细胞冻存复苏及腹水制备-LM

2013-5-23
三，贴壁细胞的消化：
1，吸去培养液，用无菌的PBS、Hanks液或无血清培养液洗涤细胞一 次，以去除残余的血清。 2，加入少量胰酶细胞消化液，略盖过细胞即可，室温放置30秒至2分钟。 3，显微镜下观察，细胞明显收缩，并且肉眼观察培养器皿底部发现细 胞的形态发生明显的变化；或者用枪吹打细胞发现细胞刚好可以被吹打
下来，此时吸除胰酶细胞消化液。加入含血清的培养液终止胰酶（竞争
抑制），吹打下细胞，即可直接用于后续实验。 4，如果发现消化不足，则加入胰酶细胞消化液重新消化。
5，如果发现细胞消化时间过长，未及吹打细胞，细胞已经有部分直接
从培养器皿底部脱落，直接用胰酶细胞培养液把细胞全部吹打下来， 1000-2000r离心1min，尽量去除胰酶细胞消化液后，加入含血清的完
的首选方法，一般用于生产科研或诊断用的单克隆抗体。
三，腹水产生的原因：
1，杂交瘤细胞注射到小鼠腹腔后，大量肿瘤细胞在腹腔
中生长，分泌很多刺激性的因子，胶体渗透压升高，导致 腹水产生。 2，杂交瘤细胞的生长对腹膜是个刺激，引起炎症反应导 致腹膜上的毛细血管通透性增加，体液漏出，形成腹水 。
四，液体石蜡的作用：
1，饲养细胞有污染却没有发现。 2，细胞在水浴锅中时间过长或水进入冻存管。 3，操作过程存在污染。 4，没有更换枪头，导致交叉污染。 5，没有记录细胞的名称及其编号或者有重号现象。
四，细胞复苏的注意事项：
1，所用器材经过高压处理，培养基和血清是新的。
2，整个过程保证无菌操作。
3，复苏的关键是速融，一般在1min内。
接种小鼠腹腔 抽取腹水
腹水纯化标记
单抗鉴定
项目组进行评价
我们主要制备的腹水有三类：
1，研发性：即小样，要求注射两只小鼠，至少5ml腹水。
2，中 样：从小样里面筛选出来的细胞株，一般要求5只。
3，生产性：供应生产用的腹水。 腹水制备的原则：保质保量！ 对我们的要求：必须要有高度的责任心。
二，为什么要制备腹水？
会太忙。假期前要合理规划复苏时间，不要留太多， 一个制备周期大概就是20天左右。
第三章，细胞的培养和消化
一，细胞培养的概念及生长方式
二，细胞的常见污染及处理
三，细胞的消化
四，细胞培养的注意事项
一，细胞培养的概念： 把来自机体的组织经分散成为单个细胞，放在体外
模拟体内的生理环境，在无菌、适当温度和一定的营养
个人操作对腹水产量有影响，因此尽可能熟练掌握， 抽的又快又多。
抽取腹水时的注意事项:
1，抽取时机的把握，一周左右肚子明显胀大或者发黑。
2，抽取时应该轻柔，特别是第一次。 3，抽取部位不能太靠近大腿，否则伤口难以愈合。 4，研发性抽取时不要弄乱注射器，避免交叉污染，及时记录。 5，每次抽取前后吹打干净针头，防止堵塞。
二，制备适量的饲养细胞
确定完复苏的细胞数量后就要准备饲养细胞，一般一只 小鼠的饲养细胞可以配置100mlDMEM培养基，根据细胞数量 的多少确定小鼠的数量，加样备用。目前，一般情况24孔板 1.5ml/孔，6孔板5ml/孔，大平皿30ml/板。
注意事项：
1，培养液和血清必须用新的，并记录批号。
2，制备过程严格无菌操作。
1，免疫抑制剂，注射石蜡油（降植烷和不完全福氏佐剂）
可以降低小鼠的免疫力， 从而降低小鼠对接种的杂交瘤细胞
的排斥反应； 2，石蜡（降植烷、不完全福氏佐剂）可以强烈刺激小鼠产 生白细胞介素6（IL－6），IL－6是最重要、最主要的浆细胞 （成熟的抗体分泌细胞）生长因子，因此注射上述几种物质
都可以通过刺激IL－6的产生，为接种的杂交瘤细胞提供较
丝状菌污染的污染
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二，细胞培养的污染
支原体污染
培养细胞受支原体污染后， 部分敏感细胞可见细胞生长增殖 变慢，部分细胞变圆，从瓶壁脱 落。但多数细胞污染后无明显变 化，或略有变化，若不及时处理 ，还会产生交叉污染。
阳性 支原体污染检测 阴性
二，细胞培养的污染
病毒污染
尽管病毒污染的细胞不 影响原代培养，但生产疫
3，第二天确定没有污染后方可使用。
三，细胞的复苏
1、将新鲜培养基置于37 ℃水槽中回温，回温后以75%酒精消毒，移 入无菌操作台内。 2、取50ml离心管，加入细胞冻存前所用基础培养液5ml。 3、根据复苏申请单，由细胞管理员将细胞从液氮中取出，细胞使用人核 对后，立即放入37 ℃水槽中快速解冻，轻摇冷冻管使其在1min内全部融
全培养液重新悬浮细胞，即可用于后续实验。
四，细胞培养时的注意事项：
1，要定期观察细胞的状态，发现问题及时处理，切忌将
细胞弃之不顾。
2，不能频繁将细胞拿进拿出，会影响细胞的生长。 3，不能频繁更换培养基，细胞生长有一个适应过程。 4，必须更换培养基时应严格无菌操作，避免交叉污染。 如液体变黄，死细胞过多等原因可考虑换液。 5，培养基应该做到专人专用。 6，发现细胞污染后需要及时处理，避免传染。
