高效液相色谱法测定血浆中米非司酮[1]

理化检验—化学分册P TCA(PAR T B:C H EM.ANAL.)2007年第43卷1工作简报高效液相色谱法测定血浆中米非司酮郭智勇1,魏丹毅1,储成顶2,尹耕心3,贺明莉3,吴建力3,傅克勤3(1.宁波大学材料科学与化学工程学院,宁波市新型功能材料及其制备科学实验室—省部共建国家重点实验室培育基地,宁波315211;　2.安徽医科大学公共卫生学院,合肥230032;　3.安徽省计划生育研究所,合肥230031)摘　要:建立了测定血浆中米非司酮浓度的高效液相色谱分析方法。

血浆样品以乙醚提取,常温下负压挥发至干,所得残渣用甲醇浸溶后进行测定。

Spherisorb C18(250mm×4.6mm i.d.,5μm)为色谱柱,流动相为甲醇2乙腈2水(50+25+25)溶液,检测波长为302nm,用外标法定量。

结果表明,在0.05～10.00mg・L-1范围内呈线性,检出限为0.01mg・L-1;平均回收率为98.2%,日内、日间平均精密度分别为7.0%,8.3%。

米非司酮血浆样品的萃后残渣于-20℃可保存至少7d。

关键词:高效液相色谱法;米非司酮;人血浆;血药浓度中图分类号:O657.7 文献标识码:A 文章编号:100124020(2007)0120015203Determination of Mifepristone in H uman Plasma by High PerformanceLiquid ChromatographyGU O Zhi2yong1,WEI Dan2yi1,CHU Cheng2ding2,Yin G eng2xin3,HE Ming2li3,WU Jian2li3,FU K e2qin3(1.College of M aterials S cience and Chemical Engineering,Key L aboratory of Research and Preparation ofN ovel Functional M aterials,co2supervised by Zhej ing Province and M inist ry of Education,N ingbo Universit y, N ingbo315211,China;　2.S chool of Public Health,A nhui Medical Universit y,Hef ei230032,China;3.A nhui Research I nstitute f or Famil y Planning,Hef ei230031,China)Abstract:An method for the determination of mifepristone in human plasma by high performance liquid chromatography was developed and validated.The plasma sample was extracted with ether which was removed by evaporation at room temperature under reduced pressure.The residue was taken up with methanol and the solution obtained was submitted to analysis by RP2HPL C.The chromatographic column of spherisorb C18(250mm×4.6mm,i.d.5μm)was used in the analysis,and a solution containing methanol,acetonitrile and water mixed inthe proportion of50to25to25was used as the mobile phase,passing through the column.Volume of the volumetric loop used was20μL.Ultra violet spectrophotometric detection was made at the wavelength of302nm with determination by the external standard method.Mifepristone was well separated in the HPL C,thus leading to high selectivity of determination.Linear relationship between the absorbance and concentration of mifepristone was obtained in the range of0.05to10.00mg・L-1with a detection limit of0.01mg・L-1.Value of average recovery obtained by the recovery test was98.2%.Precision test was made at3different concentration levels,average values of RSD′s(n=5)of within day test and between2day test obtained were7.0%and8.3%respectively.Residue of the sample obtained after extraction with ether and removal of ether by evaporation was proved to be stable for at least7 days when preserved at-20℃in the dry state.K eyw ords:HPL C;Mifepristone;Human plasma;Drug concentrateion收稿日期:2006202216基金项目:浙江省科技厅科技攻关项目(2006C33065)、安徽省　人口和计划生育委员会专项基金、安徽省教育厅自然科学基金　(2005K J251)资助。

作者简介:郭智勇(1973-),男,江苏江都人,讲师,博士,从事　色谱分析和电化学分析研究。

米非司酮(RU486)是一种高效子宫内膜孕酮受体拮抗剂,临床上广泛用于中孕引产[1]。

近年来众多研究认为[224],由于其代谢产物具有与母体相同的生理功能,故可将终止妊娠和紧急避孕时的米非司酮用量从200～600mg降至2～100mg。

因此,建・51・立更为灵敏有效的测定血浆中低浓度米非司酮的方法具有重要临床意义。

测定血浆中米非司酮浓度有多种方法,例如:放射性免疫测定法(RIA)[5,6]、放射性受体测定法(RRA)[7,8]、高效液相色谱法(H PL C)[9211]等。

