗C X3C R l抗体、兔抗GAPDH抗体、HRP标记山羊抗兔IgG(Abcam, 美国)、兔抗ZO-1(zonula occluden1)抗体(Invitrogen, 美国)、Western blot相关试剂购自武汉博士德; 山羊血清(索莱宝, 中国), RNAiso Plus RNA等提取相关试剂、PrimeScriPt Ⅱ第一链cDNA合成试剂盒及SYBR Premix Ex Taq Ⅱ荧光定量PCR试剂盒(TaKaRa, 日本), 荧光定量PCR仪(APPliedBiosystems 7300, 美国).1.2 方法1.2.1 BM-MSCs体外分离、培养及流式鉴定:Wistar大鼠处死, 取股骨和胫骨、减去骨骺,用含10%血清的DMEM/F12完全培养液反复冲洗骨髓腔, 制成单细胞悬液, 接种培养瓶中,37 ℃、50 mL/L CO2培养. 48 h换液, 去掉未贴壁细胞, 待细胞密度达到80%-90%融合时, 1∶2传代培养. 使用生长状况良好的第三代BM-MSCs进行后续实验.取生长良好的第三代BM-MSCs, 消化成单细胞悬液, 调整细胞浓度为106/m L, 加入荧光标记CD29-PE、CD45-PE、RT1A-PE、CD34-FITC、CD90-FITC、RT1B-FITC, 避光孵育30 min, 洗涤, 流式细胞仪检测这些表面标记的表达.1.2.2 BM-MSCs向脂肪细胞的诱导分化: 在100mL含10%血清的L-DMEM/F12培养液中, 加入200 mmol/L吲哚美辛50 μL, 0.5 mol/L 1-甲基-3-异丁基黄嘌呤100 μL, 40 U/mL胰岛素550 μL, 1mmol/L地塞米松100 μL, 配制成成脂诱导培养液. 将BM-MSCs接种在6孔板中培养. 待细胞生长稳定后, 更换为成脂诱导培养液培养, 每3 d换液. 8-12 d时, 用油红O染液染色, 显微镜下观察细胞浆内橘红脂滴着色.1.2.3 BM-MSCs向成骨细胞的诱导分化: 在100mL含10%血清的L-DMEM/F12培养液中, 加入1 mmol/L地塞米松10 μL, 1 mol/L甘油磷酸钠 1mL, 100 mg/mL维生素C 50 μL混匀, 调整pH值在7.3-7.4, 配制成成骨诱导培养液. 将BM-MSCs接种在6孔板中培养. 待细胞生长稳定后, 更换为成骨诱导培养液培养, 每3 d换液. 14 d左右,用Von Kossa染色试剂盒染色. 显微镜下观察黑色钙盐颗粒沉积.1.2.4 肠黏膜上皮损伤模型的建立: 用含10%血清的RPMI-1640完全培养液, 37 ℃、50 mL/LCO2培养Caco-2细胞. 隔天换液, 待细胞铺满80%以上瓶底时, 按1∶2传为二代细胞. 取状态良好的Caco-2细胞, 按5×105/孔接种于六孔板中, 培养24 h左右, 待细胞贴壁均匀、单层融合后, 分别加入终浓度为0、50、100和200 ng/mL的重组人TNF-α培养48 h, 以及使用100 ng/mL的重组人TNF-α分别培养0、12、24和48 h[16,17].利用免疫荧光检测紧密连接蛋白ZO-1形态及表达, RT-PCR及Western blot技术检测紧密连接蛋白ZO-1和Occludin的含量来判定肠黏膜上皮细胞的损伤程度. 探讨TNF-α的最佳处理浓度和处理时间. 不同批次细胞重复实验3次以上,验证肠黏膜上皮损伤模型的建立.1.2.5 Transwell小室BM-MSCs与Caco-2共培养:上面实验证实100 ng/mL TNF-α处理48 h为最佳处理条件. 实验分为6组: (1)单纯BM-MSCs组; (2)单纯Caco-2组; (3)Caco-2+TNF-α组(损伤组); (4)BM-MSCs+Caco-2组(共培养组);(5)BM-MSCs+Caco-2+TNF-α组(损伤修复组);(6)anti-CX3CR1-BM-MSCs+Caco-2+TNF-α组(阻断组). 将Caco-2、TNF-α刺激后Caco-2以1×106个/孔分别置于六孔Transwell小室下层, BM-MSCs及预先以5 μg/mL anti-CX3CR1抗体室温孵育1 h的anti-CX3CR1-BM-MSCs 4×105曹毅, 等. CX3CR1对骨髓间充质干细胞修复受损肠上皮细胞的影响■创新盘点本文发现体外BM-MSCs对受损肠黏膜屏障具有修复作用, 其中趋化因子受体CX3CRl参与此作用.个/孔分别置于Transwell小室上层, 培养24 h收集细胞, 提取蛋白和R N A, 实验方法参照文献[18].1.2.6 免疫荧光检测紧密连接蛋白ZO-1: 取接种了Caco-2细胞的玻片, PBS漂洗5 min×4次, 37 g/L甲醛固定15 min, PBS漂洗5 min×4次, 山羊血清封闭1 h, ZO-1(1∶50), 4 ℃湿盒过夜, PBS漂洗后加入FITC标记羊抗兔免疫荧光抗体, 37 ℃ 1 h, PBS漂洗, 甘油封片.1.2.7 荧光定量RT-PCR检测紧密连接ZO-1、Occludin mRNA和趋化因子受体CX3CR1 mRNA的表达: 收集细胞, 按照试剂盒说明书提取总RNA, 逆转录试剂盒反转录得到cDNA. 取1 μL cDNA加入20 μL的实时定量PCR反应体系, 反应条件: 95 ℃预变性30 s; PCR扩增(重复40个循环): 95 ℃ 5 s, 58 ℃ 30 s, 72 ℃ 30 s; ZO-1和Occludin使用Human-β-actin, CX3CR1使用Rat-β-actin作为内参. 结果用2-△Ct值比较. 每组实验取不同批次细胞重复3次. PCR引物序列如表1.1.2.8 Western blot技术检测紧密连接ZO-1、Occludin和趋化因子受体CX3CR1的蛋白含量: 收集共培养细胞, 提取蛋白, BCA法测定蛋白浓度. ZO-1采用8%SDS-PAGE, Occludin、CX3CR1和内参GAPDH采用10%SDS-PAGE 电泳分离后湿转至NC膜, 5%脱脂奶粉封闭2 h, 一抗ZO-1(1∶400)、Occludin(1∶1500)、CX3CR1(1∶500)和GAPDH(1∶1000), 4 ℃孵育过夜, TBST洗膜, 二抗(1∶2000)室温孵育2 h, 洗膜, ECL曝光显色, 图像经AlPhaView分析软件进行灰度值测定. 通过计算每组样品的(目的蛋白条带亮度值-背景值)与对应(内参蛋白GAPDH条带亮度值-背景值)的比值, 得到校正后的目的蛋白的相对表达量. 以对照组的目的蛋白相对表达量为1, 比较各组间校正后的目的蛋白相对表达量的关系. 每组实验取不同批次细胞重复3次.统计学处理采用SPSS21.0统计软件分析, 数据以mean±SD的形式表示, 多组比较采用单因素方差分析, 而各组间的进一步两两比较采用t检验. P<0.05为差异具有统计学意义.2 结果2.1 BM-MSCs的提取、培养及流式鉴定提取的原代BM-MSCs细胞12 h后开始逐步贴壁, 随着换液和传代, 造血细胞等杂质细胞越来越少, 15 d左右传至第三代, 以均匀长梭形生长, 呈漩涡状或平行排列, 具有典型的MSCs形态特征(图1A, B).