原核表达

1 非常感谢大家光临螺旋讲堂，09年第四期的主题为“外源基因在大肠杆菌高效表达技术”。我将在本期中为大家分享一些外源基因在大肠杆菌中高效表达方面的经验，希望能对大家有所帮助。

本次讲座的主要内容主要有以下几个方面： 一、外源基因高效表达概述 二、大肠杆菌表达系统的特点 三、表达载体及菌株的选择 四、产物的表达方式 五、几个常用的启动子和诱导调控表达系统 六、基因工程菌的稳定性与生长代谢的特点

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本期主讲：红果源 2009/10/10 2

一、 外源基因高效表达概述 基因表达是指目的基因在生物体中的转录、翻译以及所有加工过程。考虑的是表达产物的产量、稳定性、生物学活性和分离纯化。 宿主细胞要求： 1、容易获得较高浓度的细胞； 2、能利用廉价易得的原料； 3、不致病、不产生内毒素； 4、发热量低，需氧低，适当的发酵温度和细胞形态； 5、容易进行代谢调控； 6、容易进行DNA 重组技术操作； 7、产物的产量、产率高，产物容易提取。 宿主可分为两大类： 原核细胞—大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、链霉菌； 真核细胞—酵母菌、丝状真菌、哺乳动物细胞。 1、原核细胞 (1)、大肠杆菌 生长迅速、对其研究比较深入，所以常用，特点：表达基因工程产物的形式多种多样，有细胞内不溶性表达(包涵体)、胞内可溶性表达、细胞周质表达等，极少数还可以分泌到细胞外表达。 限制：没有信号肽，所以产品多为细胞内产物，真核蛋白质常形成不溶性的包涵体，下游处理过程中经过变性和复性处理才能恢复其生物活性。 (2)、枯草芽孢杆菌 分泌能力强可将蛋白质产物直接分泌到培养液中，不形成包含体，但该菌也不能使蛋白质产物糖基化，另外由于它有很强的胞外蛋白酶，会对产物进行降解。 (3)、链霉菌 主要特点：不致病、使用安全、分泌能力强、可将表达产物直接分泌到培养液中，具有糖基化能力。 2、真核细胞 (1)、酵母 3

特点：基因组小，繁殖迅速、可以廉价地大规模培养，没有毒性。能将表达产物直接分泌到胞外，表达产物能糖基化。 (2)、丝状真菌 特点：有很强的蛋白质分泌能力，能正确进行翻译后加工，而且糖基化方式与高等真核生物相似。 (3)、哺乳动物细胞 特点：产物可分泌到胞外，细胞培养液成分完全可控制，使产物纯化较容易，表达产物能糖基化，接近或类似与天然产物；动物细胞生产慢，生产率低，培养条件苛刻，费用高。 综上所述，目前使用最广泛的宿主仍然是大肠杆菌和酵母。因为遗传背景研究得比较清楚，建立了许多适合于它们的克隆载体和DNA导入方式，并且许多外源在这两种宿主菌中得到表达成功。

二、大肠杆菌表达系统的特点

相对于真核表达系统而言，大肠杆菌表达系统有以下优势： 1. 对大肠杆菌的遗传背景和生理特性研究已相当彻底。已有很多不同抗药性、不同营养依赖型和不同校正突变型的菌种供选择应用，可以根据不同的载体而选择不同的菌种；2. 尽管大肠杆菌细胞的空间小，但繁殖能力强，在营养条件充足时，20～30min即可繁殖一代，而且大规模发酵成本低，具有巨大的生产潜力；3. 表达水平一般较真核系统高，某些外源基因在大肠杆菌中的表达量可达总蛋白的5 %～30 %，且下游工艺简单、易于控制。但是大肠杆菌表达系统也存在不少缺点： 1. 原核细胞缺乏真核细胞所特有的翻译后加工修饰系统，如糖基化，而不少具有生物活性的蛋白是糖蛋白，因此无法用原核表达系统表达； 2. 细菌本身产生的热源、内毒素不易除去，产品纯化问题较多； 3 蛋白的高水平表达常形成包涵体，提取和纯化步骤繁琐，而且蛋白复性困难，易出现肽链的不正确折叠等问题。