吹打细胞时注意事项：
1，动作轻柔，不能溅到其他孔中 2，细胞时被吹掉的而不是被划掉的，不能留死角 3，及时更换枪头，避免交叉污染 4，及时在离心管上写上细胞信息。
生理盐水洗细胞时注意事项：
1，盖子要对号入座，避免交叉污染。 2，加生理盐水时应悬空，不能回溅到枪头上污染整瓶生理盐水
二，小鼠的选择
小鼠的选择很研发重要，不仅关系到腹水的数量还 关系到质量，研发性和中样细胞必须挑选状态好的小鼠，
目前，大量生产单抗的方法主要有两种：
1，体外培养法，从上清中获取单克隆抗体 （1）悬浮培养法：
和常规静置培养相比，增加了细胞生长空间，使单位体积内细胞数量
增多，从而增加抗体量。 （2）固相培养法： 单层培养和悬浮培养的结合，主要用于贴壁性较强的杂交瘤细胞，以 小的固体颗粒作为细胞生长的载体，细胞固定在载体表面生长。 体外培养法优点：工艺简单，易于控制，目前上市的单抗多用此法。 体外培养法缺点：抗体浓度低，一般含量为200～500μ g左右。
腹水制备操作 技能与注意事项
LM
第一章，认识我们的工作
一，我们的主要工作是什么 二，为什么要制备腹水 三，腹水产生的原因 四，为什么要注射石蜡
立项
购买抗原或提取抗原
免疫小鼠
一 腹 水 制 备 组 的 主 要 工 作
制备饲养细胞
解冻NS1
检测效价
融合
检测抗体
三次克隆化 7-10天前注射液体石蜡 扩大培养 冻存细胞 复苏并培养
条件下，使之不断生长、繁殖或传代，借以观察细胞的 生长、繁殖、衰老等生命现象。细胞培养的培养物可以 是单个细胞（称为克隆培养），也可以是细胞群（称为 群体培养）。见下图：
概述
群体培养
克隆培养
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细胞的生长方式：
（1）贴附生长： 必须贴附于支持物表面才能生长。见于各种实体瘤细胞。 （2）悬浮生长： 于悬浮状态下即可生长，不需要贴附于支持物表面。见于 各种造血系统肿瘤细胞。
化，以75%酒精消毒?，移入无菌操作台内。
4、取出复苏细胞悬浮液，缓缓加入已准备的培养液中，混合均匀后， 1500rpm离心5min。 5、将离心管取出，弃去上清，用含血清培养基重悬后,加入6孔板或小号 平皿中，观察细胞复苏时状况并记录，37℃ 5%CO2培养。 6、次日观察有无污染。
以下原因可能导致复苏失败：
4，及时更换枪头，避免交叉污染。
5，及时记录细胞的名称及其编号批号，切忌弄混。
6，复苏完毕后重新核实复苏的细胞名称和编号批号。 7，填写复苏记录表。
细胞复苏时机的选择：
平时一般选取在周五，原因：一般情况周五复苏 后下周一会有一半细胞可以注射小鼠，一般三四天可
以全部注射完，7天后的周一开始抽取，这样周末就不
注射0.2ml。注射完毕后要及时把项目名称和编号及注
射时间记录到笼子上面。 注意事项： 1，细胞数量和状态 2，细胞不能注射到皮下 3，笼子上细胞信息要完整 4，填写注射记录
四，腹水的抽取
注射完细胞一周左右时间 会长腹水，一般第六天
就需要观察，防止胀死。小鼠腹腔明显胀大或者发黑
就必须抽取，但首次抽取应该轻柔，不能抽取过度。
第四章，腹水的制备
一，细胞的准备
二，小鼠的选择
三，细胞的注射
四，腹水的抽取
一，细胞的准备： 细胞复苏后要密切关注其生长状态，一般要求注射
数量为（5-10）×105个/只，研发性细胞要求超过3/4
孔注射两只。注射的细胞要求状态良好，处于对数期， 细胞又圆又亮。 经验：一般情况下一批细胞复苏后两天就可以注射 总数的一半，三天后注射剩下的一半，7天内基本可以 全部注射。如果发现细胞聚堆现象要轻轻吹开，状态不 好的细胞要换液并且加饲养细胞，但操作要轻柔。
6，发现针头变钝要及时更换。
7，倒腹水时看清楚，不能倒乱，不能倒进去沉淀。 8，抽取大样最好更换手套。
一，确定复苏的细胞数
二，制备适量的饲养细胞
三，细胞的复苏
四，细胞复苏的注意事项
一，首先确定复苏的细胞数
1，比较紧急的项目
对于研发性腹水一般要先和领导沟通确定哪些项目紧急，
紧急的项目要随时准备复苏。例如，目前紧急的有肿瘤系列
细胞如CA153CR，CA724，colo205等。中样腹水一般由领
导直接下单子。 2，根据实际情况自行安排 一般按项目进行复苏，先紧同一个项目复苏，切忌不要同 时复苏多个项目，这样容易弄乱，并且交接时比较麻烦。
全培养液重新悬浮细胞，即可用于后续实验。
三，贴壁细胞的消化：
1，吸去培养液，用无菌的PBS、Hanks液或无血清培养液洗涤细胞一 次，以去除残余的血清。 2，加入少量胰酶细胞消化液，略盖过细胞即可，室温放置30秒至2分钟。 3，显微镜下观察，细胞明显收缩，并且肉眼观察培养器皿底部发现细 胞的形态发生明显的变化；或者用枪吹打细胞发现细胞刚好可以被吹打