流式结果表明: 95.5%的细胞表达CD90而不表达CD45, 99.4%的细胞表达CD29而不表达CD34, 95.0%的细胞表达RT1A而不表达RT1B, 这说明我们提取的原代细胞培养至三代获得纯的BM-MSCs(图2).2.2 BM-MSCs向脂肪细胞和成骨细胞的诱导分化作为一种多能干细胞, BM-MSCs具有向多种组织细胞分化的能力, 我们分离得到的BM-MSCs在成脂或成骨诱导培养液中能分化为脂肪细胞或成骨细胞, 脂肪细胞油红O染液染色, 显微镜下观察到细胞浆内出现橘红脂滴(图1C); 成骨细胞Von Kossa染色试剂盒染色, 显微镜下观察到黑色钙盐颗粒沉积(图1D).1F: 上游引物, R: 下游引物.曹毅, 等. CX3CR1对骨髓间充质干细胞修复受损肠上皮细胞的影响■应用要点目前研究表明BM-MSCs虽然对损伤组织有修复作用, 但大多为其旁分泌发挥作用, 而其组织分化定向修复作用由于其只有少数到达受损部位而难以发挥, 本研究通过揭示趋化因子受体提高BM-MSCs对受损组织的保护作用, 为其应用临床治疗提供实验依据.2.3 采用TNF-α成功建立肠黏膜上皮损伤模型2.3.1 不同浓度(0、50、100及200 ng/mL)TNF-α处理Caco-2细胞: 免疫荧光检测ZO-1蛋白表达, 显微镜下ZO-1蛋白定位在细胞膜上, 0 ng/ mL TNF-α组ZO-1的绿色荧光比较明亮, 且连续完整, 细胞间构成蜘蛛网状形态. 随着50、100及200 ng/mL TNF-α浓度的增加, ZO-1荧光的亮度逐渐减弱, 且100和200 ng/mL TNF-α组出现细胞膜上ZO-1荧光的断裂及其完整性的破坏(图3). Western blot结果显示, 在225、59和37 kDa位置处依次出现ZO-1、Occludin 和GAPDH条带. 50、100及200 ng/mL组与0 ng/mL组相比, ZO-1蛋白的表达量逐渐减少(F= 293.36, P<0.05)、Occludin 蛋白的表达量亦逐渐减低(F= 216.73, P<0.05), 呈浓度依赖. PCR结果显示, 50、100及200 ng/mL组较0 ng/mL组, ZO-1 mRNA的表达量逐渐减少(F =ABCD图 1 BM-MSCs形态及诱导分化. A: BM-MSCs形态(×100); B: 未诱导分化(×200); C: 成脂诱导(×200), 油红O染色示细胞浆内出现橘红脂滴(箭头所示); D: 成骨诱导(×200), Von Kossa染色见黑色钙盐颗粒沉积(箭头所示). BM-MSCs: 骨髓间充质干细胞.CD9-FITC-ACD45-PE-A107106105104103102101101102103104 105 106 107Q1-UL95.5%Q1-LL1.0%Q1-UR3.5%Q1-LR0.0%RT1B-FITC-ART1A-PE-A107106105104103102101101102103104 105 106 107Q1-UL0.0%Q1-LL4.5%Q1-UR0.5%Q1-LR95.0%CD34-FITC-ACD29-PE-A107106105104103102101101102103104 105 106 107Q1-UL0.1%Q1-LL0.0%Q1-UR0.5%Q1-LR99.4%ABC图 2 BM-MSCs表面标记检测. A: CD45-PE, CD90-FITC; B: CD29-PE, CD34-FITC; C: RT1A-PE, RT1B-FITC. BM-MSCs: 骨髓间充质干细胞.曹毅, 等. CX3CR1对骨髓间充质干细胞修复受损肠上皮细胞的影响■名词解释紧密连接蛋白ZO-1: 为第一个紧密连接相关蛋白, 属于跨膜蛋白, 可以连接咬合蛋白Occludin 和肌动蛋白骨架的作用, 是构成肠黏膜上皮紧密连接的重要成分之一.140.00, P <0.05)、Occludin mRNA 的表达量也随之减少(F = 1196.65, P <0.05)(图4). mRNA 与蛋白水平结果一致, 而100 ng/mL 组与200 ng/mL 组对紧密连接蛋白的影响两者间差异无统计学意义, 所以我们选用100 ng/mL 为最终处理浓度.2.3.2 不同时间(0、12、24和48 h)100 ng/mL TNF-α处理Caco-2细胞: 使用TNF-α 100 ng/mL 处理Caco-2细胞12、24和48 h 后, 随着处理时间的延长, ZO-1免疫荧光亮度依次减弱, 蜘蛛网状形态破坏逐渐严重, 细胞间紧密连接蛋白排列不规则甚至断裂(图5). Western blot 证实, 100 ng/mL TNF-α处理12、24和48 h 组与0 h 组相比, ZO-1(F = 115.49, P <0.05)和Occludin 蛋白(F = 86.12, P <0.05)的表达受抑制, 呈时间依赖. PCR 检测结果提示, ZO-1(F = 35.73, P <0.05)和Occludin mRNA(F = 17050.91, P <0.05)的表达量均减少, 且处理时间越长减少越明显, 差异有统计学意义(图6). 这些结果表明肠黏膜上皮损伤模型建立成功, 而TNF-α 100 ng/mL 处理48 h 为我们选用的最佳处理条件.2.4 观察BM-MSCs 对受损Caco-2的影响 BM-MSCs 与Caco-2共培养对ZO-1、Occludin 的表达无影响. 而BM-MSCs 与受损Caco-2共培养后, ZO-1、Occludin 蛋白的表达量较受损Caco-2组均增加(t = 12.77, P <0.05; t = 14.71,P <0.05); ZO-1、Occludin mRNA 的表达量也均增加(t = 7.40, P <0.05; t = 13.02, P <0.05). 该结果提示BM-MSCs 对受损Caco-2有修复作用(图7).2.5 观察趋化因子受体CX3CR1对BM-MSCs 修复受损Caco-2的作用 与单纯BM-MSCs 组比较, BM-MSCs 与Caco-2共培养时, CX3CR1蛋白和mRNA 的表达水平轻微增加, 但差异无统计学意义; 而BM-MSCs 与受损Caco-2共培养后, CX3CR1蛋白表达增加(t = 19.81, P <0.05), CX3CR1 mRNA 的表达水平也明显增加(t = 12.27, P <0.05). 结果提示CX3CR1参与BM-MSCs 修复受损Caco-2的过程.观察阻断CX3CR1的结果: Anti-CX3CR1-BM-MSCs 与受损Caco-2共培养后, ZO-1、Occludin 蛋白的表达量较阻断前相比减少(t = 4.98, P <0.05; t = 3.02, P <0.05), 但高于受损Caco-2组的表达量(t = 11.81, P <0.05; t = 14.92,P <0.05). 