三、表达载体及菌株的选择

1、表达载体 我们关心的质粒上的元件包括启动子，多克隆位点，终止密码，融合Tag，复制子，筛选标记/报告基因等。载体有条件的可以买大公司的，如Novagen、Invitrogen、Qiagen、GE（原安玛西亚），也可以根据实际需要自己重新组合。 启动子的强弱是对表达量有决定性影响的因素之一。从转录模式上看有组成型表达和诱4

导调控型表达。lac和Tac，PL和PR，T7是最常用的启动子。 核糖体结合位点是启动子下游从转录起始位点开始延伸的一段碱基序列，一般位于启动子和MSC之间，其中能与rRNA16S亚基3'端互补的SD序列对形成翻译起始复合物是必需的。有人尝试串联表达，就必须在每串基因前面都要有核糖体结合位点。 转录终止子对外源基因在大肠杆菌中的高效表达有重要作用——控制转录的RNA长度提高稳定性，避免质粒上异常表达导致质粒稳定性下降。放在启动子上游的转录终止子还可以防止其他启动子的通读，降低本底。转录终止子有两类，Rho因子作用下使转录终止mRNA和根据模版上的对称序列形成发夹结构而终止mRNA。 组成型：表达载体的启动子为组成型启动子，也就是一直努力不停表达目的蛋白的启动子，如pMAL系统。持续性表达通常表达量比较高，成本低，但是不适合表达一些对宿主细菌生长有害的蛋白。因为过量或者有害的表达产物会影响细菌的生长，反过来影响表达量的积累。同时可控性差。 诱导调控型：表达载体采用诱导型启动子，只有在诱导剂存在的条件下才能表达目的产物。这种方法有助于避免菌体生长前期高表达对菌体生长的影响，又可减少菌体蛋白酶对目标产物的降解。特别适合解决有毒蛋白的表达。另外也有启动子是组成型的，但是启动子所依赖的转录酶是诱导表达的，也属于诱导表达系统。常用化学诱导和温度诱导，诱导方式决定于启动子。 根据真核基因在原核细胞中表达的特点，表达载体应具备下列条件： (1)、载体能够独立复制，有复制起点。 (2)、应有灵活的克隆位点和方便的筛选标记，利于外源基因的克隆、鉴定和筛选。 (3)、应具有很强的启动子，能为达成杆菌的RNA 聚合酶所识别。 (4)、应具有阻遏子，使启动子受到控制，只有当诱导时才能进行转录。 (5)、应具有很强的终止子，以便使RNA聚合酶只转录克隆的外源基因，同时很强的终止子所产生的mRNA较为稳定。 (6)、所产生的mRNA必须有翻译的其始信号。 影响目的基因在大肠杆菌中表达的因素 (1)、外源基因的拷贝数 将外源基因克隆到高拷贝的质粒载体上，这对于提高外源基因的总体表达水平非常有利。 (2)、外源基因的表达效率 5

