己烯雌酚对人肝微粒体内CYP3A4和CYP2C9酶的抑制作用_曲衍清

己烯雌酚( diethylstilbestrol，DES) 是一种人工合 成雌激素，20 世纪 40 － 70 年代曾广泛用于临床妊 娠早期保胎、预防和治疗骨质疏松症和雌激素替代 疗法以及治疗前列腺癌和乳腺癌。在禽类养殖上 DES 主要作为动物促生长剂应用于畜禽生产中［1］。 1984 年美国国立卫生研究院( NIH) 关于骨质疏松 症的会议曾经声明雌激素是治疗骨质疏松症最有效 的方法［1］。Scherr 等［2］研究结果发现，长期单独服 用 DES 1 mg·d － 1 或与其他形式的抗雄激素联用进 行治疗，可以明显缓解并预防骨的快速流失和骨吸 收［2］。但随着 DES 的广泛应用其不良反应作用也 相继被报道。如 Herbst 等［3］和 Hatch 等［4］ 分 别 报 道，妊娠期使用 DES，后代雌性个体会发生阴道腺 癌和子宫颈鳞状细胞瘤; 国际癌症研究机构也已确 认 DES 是经胎盘致癌的，并且把它列为人类致癌物
时人体内药物的血药浓度曲线下面积; c抑制剂 是人体 内抑制剂的血药浓度，在本实验中使用的是最大血
药浓度( cmax ) ; Ki 为抑制常数。通过此公式，计算出 AUC 的变化，判断产生药物-药物相互作用的可能
性。
1． 6 CYP3A4 和 CYP2C9 酶相对活性的计算
通过测定探针底物的代谢产物的相对生成量确
CYP2A4 和 CYP2C9 的抑制类型，并进一步求出其
抑制常数 Ki。 基于机制的抑制( mechanism-based inactivation，
MBI) 是药物抑制 CYP 的另外一种类型，一般是 CYP
催化药物产生的活性代谢产物与酶结合后使酶不可
逆地失活。需要合成新的 CYP 酶来恢复酶的氧化代
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药物相互作用的程度。
1 材料与方法
1． 1 试剂和仪器 4'-羟双氯芬酸钠，磺胺苯吡唑，对乙酰氨基酚，
7-羟香豆素，睾酮，酮康唑，葡萄糖-6-磷酸和葡萄糖6-磷酸脱氢酶购自 Sigma 公司; 双氯芬酸钠购自 ICN 公司; 氧化型辅酶Ⅱ( NADP + ) 购自 Roche 公司。乙 腈为色谱 纯，磷 酸 氢 二 钾 和 磷 酸 二 氢 钾 为 分 析 纯。 其他的试剂都是色谱纯级或可购买到的最高级别。
采用 DES 100 μmol·L － 1 初步预测 DES 对 2 种 重要 CYP 酶亚型 CYP2C9，CYP3A4 的 抑 制 情 况， CYP3A4 和 CYP2C9 阳 性 抑 制 剂 分 别 为 酮 康 唑 1 μmol·L － 1 和磺胺苯吡唑 10 μmol·L － 1［9］。对抑制率 大于 50% 的亚型，选取不同浓度的 DES 进一步求出 其半 数 抑 制 浓 度 ( IC50 ) 。为 进 一 步 求 得 DES 对 CYP3A4 和 CYP2C9 的抑制常数，采用不同浓度的
1． 5 从体外预测体内产生药物相互作用的可能性
预测 DES 通过抑制 CYP 酶的活性从而产生药 物相互作用的可能性［13］的公式如下:
AUCDES AUC
=1
+
c抑制剂是 DES 存在的条件下人体内
药物的血药浓度曲线下面积，AUC 是没有 DES 存在
作者简介: 曲衍清( 1983 － ) ，男，硕士研究生，主要从事 肝胆 外 科 研 究，E-mail: yanq _ 5411 @ 163． com; 王 立 明 ( 1963 － ) ，男，主任医师，博士，主要从事肝胆外科研究。
通讯作者: 王立明，E-mail: wangbcc259@ Yahoo． com． cn， Tel: ( 0411) 84669720
质［5］。其在临 床 上 现 在 也 禁 止 用 于 治 疗 前 列 腺 癌 和乳腺癌［6 － 7］。但 DES 作为绝经后妇女雌激素的 替代疗法在有些地方仍在使用。有文献报道，在Ⅱ 期临床试验中，DES 与多西紫杉醇合用可以通过修 改微管蛋 白 的 组 成，提 高 前 列 腺 癌 的 化 疗 疗 效［8］。 因此，DES 的应用目前仍处于争论中。
摘要: 目的 体外实验考察己烯雌酚( DES) 对细胞色素 P450 3A4 ( CYP3A4) 和细胞色素 P450 2C9 ( CYP2C9) 活性的抑制作用，以评估 DES 通过抑制这两个重要的细胞色素 P450( CYP) 亚型而引发药物-药物 相互作用的可能性。方法 混合人肝微粒体与不同浓度的 DES( 或阳性抑制剂) 、CYP3A4 或 CYP2C9 的探 针底物在 37℃ 条件下孵育相应的反应时间后，用高效液相色谱-紫外吸收法观察探针底物的代谢产物的生 成率，计算 IC50 值。选取不同的探针底物浓度( 覆盖 Km 值) 和 DES 浓度( 覆盖 IC50 值) 测定出相应的代谢速 率，用 Lineweaver-Burk 作图和 Dixon 作图来判断可逆抑制类型，计算抑制动力学参数 Ki。单点失活法测定 DES 对 CYP3A4 和 CYP2C9 是否有基于机制的抑制。