而ZO-1、Occludin mRNA 的表达量较阻断前相比减少(t = 4.37, P <0.05; t = 10.55, P <0.05), 但高于受损Caco-2组的表达量(t = 4.89, P <0.05; t = 4.66, P <0.05). 这个结果说明阻断CX3CR1影响BM-MSCs 对受损Caco-2的修复(图8).图 3 不同浓度TNF-α作用48 h时Caco-2细胞的ZO-1蛋白免疫荧光表达情况(×200). A: 0 ng/mL; B: 50 ng/mL; C: 100 ng/mL; D: 200 ng/mL. TNF-α: 肿瘤坏死因子-α. 箭头示ZO-1蛋白.曹毅, 等. CX3CR1对骨髓间充质干细胞修复受损肠上皮细胞的影响■同行评价本文探讨趋化因子受体CX3CR1对BM-MSCs 修复受损肠上皮细胞的影响, 整个课题工作量大, 具有一定创新性结果.m R N A 相对表达量TNF-α浓度(ng/mL)0 50 100 200 kDa蛋白相对表达量1.00.80.60.40.20.0TNF-α浓度(ng/mL)ZO-1OccludinGAPDH2255937TNF-α浓度(ng/mL)R n 6.0225.0224.0223.0222.0221.0220.022TNF-α浓度0 ng/mL50 ng/mL 100 ng/mL200 ng/mL Rn vs Cycle5 10 15 20 25 30 35 40Cycle NumberD e r i v a t i v e0.6000.5000.4000.3000.2000.1000.000-0.100溶解曲线60 65 70 75 80 85 90 95温度/℃R n6.9295.9294.9293.9292.9291.9290.929-0.071TNF-α浓度0 ng/mL50 ng/mL100 ng/mL200 ng/mLRn vs Cycle5 10 15 20 25 30 35 40Cycle NumberD e r i v a t i v e1.0000.8000.6000.4000.2000.000-0.200溶解曲线60 65 70 75 80 85 90 95温度/℃1.21.00.80.60.40.20.0A B CDEFG 图 4 不同浓度TNF-α作用48 h下ZO-1和Occludin蛋白及mRNA的表达水平. A: ZO-1和Occludin的Western blot条带; B: ZO-1和Occludin蛋白的相对表达量; C: ZO-1 PCR扩增曲线; D: ZO-1 PCR溶解曲线; E: Occludin PCR扩增曲线; F: Occludin PCR溶解曲线; G: ZO-1和Occludin mRNA的相对表达量. a P <0.05 vs 0 ng/mL组. TNF-α: 肿瘤坏死因子-α.曹毅, 等. CX3CR1对骨髓间充质干细胞修复受损肠上皮细胞的影响3 讨论各种炎症、应激、缺血缺氧、肠道肿瘤放化疗处理都会导致肠上皮损伤, 肠上皮的损伤主要表现在肠黏膜屏障受损. 肠黏膜屏障由机械屏障、免疫屏障、化学屏障及生物屏障四部分构成. 其中机械屏障在维护肠道功能上起着至关重要的作用. 紧密连接是机械屏障的重要组成部分, 主要有ZO-1、Occludin 、肌动蛋白β、咬合蛋白、钙黏蛋白等[17]. Caco-2细胞具有微绒毛和紧密连接结构, 类似于分化的人小肠黏膜上皮细胞, 被广泛用于肠道的功能研究[19].研究[16,20]显示, 炎性介质TNF-α能够通过激活核因子-κB(nuclear factor-κB, NF-κB)引起MLCK 肌球蛋白酶表达增加及其轻链磷酸化; 抑制ZO-1和Occludin mRNA 表达, 导致肠黏膜间紧密连接处通透性增加. 本研究利用50、100及200 ng/mL TNF-α作用Caco-2细胞48 h 以及100 ng/mL TNF-α作用Caco-2细胞0、12、24和48 h 构建肠上皮损伤模型. 将紧密连接蛋白作为观察对象, 探讨TNF-α的最佳处理浓度和时间. 我们的结果提示随着TNF-α刺激时间的延长以及刺激浓度的增高, 紧密连接蛋白ZO-1和Occludin mRNA 和蛋白表达降低, 荧光显示出明显断裂. 当100 ng/mL TNF-α刺激48 h 时,紧密连接蛋白的损伤已十分明显、且稳定, 并与200 ng/mL TNF-α刺激效果无明显差异, 所以我们选用100 ng/mL TNF-α处理48 h 构建稳定的肠上皮细胞炎性损伤模型.间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)是属于中胚层的一类具有高度自我更新和多向分化潜能的干细胞, 广泛分布于全身多种组织, 以骨髓中含量最高. BM-MSCs 在病灶部位能定向分化为软骨细胞[21]、骨骼肌和心肌细胞[22]、神经细胞[23]、肝细胞[24,25]等, 在肝纤维化[26]、急性胰腺炎[27]等多系统疾病治疗中发挥作用. 有研究[6]表明, BM-MSCs 可以对异位肠道移植和肠道缺血灌注时造成的肠黏膜屏障损伤产生修复作用. 但是BM-MSCs 的定向分化修复作用是在其到达受损部位的前提下发挥的. 其中趋化因子及其受体的作用对于BM-MSCs 的迁移至关重要[28-31]. 趋化因子是一类由蛋白质组成的小分子多肽, 目前已发现50余种趋化因子以及20种趋化因子受体[32]. CX3CRl 作为一种趋化因子受体, 表达在BM-MSCs 表面, 能够促使间充质干细胞迁移到受损脑组织、胰腺组织发挥作用[33,34]. 我们为研究CX3CRl 在BM-MSCs 修复受损肠上皮中所发挥的作用, 采用Transwell 小室建立体外趋化迁移模型, 发现BM-MSCs 与Caco-2共培图 5 100 ng/mL TNF-α作用下不同时间点Caco-2细胞的ZO-1蛋白表达情况(×200). A: 0 h; B: 12 h; C: 24 h; D: 48 h. TNF-α: 肿瘤坏死因子-α. 箭头所示为细胞ZO-1蛋白表达情况.曹毅, 等. CX3CR1对骨髓间充质干细胞修复受损肠上皮细胞的影响养, 不会对Caco-2上ZO-1和Occludin 的表达造成影响. 