由于存在交互作用,RIA和RRA方法不能区分米非司酮母体和代谢物,且使用放射性材料、实验程序费时昂贵、产生难以处理的废料等。

H PL C方法中, Heikinheimo等[9]的方法的检出限为0.040mg・L-1、定量限为0.250mg・L-1,Chang2hai等[10]方法的检出限为0.036mg・L-1、定量限为0.240mg ・L-1,灵敏度较低。

Stit h等[11]采用固相萃取技术处理样品,测试野狼体内米非司酮浓度,结果表明在0.010～1.000mg・L-1范围内呈线性,但该方法采用内标法,操作繁琐,所用内标物R TI230212003难以获得,且分析成本高。

本研究建立了新的简便、灵敏、准确地测定米非司酮的HPL C方法,进一步降低检测下限,延长检测时相,实现对低剂量服用米非司酮的用药监测。

1　试验部分1.1　仪器与试剂Waters600型高效液相色谱仪,包括Waters 600型高压恒流泵,Waters2487型紫外光度检测器,Empower工作站。

米非司酮标准储备溶液:称取米非司酮标准品10.0mg,溶解并定容于100.0mL甲醇中,配成质量浓度为100.0mg・L-1标准储备液。

甲醇、乙腈为HPL C级,其余试剂均为分析纯。

1.2　色谱条件Sp herisorb C18色谱柱(250mm×4.6mm i.d.,5μm);流动相:甲醇2乙腈2水(50+25+25),夏季可略改变为:甲醇2乙腈2水(50+22+28);流速0.85mL・min-1;柱温30℃;检测波长302nm。

定量管体积20μL。

1.3　血浆样品的采集与处理5名参试志愿者为孕龄健康妇女,在签署知情同意书后,单剂口服50mg米非司酮,连续服用3d,分别于第一次服药前(0h)、服药后0.5,24,48h采集静脉血,肝素抗凝,离心获取血浆,置-20℃冰箱保存以备分析。

取血浆0.5mL,补水0.5mL,涡漩混匀。

加入硫酸铵约0.1g沉淀蛋白,涡漩2min,放置5min。

加入乙醚5mL,涡漩及振摇5min,以3000r・min-1转速离心3min后转移上清液;再加入乙醚5mL,重复上述操作后合并上清液。

将提取液置负压恒温箱中,挥尽乙醚,即得萃后残渣。

向残渣内加入甲醇(夏天用95%甲醇溶液)200μL,涡旋2min,放置浸泡15min,再涡旋5min,经0.22μm微孔有机滤膜滤过,即得供试液。

1.4　米非司酮血浆标准系列溶液的配制取空白人血浆0.5mL,各加入米非司酮标准储备液适量,补水至1mL后,按照1.3节下的步骤,可得0.05,0.10,0.50,1.00,5.00,10.00mg・L-1米非司酮血浆标准系列溶液。

2　结果与讨论2.1　特异性如图1所示,(a)1mg・L-1流动相溶液,(b)空白血浆,(c)0.33mg・L-1血浆标准,(d)某志愿者血浆样品(约59μg・L-1)。

在本文的色谱条件下,米非司酮的保留时间为11.19±0.11min,重现性稳定。

10.8～11.5min时间内无血浆中内源性物质的干扰峰,10.5,11.8min的血浆内源性物质的干扰峰可与米非司酮实现基线分离,特异性良好。

图1　米非司酮的分离谱图Fig.1　Chromatograms showing separation of mifepristone2.2　标准曲线与线性范围吸取米非司酮血浆标准系列进行色谱测定,以米非司酮的峰高h(mV)为横坐标,标准溶液质量浓度C(mg・L-1)为纵坐标,回归方程C=0.04987+ 0.14824h,相关系数为0.9998,结果表明,米非司酮・61・的质量浓度在0.05～10.00mg ・L -1范围内呈线性。