结合 Ki 值和 DES 的最大血药浓度( cmax) 预测体内产生 的药物-药物相互作用。结果 DES 对 CYP3A4 和 CYP2C9 体现出浓度依赖型的抑制，相应的 IC50 值分别为 7． 4 ± 1． 0 和( 3． 8 ± 0． 1) μmol·L － 1 。DES 对 CYP3A4 和 CYP2C9 抑制的 Dixon 作图的交点都在第二象限，而 Lineweaver-Burk 作图的交点都在纵轴上，这两方面证据共同证实 DES 对 CYP3A4 和 CYP2C9 抑制属于竞争 型抑制。CYP3A4 和 CYP2C9 的 Ki 值分别为 4． 4 和 3． 0 μmol·L － 1 。DES 对 CYP3A4 和 CYP2C9 不存在基于 机制的抑制。利用 DES 的 cmax 计算出对 CYP3A4 和 CYP2C9 代谢底物 AUC 变化倍数分别为 4． 3 和 6． 2。 结论 DES 对 CYP3A4 和 CYP2C9 的活性有较强的抑制作用，在临床常用的剂量条件下，很容易诱导药物药物相互作用。
关键词: 己烯雌酚; 细胞色素 P450 CYP3A4; 细胞色素 P450 CYP2C9; 药物-药物相互作用 中图分类号: R977． 1，R969． 2 文献标志码: A 文章编号: 1000-3002( 2011) 02-0170-06 DOI: 10． 3867 / j． issn． 1000-3002． 2011． 02． 009
细胞色素 P450 酶 ( cytochrome P450，CYPs) 是 一类含有亚铁血红素的超家族酶，能催化不少化合 物的氧化反应。这些酶的重要作用之一就是清除脂 溶性外源性化合物，包括环境中的毒物和药物。然 而，有许多药物如甲羟孕酮和那可丁能调节 CYPs 的活性，进而改变联合服用的其他药物的药代动力 学，从而产生药物-药物相互作用( drug-drug interaction，DDI) ［9 － 10］。为能降低药物的不必要消耗和因 药物联合应用而引发相互作用，采用许多体外孵育 系统如人肝微粒体和重组酶来预测药物相互作用。
出抑制剂的 IC50 值。 1． 7 统计学分析
实验结 果 数 据 以 x珋± s 表 示，组 间 比 较 采 用 t
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检验。
中国药理学与毒理学杂志 2011 年 4 月第 25 卷第 2 期 Chin J Pharmacol Toxicol，Vol 25，No 2，Apr 2011
定 CYP3A4 和 CYP2C9 酶的相对活性，由下式进行
计算:
酶的相对活性
=
E抑制剂 E对照
(
%
)
=
c抑制剂 c对照
× 100%
( 2)
式( 2) 中 E抑制剂 为加入抑制剂酶的活性，E对照 为
不加抑制剂的酶的活性。c抑制剂 为 加入抑制剂代谢
产物的生成量，c对照 为不加抑制剂代谢产物的生成
量。计算得到的相对酶活性对抑制剂浓度作图，求
LC-10AVP 高效液相色谱系统包括: SCL-10AVP 系统控制器，LC-10ATVP 双泵，SPD-10AVP 紫外-可 见光 检 测 器，SIL-10ADVP 自 动 进 样 器，CLASS-VP 色谱工作站( 日本岛津公司) ; himac CR21G 高速离 心机( 日本日立公司) ; JHN-4F 超声波清洗仪( 上海 杰恩普超声设备有限公司) 。色谱柱为 DiamonsilTM C18 柱( 150 mm × 4． 6 mm，5 μm) ; 柱温为室温。 1． 2 人肝微粒体
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中国药理学与毒理学杂志 2011 年 4 月第 25 卷第 2 期 Chin J Pharmacol Toxicol，Vol 25，No 2，Apr 2011
己烯雌酚对人肝微粒体内 CYP3A4 和 CYP2C9 酶的抑制作用
曲衍清，梁 锐，孙德光，房中则，高振明，王立明 ( 大连医科大学附属第二医院普外三科，辽宁 大连 116027)
人肝样本来源于大连医科大学并经大连医科大 学伦理委员会同意。在制备肝微粒体前贮存于液氮 中。人肝微粒体的制备采用超速离心法［11］，蛋白含 量以小牛血清白蛋白为标准采用 Lowry 等［12］法测 定。采用 Omura 和 Sato 法［12］ 测 定 CYPs 的 含 量。 制备好的人体肝微粒体保存于 － 80℃ 冰箱备用。所 使用的人肝微粒体是混合人肝微粒体，可反映酶的 平均活性。 1． 3 CYP 探针底物及其反应体系和条件
因 DES 在临床上可以同其他药物共同服用，本 研究旨在利用人肝微粒体在体外预测 DES 对 2 种 CYPs 主要亚型酶 CYP3A4 和 CYP2C9 的抑制能力; 求出 DES 对 CYP3A4 和 CYP2C9 的抑制参数和抑 制类型; 通过体外数据预测 DES 诱导体内的药物-
中国药理学与毒理学杂志 2011 年 4 月第 25 卷第 2 期 Chin J Pharmacol Toxicol，Vol 25，No 2，Apr 2011