而BM-MSCs 与受损Caco-2共培养后,R n 6.1945.1944.1943.1942.1941.1940.194TNF-α处理时间0 h12 h24 h48 h Rn vs Cycle5 10 15 20 25 30 35 40Cycle NumberR n6.9295.929 4.9293.9292.9291.9290.929-0.071TNF-α处理时间0 h12 h24 h48 hRn vs Cycle5 10 15 20 25 30 35 40Cycle NumberD e r i v a t i v e1.0000.8000.6000.4000.2000.000-0.200溶解曲线60 65 70 75 80 85 90 95温度/℃D e r i v a t i v e 0.6000.5000.4000.3000.2000.1000.000-0.100溶解曲线60 65 70 75 80 85 90 95温度/℃m R N A 相对表达量t /h1.21.00.80.60.40.20.0蛋白相对表达量t /h1.00.80.60.40.20.0图 6 100 ng/mL TNF-α处理不同时间下的ZO-1和Occludin蛋白及mRNA的表达水平. A: ZO-1和Occludin的Western blot 表达; B: ZO-1和Occludin蛋白的相对表达量; C: ZO-1 PCR扩增曲线; D: ZO-1 PCR溶解曲线; E: Occludin PCR扩增曲线; F: Occludin PCR溶解曲线; G: ZO-1和Occludin mRNA的相对表达量. a P <0.05 vs 0 h组. TNF-α: 肿瘤坏死因子-α.0 12 24 48 k DaTNF-α处理时间(h)ZO-1Occludin GAPDH 2255937AB CD EFG 曹毅, 等. CX3CR1对骨髓间充质干细胞修复受损肠上皮细胞的影响分组 1组 2组 3组 4组 5组R n6.1855.1854.1853.1852.1851.1850.185Rn vs Cycle5 10 15 20 25 30 35 40Cycle Number分组1组 2组 3组 4组 5组R n6.9295.9294.9293.9292.9291.9290.929-0.071Rn vs Cycle5 10 15 20 25 30 35 40Cycle NumberDe r i v a t i v e0.6000.5000.4000.3000.2000.1000.000-0.100溶解曲线60 65 70 75 80 85 90 95温度/℃D e r i v a t i v e1.0000.8000.6000.4000.2000.000-0.200溶解曲线60 65 70 75 80 85 90 95温度/℃蛋白相对表达量分组1.21.00.80.60.40.20.0m R N A 相对表达量分组1.21.00.80.60.40.20.0图 7 各个实验组中Caco-2细胞的ZO-1、Occludin蛋白和mRNA的表达. A: ZO-1和Occludin的Western blot条带; B: ZO-1和Occludin蛋白的相对表达量; C: ZO-1 PCR扩增曲线; D: ZO-1 PCR溶解曲线; E: Occludin PCR扩增曲线; F: Occludin PCR溶解曲线; G: ZO-1和Occludin mRNA的相对表达量. 1: Caco-2对照组; 2: Caco-2+BM-MSCs共培养组;1 2 3 4 5 kDaZO-1GAPDH Occludin GAPDH 225375937AB CD EFG 曹毅, 等. CX3CR1对骨髓间充质干细胞修复受损肠上皮细胞的影响ZO-1和Occludin 的表达增加, 提示BM-MSCs 对受损Caco-2有修复作用. 对于CX3CRl, BM-MSCs 与Caco-2共培养对其表达无影响. 而BM-MSCs 与受损Caco-2共培养后, CX3CRl 表达增加. 该结果提示CX3CRl 参与BM-MSCs 趋化迁移到受损肠上皮模型处发挥修复作用. 为进一步验证CX3CRl 的作用, 我们使用anti-CX3CRl 抗体预处理BM-MSCs 后再与受损Caco-2共培养, 此时ZO-1和Occludin 的表达较未封闭CX3CRl 前减低, 进一步验证CX3CRl 参与BM-MSCs 趋化迁移修复受损肠道组织的过程. 但是本实验尚存在不足. CX3CRl 被封闭后, ZO-1和Occludin 的表达量仍比受损Caco-2组表达增加. 这个结果提示: (1)我们没有完全封闭BM-MSCs 上CX3CRl 的表达. 接下来我们将继续探讨CX3CRl 的封闭浓度和时间; (2)由于封闭CX3CRl 不能完全阻断BM-MSCs 对受损肠上皮的修复, 提示尚存在其他细胞信号参与BM-MSCs 对受损肠上皮的修复.本研究发现CX3CRl 在BM-MSCs 体外修图 8 BM-MSCs表面趋化因子受体CX3CR1的表达水平. A: CX3CR1的Western blot条带; B: CX3CR1蛋白的相对表达量; C: CX3CR1 PCR扩增曲线; D: CX3CR1 PCR溶解曲线; E: CX3CR1 mRNA的相对表达量. 1: BM-MSCs对照组; 2: BM-MSCs+Caco-2共培养组; 3: BM-MSCs+Caco-2+TNF-α损伤修复组. a P <0.05 vs 对照组. TNF-α: 肿瘤坏死因子-α; BM-MSCs: 骨髓间充质干细胞.A B E R n 6.9135.9134.9133.9132.9131.9130.913-0.087Rn vs Cycle5 10 15 20 25 30 35 40Cycle Number分组1组2组3组D e r i v a t i v e0.8000.7000.6000.5000.4000.3000.2000.1000.000-0.100溶解曲线60 65 70 75 80 85 90 95温度/℃C X 3C R 1蛋白表达量43210分组C X 3C R 1 m R N A 表达量1284分组3: Caco-2+TNF-α损伤组; 4: Caco-2+TNF-α+BM-MSCs损伤修复组; 5: Caco-2+TNF-α+anti-CX3CR1-BM-MSCs 阻断组. a P <0.05 vs 损伤组; c P <0.05 vs 损伤修复组. TNF-α: 肿瘤坏死因子-α; BM-MSCs: 骨髓间充质干细胞.1 2 3 kDaCX3CR1GAPDH 5037CD曹毅, 等. CX3CR1对骨髓间充质干细胞修复受损肠上皮细胞的影响复受损肠上皮模型中的作用, 为我们临床上促进移植BM-MSCs到达受损肠道组织从而提高治疗效果提供线索. 但在体内是否存在类似作用, 还有哪些细胞信号参与肠黏膜损伤下间充质的修复, 这将是我们接下来研究的方向.志谢: 感谢天津市器官移植重点实验室为我提供科学研究的平台.4 参考文献1 Lee SH. Intestinal permeability regulation bytight junction: implication on inflammatorybowel diseases. Intest Res2015; 13: 11-18 [PMID:25691839 DOI: 10.5217/ir.2015.13.1.11]2 Kalaitzakis E. 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间充质干细胞治疗放射性肠损伤研究进展
间充质干细胞治疗放射性肠损伤研究进展放射性肠损伤属于急性放射病的一种，也是腹部肿瘤采用放射治疗后导致的严重并发症之一，当前临床上对于放射性肠损伤尚无有效措施进行治疗。