启动子的强度—在转录水平上直接影响基因的表达、核糖体结合位点的有效性、SD 序列和起始ATG 的间距、密码子的组成等都会不同程度地影响外源基因的表达。 (3)、表达产物的稳定性 可采用下列方法来提高表达产物的稳定性：组建融合基因，产生融合蛋白；利用信号肽，把真核基因产物运输到胞浆周质的空隙中，而使外源蛋白不易被酶降解；采用位点特异性突变的方法，改变真核蛋白二硫键的位置，从而增加蛋白质的稳定性；选用蛋白酶缺陷型大肠杆菌为宿主细胞。 (4)、细胞的代谢负荷 当宿主细胞的生物量达到饱和时，再进行基因产物的诱导合成，以减低宿主细胞的代谢负荷；另外，当宿主细胞迅速生长时，抑制重组质粒的复制，当细胞生长量累积到一定水平后，再诱导细胞中重组质粒的复制，增加质粒拷贝数。 (5)、工程菌的培养条件 优化培养条件使外源基因大量表达。 2．表达菌株的选择 在原核蛋白表达过程中，选择构建一个合适原核表达体系需要综合考虑3大因素：表达载体、宿主菌株、表达诱导条件以获得最满意的表达效果。事实上在平时的实验中，最容易被忽视的就是宿主菌的选择——多数人会直接选择自己实验室曾经用过的表达菌株或者是载体配套的菌株,而不去追究原因—— 即使表达结果不佳。大多在表达条件和载体上找原因也不会考究菌株的选择是否适合。 作为原核表达的宿主对外源基因的表达会产生一定的影响是勿庸置疑的。每一个宿主细胞都像一个微观的小工厂按照细胞固有的程序完成“你给它们安排的生产任务”——因为很难亲眼观察微观世界中表达是如何进行的当出现问题时我们需要经验判断问题所在。宿主细胞对原核表达可能会产生哪些影响呢？知其然还要知其所以然。比如菌株内源的蛋白酶过多可能会造成外源表达产物的不稳定，所以一些蛋白酶缺陷型菌株往往成为理想的起始表达菌株。 堪称经典的 BL21系列就是lon和OmpT蛋白酶缺陷型，也是我们非常熟悉的表达菌株。大名鼎鼎的BL21(DE3)融源菌则是添加T7聚合酶基因为T7表达系统而设计。真核细胞偏爱的密码子和原核系统有不同，因此在用原核系统表达真核基因的时候真核基因中的一些密码子对于原核细胞来说可能是稀有密码子，从而导致表达效率和表达水平很低。改造基因是比较麻烦的做法。Rosetta 2系列就是更好的选择——这种携带pRARE2质粒的BL21衍生菌，6

补充大肠杆菌缺乏的七种(AUA, AGG, AGA, CUA, CCC, GGA 及CGG)稀有密码子对应的 tRNA提高外源基因、尤其是真核基因在原核系统中的表达水平。(已经携带有氯霉素抗性质粒) 当要表达的蛋白质需要形成二硫键以形成正确的折叠时，可以选择K–12衍生菌Origami 2系列，thioredoxin reductase (trxB) 和glutathione reductase (gor)两条主要还原途径双突变菌株，显著提高细胞质中二硫键形成几率，促进蛋白可溶性及活性表达。(卡那霉素敏感) Rosetta-gami™ 2则是综合上述两类菌株的优点，既补充7种稀有密码子，又能够促进二硫键的形成，帮助表达需要借助二硫键形成正确折叠构象的真核蛋白。(卡那霉素敏感) Origami B是衍生自 lacZY突变的 BL21菌株,这个突变能根据IPTG的浓度精确调节表达产物，使得表达产物量呈现IPTG浓度依赖性。(四环素敏感) 在决定试用这些名字古怪的菌株时，有几个小技巧需要要注意，一个是不同菌株有时已经携带某个质粒或者已经具有某种抗生素抗性,要注意自己的表达质粒是否能与之兼容。比如Rosetta 2 已经携带有氯霉素抗性质粒，不能再用氯霉素筛选等等。 重组质粒和菌株的保存建议 在实验室里保存重组菌株的时候,为了挑菌和传代方便,我们常用LB平板保存在4℃冰箱中,需要提质粒和表达接种的时候,就直接从平板上挑菌,但是这种方法对于重组质粒的稳定性不利,容易出现质粒丢失、表达水平不稳定、菌株退化乃至发生污染等情况。 我们建议： 1、 长期存放菌株和pET重组子应该存在甘油-70℃保种。但是要注意高浓度甘油(>10%)会导致质粒不稳定。请尽量保持甘油浓度8%。(15%浓度的甘油保种液和新鲜菌液1:1就行) 2、重组质粒不宜长期保存于表达菌株(带DE3的大肠杆菌)中,请尽量使用带有recA endA突变的克隆菌株(比如C600,DH5a)进行质粒抽提和保存质粒。表达型的菌株提质粒经常会有质量不高或者背景的问题。特别是大量抽提。 其实不仅仅是表达,建库克隆都会涉及菌株的不同要求。感受态不是目的,菌株的背景才是关键。