因此，研究出全新的防治策略，可使患者的预后得以有效改善，生活质量得以有效提高。
间充质干细胞属成体多能干细胞，试验药理学研究结果显示，间充质干细胞能够对放射性肠损伤进行有效治疗。
本文就对放射性肠损伤采用间充质干细胞进行治疗的效果及间充质干细胞发挥疗效的机制的研究进展进行综述。
标签：间充质干细胞；放射性肠损伤；生物疗法随着科技水平的不断提高，当前核能技术不只应用于军事上，在其他很多生活领域，比如科研、医疗、工农业生产等都得到了有效应用[1]。
当人体受到核辐射时，会导致机体出现放射性损伤。
尤其是恶性肿瘤患者，进行放射治疗，效果较好且花费较低，临床应用率高。
有关研究表明，患有癌症的患者在其疾病治疗过程中，需要采取放射治疗的患者比例超过70%[2]。
在采用放射治疗的过程中，由于受到射线的照射，机体必定会受到损害，形成放射性损伤[3]。
由放射性损伤导致的并发症中，放射性胃肠病十分常见，占所有并发症发生数量的80%左右[4]。
由于人体肠黏膜上皮生长代谢十分活跃，因此对于受到的电离辐射，所表现出的敏感性也最高，这也导致放射性损伤中最为主要的受损部位就是肠道。
1 间充质干细胞的特点间充质干细胞属于成体多能干细胞，其来源十分广泛，同时很容易在体外对其进行分离、培养、扩增，增殖潜能十分巨大，间充质干细胞能够分化为多种类型的细胞；能够对多种细胞因子进行分泌，从而对多种免疫细胞进行调节；并且间充质干细胞还能向损伤组织迁移归巢[5]。
国际细胞移植学会对间充质干细胞的定义为：可黏附于塑料培养皿上贴壁生长，具备分化为软骨细胞、成骨细胞，以及脂肪细胞的能力，细胞表面抗原表型CD14或CD11b，CD19或CD79α、CD34、CD45和HLA-DR为阴性，CD73、CD90和CD105为阳性[6]。
溃疡性结肠炎现代医学研究进展
溃疡性结肠炎现代医学研究进展陈文华;黄国栋;方承康【摘要】3ZA WHO溃疡性结肠炎直结肠慢性非特异性炎症性疾病,多呈反复发作的慢性病程.现代难治病之一.本病治疗难度大,与结肠癌的发病有关,被WHO列为现代难治病之一.目前溃疡性结肠炎的治疗手段多样,出现了许多新技术如生物靶向治疗、干细胞移植等,现将近年溃疡性结肠炎现代医学研究进展进行综述.【期刊名称】《中国医药科学》【年(卷),期】2011(001)007【总页数】3页(P51-53)【关键词】溃疡性结肠炎;现代医学;研究进展;综述【作者】陈文华;黄国栋;方承康【作者单位】南昌大学第一附属医院,江西,南昌,330006;南昌大学第一附属医院,江西,南昌,330006;南昌大学第一附属医院,江西,南昌,330006【正文语种】中文【中图分类】R574.6溃疡性结肠炎（UC）是一种直肠和结肠慢性非特异性炎症性疾病，病因尚不十分清楚，临床表现为腹泻、黏液脓血便、腹痛等。
病情轻重不等，多呈反复发作的慢性病程。
本病治疗难度大，与结肠癌的发病有一定关系。
目前UC的治疗主要以中西医结合为主，手段多样，内治外治相结合。
现代医学以氨基水杨酸、类固醇激素、免疫抑制剂三大类药物治疗为主，重视新技术的开发研究，出现了新技术如生物靶向治疗、干细胞移植等。
1 药物治疗1.1 氨基水杨酸、类固醇激素、免疫抑制剂传统治疗以氨基水杨酸、类固醇激素、免疫抑制剂三大类药物为主。
其中水杨酸类药物中5-氨基水杨酸（5-ASA）副作用小，逐渐取代水杨酸偶氮磺胺吡啶（SASP）成为治疗轻中度UC的首选；免疫抑制剂主要用于前二者治疗无效的重症病例，可缓解病情，但易发生严重不良反应，使用时需掌握剂量。
我国国产5-氨基水杨酸肠溶片治疗研究协作组采用5-ASA肠溶片治疗UC65例与SASP组64例对照，结果两组总有效率相仿，分别为70.05%、67.79%；5-ASA 肠溶片的完全缓解率较SASP高，分别为29.51%、13.31%；不良反应发生率较低，分别为11.48%、23.33%[1]。
人羊膜间充质干细胞的研究进展
原代 ｈ Ａ Ｍ Ｓ Ｃ ｓ 呈 梭形 、 星形 或 多角 形 ， 进 行传 代 培养 后 ， 细胞表 现 为成纤 维 细胞样 克 隆 ， 呈 细长 的梭
形， 排 列 紧密 ， 多呈放 射状 或漩 涡状 贴壁 生 长 。电镜
观察 发现 ， ｈ Ａ ＭＳ Ｃ ｓ 平均 大小许 多和肠 道 上 皮 细胞 不 一 样 的微 绒 毛 ， 胞 浆
内含 有 丰富 的中 间丝 ， 脂 质小滴 和 空泡 也 比较常见 ，
含 有 中等量 的高尔基 复合 体 、 粗面 内质 网 、 线 粒体 和 致 密体 ， 胞 浆周 围有 自噬 空泡 和胞饮 小泡 ， 细 胞或 突
细胞 表 面标记 物 Ｓ Ｓ Ｅ Ａ － ４ 、 Ｏ Ｃ Ｔ － ４ ， 而 Ｏ Ｃ Ｔ － ４被认 为是 多 能干 细 胞 自我 更 新 和 多 项 分 化 潜 能 的基 因 。 进行 定 向诱 导并 检测是 文献 报道 常用 的鉴 定 干细胞 的方 法 …， 一般 对 细胞 进 行 成 骨 成 脂 诱 导 ， 经 成 骨
将 其作为替代细胞移植治疗各种疾病 ， 并 且 取 得 了较 好 的 临 床 效 果 。本 文 就 ｈ Ａ ＭＳ Ｃ ｓ的分 离 培 养 、 生物学 特性 、 分化潜 能 、 致 瘤 性及临床前研究等进展进行综述 。
［ 关键词 ］ 人羊膜间充质干细胞 ； 生物学特性 ； 临床 前 研 究 ； 干 细 胞
口腔 生 物 医学 ２ ０ １ ３年 ６月 （ 第 ４卷 第 ２期 ） Ｏ ｒ ａ ｌ Ｂ ｉ ｏ ｍ ｅ ｄ ｉ ｃ ｉ ｎ ｅ ， Ｖ ｏ １ ． ４ ， Ｎ ｏ ． ２ ， Ｊ ｕ ｎ ． ２ ０ １ ３
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９５ ・
万能热点——间充质干细胞的研究套路
万能热点——间充质⼲细胞的研究套路在间充质⼲细胞这么⽕，申请基⾦有套路吗？⼀⽂中，我们总结了间充质⼲细胞研究最常见的间充质⼲细胞结合外泌体（外泌体（exosome）和⾮编码RNA，⽽且间充质⼲细胞可以⽤于各模式：间充质⼲细胞个系统疾病的损伤修复，包括：H0605（⾻、关节、软组织损伤与修复），H0203（⼼肌细胞/⾎管细胞损伤、修复、重构和再⽣），H1511（急重症医学/创伤/烧伤/整形其他科学问题），H0910（脑、脊髓、周围神经损伤及修复），H1505（烧伤）和H2902（中西医结合临床基础）。
我们看⼀下间充质⼲细胞⽤于治疗各种疾病的临床试验研究（数据来源于）的情况：以间充质⼲细胞（mesenchymal stem cell）为关键词，我们共检索到616项研究：其中关节炎48项，移植物抗宿主病26项，糖尿病25项，脊髓损伤22项，多发性硬化21项，肝硬化17项，肌萎缩性脊髓侧索硬化症15项，克罗恩病14项，严重肢体缺⾎11项，肝衰竭10项，中风10项⽬。
下⾯我们就承接前⾯的⽂章继续挑选⼏篇⽂章介绍套路：1.MicroRNA cluster miR-17-92 Cluster in Exosomes Enhance Neuroplasticity and Functional Recovery After Stroke in Rats.Stroke（IF 6.0）. 2017 Mar;48(3):747-753.间充质⼲细胞治疗中风的功能和机制研究：间充质⼲细胞通过外泌体中miR-17-92调控PTEN 间充质⼲细胞治疗中风的功能和机制研究表达从⽽激活PI3K/Akt/mTOR 通路调控神经元可塑性，并促进中风后功能恢复。
2. Exosomes derived from miR-122-modified adipose tissue-derived MSCs increase chemosensitivity of hepatocellular carcinoma.J Hematol Oncol（IF 6.3）. 2015 Oct 29;8:122.肝癌化疗敏感性的功能和机制研miR-122修饰的脂肪组织来源的间充质⼲细胞（AMSC）增加肝癌化疗敏感性究：AMSC通过外泌体将miR-122传递给肝癌细胞，通过调控肝癌细胞靶基因IGF1R，ADAM10和CCNG1表达增加肝癌细胞对化疗药5-FU的敏感性，同样的肿瘤注射miR-122也可增加肝癌细胞的5-FU化疗敏感性。
山奈酚联合骨髓间充质干细胞治疗溃疡性结肠炎小鼠的疗效及机制
山奈酚联合骨髓间充质干细胞治疗溃疡性结肠炎小鼠的疗效及机制陈卓1，刘胜楠2，陈光侠1，吴倩倩1，陈新孚1，韩新臣11 徐州市第一人民医院消化内科，江苏徐州221116；2 徐州医科大学附属医院消化内科摘要：目的 观察山奈酚联合骨髓间充质干细胞（BMSCs ）治疗溃疡性结肠炎小鼠的疗效并探讨其机制。
方法 3周龄雄性C57BL /6J 小鼠处死后提取BMSCs ，12只6周龄C57BL /6J 小鼠随机分为对照组、造模组、造模与山奈酚治疗组以及造模与山奈酚联合BMSCs 治疗组，每组3只。
对照组小鼠自由饮用正常灭菌双蒸水，其余3组小鼠自由饮用含3% 葡聚糖硫酸钠的灭菌双蒸水建立溃疡性结肠炎模型，造模与山奈酚治疗组、造模与山奈酚联合BM‐SCs 治疗组小鼠同时给予每日山奈酚灌胃，造模与山奈酚联合BMSCs 治疗组在造模第1天、第4天和第7天尾静脉注射提取的BMSCs ，其余组小鼠灌注同样量的溶解剂。
造模结束后10 d ，每天测量小鼠体质量，10 d 后取出小鼠结肠，测量小鼠结肠长度。
采用流式细胞术检测小鼠结肠组织辅助性T 淋巴细胞（Th17）、调节性T 淋巴细胞（Treg ）比例，ELISA 法检测小鼠血浆白细胞介素17A （IL -17A ）、IL -10，RT -qPCR 法检测小鼠结肠组织IL -17A 、IL -10 mRNA 。
采用HE 染色观察小鼠结肠黏膜组织病理学改变，免疫组织化学染色观察小鼠结肠组织肠上皮紧密连接蛋白occludin 及ZO -1表达情况。
结果 结肠长度对照组>造模与山奈酚联合BMSCs 治疗组>造模与山奈酚治疗组>造模组（P 均<0.05）；造模结束后1～10 d ，对照组体质量逐渐上升，造模组体质量逐渐下降，造模与山奈酚治疗组、造模与山奈酚联合BMSCs 治疗组体质量自第6天开始逐渐上升，且造模与山奈酚联合BMSCs 治疗组体质量高于造模与山奈酚治疗组。
干细胞与胃肠动力研究进展
对 干 细 胞 移 植 对 胃排 空 和 胃肌 电 活 动 的 影 响 和 其 治 疗 某 些 胃肠 动 力 障碍 性 疾 病 的 尝 试 作 一 综 述 。 关 键 词 ： 细胞 ； 干 胃肠 动 力 ； 植 移
的 胃肠动 力 障碍性 疾病 可 能 与 ｋｔ ｉ 的功 能 缺失 性 突
变 、Ｃ Ｓ Ｆ分 泌 的减 少 或 缺 失 有 关口 。动 物 实 验 表 ］ 明 ， ｋｔ 号 被 阻断 后 ，Ｃ 并 非 死 亡 ， 是 重 新 当 ｉ信 ＩＣ 而
分化 为平 滑 肌 样 的表 型 。这 可 能 为 此 类 疾 病 的 治
疗 提供新 的方 法 。 ２ 建 立 胃肠 动 力研 究的器 官 离体 模 型
空 和 胃肌 电活动 的影 响和 治疗 某 些 胃肠动 力 障碍 胞 与 Ｃ ｊｌ 质 细 胞 ａａ 间
由于 Ｉ Ｃ和 肠 神 经 元 的减 少 或 缺 失 在 各 种 胃 Ｃ 肠 动力性 疾病 病理 生 理 学 机 制 中 的 重要 作 用 ， 得 使 人们 对 于 Ｉ Ｃ和 肠 神 经 元 与 胃肠 动力 的认 识 逐 步 Ｃ 加深 ， 以往 关于 胃肠道 发 育 及 运 动 的研 究 缺 乏 体 但 外 重建 胃肠道 器官 的模 型 ， 大 程 度依 赖 体 外 细 胞 很 和组 织 的原代 培 养 ；Ｙａ ｄ ｍａ ａ等 － 利 用 小 鼠胚 胎 干 ４ 细胞 （ Ｓ ） Ｅ Ｃ 在体 外 培养成 为三 个胚 层 发育 成 的 胃肠 道样 的单 位 （ ｕ－ ｋ ｎｔ ， 验 利 用 悬 滴 Ｅ Ｃ形 ｇ ｔｌ ｅｕ ｉ） 实 ｉ Ｓ 成 拟胚体 （ Ｂ ， ～７ｄ可见 每个拟 胚体 内形 成 多 个 Ｅ ）５
间充质干细胞及其外泌体治疗自身免疫性肝炎的研究进展
·综述·DOI： 10.3969/j.issn.1001-5256.2023.12.025间充质干细胞及其外泌体治疗自身免疫性肝炎的研究进展罗龙龙1，2，王丽菲1，2，郑英2，李斌2，卢利霞2，李初谊2，于晓辉2，张久聪21 甘肃中医药大学第一临床医学院，兰州 730000；2 中国人民解放军联勤保障部队第九四〇医院消化内科，兰州 730050通信作者：张久聪，********************（ORCID： 0000-0003-4006-3033）；李斌，*****************（ORCID： 0000-0002-8626-7624）摘要：自身免疫性肝炎（AIH）是由自身免疫系统攻击肝细胞所致的慢性肝炎，其慢性进展可能会导致肝硬化甚至肝细胞癌的发生。
目前，针对AIH的治疗主要包括药物治疗和肝移植，但均存在着各自的局限性，这使得患者的临床获益有限。
因此，寻找新的治疗药物和方法成为了当前亟待解决的关键问题。
近年来研究表明，间充质干细胞及其外泌体可通过抑制炎症反应、增强肝细胞的再生、调节免疫系统等方式改善AIH患者的症状，在AIH治疗中具有广阔的应用前景。
本文通过回顾已有文献，对间充质干细胞及其外泌体治疗AIH的机制和应用进展进行综述，以期为AIH的临床治疗提供新的思路。
关键词：肝炎，自身免疫性；间质干细胞；外泌体；治疗学基金项目：甘肃省非感染性肝病临床医学研究中心（21JR7RA017）；联勤保障部队第九四〇医院基金临床医学肝病诊治中心（2021yxky079）；甘肃省科技计划项目任务书（22YF7FA105）；甘肃省卫生健康行业科研计划项目合同书（GSWSKY2021-054）Research advances in mesenchymal stem cells and their exosomes in treatment of autoimmune hepatitisLUO Longlong1，2， WANG Lifei1，2， ZHENG Ying2， LI Bin2， LU Lixia2， LI Chuyi2，YU Xiaohui2， ZHANG Jiucong2.（1. The First Clinical Medical School，Gansu University of Chinese Medicine，Lanzhou 730000，China；2. Department of Gastroenterology， The 940 Hospital of Joint Logistic Support Force of PLA， Lanzhou 730050， China）Corresponding authors： ZHANG Jiucong，********************（ORCID： 0000-0003-4006-3033）； LI Bin， 2312115338@qq. com （ORCID： 0000-0002-8626-7624）Abstract：Autoimmune hepatitis （AIH）is a type of chronic hepatitis caused by the autoimmune system attacking hepatocytes，and its chronic progression may lead to liver cirrhosis and even hepatocellular carcinoma. Currently，pharmacotherapy and liver transplantation are the main treatment methods for AIH，but both methods have their own limitations， which limits the clinical benefits of patients. Therefore， it is a critical issue to search for new therapeutic agents and methods. Recent studies have shown that mesenchymal stem cells （MSC） and their exosomes can improve the symptoms of patients with AIH by suppressing inflammatory response，enhancing the regeneration of hepatocytes，and regulating the immune system and thus have wide application prospects in the treatment of AIH. By summarizing related articles， this article reviews the possible mechanisms and application of MSC and their exosomes in the treatment of AIH， in order to provide new ideas for the clinical treatment of AIH.Key words：Hepatitis， Autoimmune； Mesenchymal Stem Cells； Exosomes； TherapeuticsResearch funding：Gansu Clinical Medical Research Center for Non-infectious Liver Diseases （21JR7RA017）；Liver Disease Diagnosis and Treatment Center， 940th Hospital Foundation， Joint Logistics Support Force （2021yxky079）； Gansu Province Science and Technology Plan Project Assignment （22YF7FA105）；Gansu Province Health Industry Scientific Research Plan Project Contract （GSWSKY2021-054）自身免疫性肝炎（AIH）主要表现为高球蛋白血症、自身抗体阳性和组织学上界面性肝炎及汇管区浆细胞浸润等［1］。
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信在以后的研究中，这些问题将会迎刃而解，干细
胞疗法将会应用于更广阔的领域，从而更好的服务
于临床。同时，干细胞在细胞和基因工程方面也具
有广泛的应用前景，值得进一步探索。
参考文献： ［1］ Jones E, McGonagle D. Human bone marrow mesenchymal stem
cells in vivo [J]. Rheumatology (Oxford),2008,47(2):126 ［2］ Dominici M, Marino R, Rasini V, et al. Donor cell-derived os-
化成为某种成体干细胞或者横向分化为多种组织
细胞，因而备受人们关注，成为细胞移植治疗的新 热点。大量动物实验研究己证明 BMSCs 在治疗多系 统疾病方面具有显著效果。本文就 BMSCs 应用于肠 道疾病的治疗方面做一综述。 1 BMSCs 简介
BMSCs 是最近几年被发现的、除造血干细胞以 外的一种成体干细胞，具有自我更新和多向分化潜
研究热点。 2.3 BMSCs 在治疗肝移植相关性肠病方面的作 用 目前，各种原因引起的终末期肝衰竭的患者越 来越多，肝移植已经成为治疗各种终末期肝病患者
的最有效治疗手段，但是肝移植术后并发的胃肠功
能紊乱成为威胁手术成功与否的关键。肝移植术后
胃肠功能紊乱的原因包括：手术本身的创伤、缺血
再灌注损伤、移植物抗宿主病等。 BMSCs 本身具有低免疫源性，初始 T 细胞对抗
定植并横向分化，但其定植率比较低，难以进行有
效的肠黏膜修复。因此只有提高 BMSCs 在肠道的定
[13]
植率才能更充分的发挥其黏膜修复功能。张坚等
通过实验研究发现在放射性肠道中 SDF-1因子表达 增加，通过 mCXCR4 基因（SDF-1 的受体）修饰可明 显提高 BMSCs 向肠道定植分化的能力，促进放射性 肠损伤的修复。是否还有其他方法提高 BMSCs 在
明间充质干细胞能够成功植入受者体内，具有明显 的可移植性。因此,BMSCs 已经成为细胞移植中极具 潜力的细胞来源，广泛应用于心血管、呼吸、消化、 创伤等领域。随着对 BMSCs 的不断深入研究，它将 更广泛地应用于临床上治疗各种疾病。 2 BMSCs 在治疗肠道疾病中的作用 2.1 BMSCs 在治疗炎症性肠病方面的作用 炎症 性肠病（inflammatory bowel disease，IBD）是指一组病 因未明的肠道疾病，包括溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UD）和克罗恩病(Crohn’s disease,CD)。是由于
关键词 骨髓间充质干细胞；肠道疾病；细胞移植
中图分类号 R574
文献标识码 Ａ
肠道疾病是一种常见病、多发病，严重影响着
人们的生活质量。传统方法是通过手术及药物治
疗，但多产生明显的副作用以及并发症。骨髓间充 质干细胞（ bone marrow mesenchymal stem cells,BM－ SCs）具有强大的增殖能力，多向分化潜能以及向损 伤组织定位修复的功能，在一定条件下可以定向分
血管化，促进局部血液灌注 。同时
VEGF
还可以阻
止白细胞的粘附和慢性炎症反应，减轻由于炎症造
[21]
成的缺血反应 。分泌的
HGF
可以通过促进血管内
皮细胞增殖，增加血管生成，减少细胞凋亡[22]；FGF
促进内皮细胞增殖以及血管化，同时还可以使 BM－
SCs
[23]
在低氧条件下存活率更高 。以上可以看出间
障功能的完整性方面发挥着巨大的作用。已经证实 BMSCs 释放的多种细胞因子在保护肠黏膜屏障方
面同样发挥着重要的作用，例如：它释放的肝细胞
[9]
生长因子可以减少细胞凋亡，促进细胞生长 ；血管
572
天津医科大学学报
第 １7 卷
内皮细胞生长因子可以促进肠黏膜的血管化，增加
肠道的血运，使受损肠黏膜获得丰富的营养物质， 加快溃疡的愈合[10]。由此可见，BMSCs 强大的旁分泌 功能在治疗胃肠道疾病方面起着重要作用。BMSCs
样能够减轻大量自由基造成的肠道损伤。 在阻断门静脉血流造成的缺血缺氧条件下,
第4期
张 静，等.骨髓间充质干细胞治疗肠道疾病的研究进展
573
BMSCs 可以通过分泌多种细胞因子提高肠道上皮
[19]
细胞的生存以及增殖能力，参与组织的修复 。它分
泌的 VEGF 及其他血管发生蛋白，参与损伤区域的
[20]
充质干细胞通过旁分泌功能可以促进细胞再生、抑
制功能细胞的凋亡，改善损伤区域的血管微环境。 BMSCs 所显示的低免疫原性、免疫调节特性及强大
的旁分泌特性在肝移植术后肠病的治疗上发挥着 巨大作用，相信随着对 BMSCs 研究的不断深入， BMSCs 将更广泛应用于移植治疗中，为控制肝移植
相关性肠功能紊乱的发生带来新的希望。 3 展望
原发生免疫应答反应依靠主要组织相容性复合体 (MHC)分子与抗原肽的复合物、T 细胞受体(TCR)作 为第一信号，同时需要 CD28、B7、细胞间黏附分子 1 (ICAM-1)、细胞间黏附分子 2(ICAM-2)等共刺激分 子的作用作为第二信号。BMSCs 不表达 MHC II 类 分子和 FasL，不表达共刺激分子 B7-1、B7-2，也不表 达或低水平表达 MHC I 类分子、CD40 和 CD40L[17]， 因而使 T 细胞无法对抗原产生免疫应答，发挥其免 疫抑制功能。研究发现在患有自身免疫源性肠病的 大鼠模型中注入 BMSCs 可以在疾病的活动期减少 肠系膜淋巴结的数量，并可以抑制活动性 T 细胞在 肠系膜淋巴结的聚集。急性的移植物抗宿主病机制 是供体成熟的 T 细胞遇到宿主抗原递呈细胞(APC) 时，发生激活、增殖等反应，BMSCs 能抑制 T 细胞的 活化与增殖，改变细胞因子的水平与成分，抑制免 疫应答。此外 BMSCs 还可以通过影响 T 细胞及 DC 的迁移，诱导 Treg 细胞的扩增，抑制 B 淋巴细胞分 泌抗体及调节 NO、DO 等可溶性因子的分泌，通过 这些免疫调控机制来抑制干细胞移植后出现的移 植物抗宿主病，因此临床上可以将 BMSCs 应用于移 植术后抗排斥反应，减少移植术后由于排斥原因造
免疫因子和炎症介质，这些因子和介质激起肠道的
炎症反应，导致肠道疾病的发生。有研究发现将
BMSCs 通过静脉注入 IBD 患者的机体内可以发挥
免疫调节作用，抑制免疫炎症的发生,加快肠黏膜的
修复进程[3]。BMSCs 发挥这一作用是通过抑制 T 细
胞、B 细胞的活化，降低树突状细胞（DC）的抗原呈
递作用而实现的[4]。研究表明，BMSCs 体外能够抑制
能，在适宜的外环境下可以分化为中胚层的间质组
织 细 胞 ，还 可 以 分 化 为 脂 肪 细 胞 、骨 细 胞 、软 骨 细
[1]
胞、心肌细胞、神经元细胞及星形胶质细胞等 。已 有研究证实 BMSCs 具有明显的抗炎、促血管再生、 免疫抑制等功能，而且其在体外易于分离、纯化、培 养和扩增。Dominici 等[2]将转染绿色荧光蛋白(GFP) 的间充质干细胞用于治疗小鼠成骨不全症，结果表
移植修复胃肠道损伤，对于治疗胃肠道疾病有着重 要的意义，它在治疗 IBD 方面还有哪些机制，发挥 哪些作用，有待进一步探索发现，相信对 BMSCs 临
床和基础的不断深入研究，将为日后的胃肠道疾病
的治疗开辟一条新的思路。 2.2 BMSCs 在治疗放射损伤性肠病方面的作用 临
床上放射治疗是腹部和盆腔等恶性肿瘤围手术期
于肠道营养物质的吸收，加强肠道的屏障功能，抵
御外源微生物的入侵，早期恢复放射性肠道损伤。
放射性胃肠道损伤一直是小肠放射生物学领域的
研究热点，深入研究其发生机制和救治方法，对于
腹部肿瘤局部放疗以及核事故引起的消化道损伤 的理论与实践有着积极的意义，基于 BMSCs 本身 的多种功能，它将成为治疗放射性肠损伤的主要
肠道的定植率，有待进一步研究。放射治疗导致肠
道干细胞衰竭，肠黏膜细胞萎缩变性，肠黏膜分泌 的各种消化液及消化酶减少，植入外源性 BMSCs
可以加快肠道上皮细胞的自我更新，同时有助于肠
道分泌功能的恢复。Semont
[14]
等 发现在放射性肠损
伤的大鼠体内注入 BMSCs 后，小肠绒毛长度增加，
从而进一步证实了 BMSCs 在肠道损伤中的修复作
的一项主要治疗手段，但是由于肠道上皮对于辐射
高度敏感，放射线极易造成肠黏膜上皮的损伤，导
致黏膜屏障破坏，肠的通透性增加，引起肠道功能
紊乱，造成放射性肠道损伤。因此如何提高放射损
伤后肠黏膜的修复功能，减轻放射治疗的副作用，
成为了临床上研究的热点问题。BMSCs 具有强大的 旁分泌功能，它分泌的组织因子包括：IGF-1、EGF、 SDF-1[11]等。IGF-1 可以通过 PI3K/AKT/P53 轴抑制 PUMA，从而阻止由于放射损伤导致的肠道干细胞 的凋亡[12]。SDF-1 是一种骨髓干细胞的趋化因子，已 有研究发现 BMSCs 可以向放射性损伤的小肠归巢、
成熟的 DC1 细胞产生 TNF-α，而促进成熟 DC2 细胞
分泌 IL-10；同时能够抑制辅助性 T 细胞 1(Th1)细
胞分泌 IFN-γ，而促进 Th2 细胞分泌 IL-4[5]。另外，
间充质干细胞体外还能够将 B 淋巴细胞阻滞于 Go/
G 期，抑制 B 细胞分泌 IgM、IgG、IgA，并下调 B 细胞
成的肠功能紊乱。
在肝移植手术中阻断门静脉的血流，肝脏缺血
造成肠功能受损，当肝脏再通后肠道恢复血流，此
时细胞的功能代谢及结构破坏更为严重，肠道组织
释放大量的氧自由基，造成缺血再灌注损伤。研究
显示间充质干细胞能够降低缺血再灌注肝损伤的
大鼠丙二醛水平，减少由于脂质过氧化造成的大量