高效液相色谱法同时测定牛黄上清丸中6种成分的含量_郝乘仪

牛黄上清丸首载于明代李挻的《医学入门》，具 有清热泻火、散风止痛之功效。2010 年版《中国药 典》［1］中除了 收 录 牛 黄 上 清 丸，还 收 录 了 其 胶 囊 剂 和片剂。由于本中药制剂应用较为广泛，生产厂家 众多，这就更应该注重药品的质量控制。2010 年版 《中国药典》含量测定中规定，丸剂利用液相测定的 是黄芩苷，胶囊剂液相测定的是大黄素，而片剂则采 用不同的液相方法分别测定栀子苷和黄芩苷，测定 的成分各不相同。目前笔者未见同时测定此药多种 组分含量的报道，为了更好地控制制剂质量，本实验 建立了高效液相色谱法同时测定其中 6 种成分的含 量，这对于牛黄上清丸的质量控制具有重要意义。
对照品绿原酸（ 批号 0900-200103） 、栀子苷（ 批 号 110749-200916 ） 、盐 酸 小 檗 碱 （ 批 号 110713200923） 、黄芩苷（ 批号 110715-200514） 、大黄素（ 批 号 110756-200110） 、大黄酚 （ 批号 110796-200610 ） 均购自中国食品药品鉴定研究院，牛黄上清丸（ 北 京 同 仁 堂 股 份 有 限 公 司 同 仁 堂 制 药 厂，批 号：
作者简介： 郝乘仪，女，硕士，实验师 研究方向： 中药质量标准研究 中药新药研发 Tel： （ 0432） 64560529 E-mail： fengbo2@ sina. com
中国药学杂志 2014 年 5 月第 49 卷第 9 期
* 通讯作者： 冯波，男，博士，教授 研究方向： 中药质量控制以及 Chin Pharm J，2014 May，Vol. 49 No. 9 ·769·
1材料 日本岛津 LC － 20AT 高效液相色谱仪，SPD －
20A 紫外检测器，SIL － 20A 自动进样器，岛津 LC － Solution 工 作 站， MILLIPOＲE 超 纯 水 仪 （ Synergy185 ） ，KQ － 250DE 型 数 控 超 声 波 清 洗 器 （ 昆山市超声仪器有限公司） 。
及各阴性对照溶液色谱图见图 1。 2. 5 线性考察
精密吸取混合对照品溶液 1，5，8，10，15，20 μL 分 别注入 HPLC 以峰面积（ Y） 为纵坐标，进样量（ X） 为横 坐标进行线性回归，得绿原酸、栀子苷、盐酸小檗碱、黄 芩苷、大黄素、大黄酚的线性回归方程结果见表 1。
图 1 牛黄上清丸测定中混合对照品（ A） 、样品（ B） 、不含菊 花和栀子的阴性样品（ C） 、不含栀子的阴性样品（ D） 、不含 黄连、黄柏的阴性样品（ E） 、不含黄芩的阴性样品（ F） 、不含 大黄的阴性样品（ G） 在 254 nm 处色谱图
1 － 绿原酸； 2 － 栀子苷； 3 － 盐酸小檗碱； 4 － 黄芩苷； 5 － 大黄素； 6 － 大黄酚
Fig. 1 HPLC Chromatograms of mixed reference substance （ A） ，sample （ B） ，negative sample without chlorogenic acid （ C） ，negative sample without geniposide （ D） ，negative sample without berberine hydrochloride （ E） ，negative sample without baicalin （ F） and negative sample without Ｒhei Ｒadix et Ｒhizoma （ G） at 254 nm in Niuhuang Shangqing Pills
maceutical Analysis，Jilin 132013，China）
ABSTＲACT： OBJECTIVE To establish a method for simultaneous determination of chlorogenic acid，geniposide，berberine， baicalin，emodin and chrysophanol in Niuhuang Shangqing pills（ traditional Chinese medicines） . METHODS The separation was performed on a DIKMA Platisil ODS column （ 4. 6 mm × 250 mm，5 μm） with gradient elution using methanol and 0. 1 % H3 PO4 aqueous solution as mobile phase at the flow rate of 1 mL·min － 1 . The UV detection wavelength was set at 254 nm. ＲESULTS Linear ranges of the calibration curves of chlorogenic acid，geniposide，berberine，baicalin，emodin and chrysophanol were 0. 11 － 2. 2 μg （ r = 0. 999 6 ） ，0. 048 － 0. 96 μg （ r = 0. 999 8 ） ，0. 073 － 1. 46 μg （ r = 0. 999 9 ） ，0. 1 － 2 μg （ r = 0. 999 9 ） ，0. 04 － 0. 8 μg （ r = 0. 999 5 ） ，and 0. 01 － 0. 2 μg （ r = 0. 999 6 ） ，respectively. Their average recoveries fell between 98. 26% and 99. 44% . CONCLUSION The established HPLC method can be used to determine the contents of chlorogenic acid，geniposide，berberine，baicalin，emodin and chrysophanol in Niuhuang Shangqing pills. The method can also be used for the quality control of Niuhuang Shangqing pills． KEY WOＲDS： HPLC； Niuhuang Shangqing pills； chlorogenic acid； geniposide； berberine hydrochloride； baicalin； emodin； chrysophanol
将牛黄上清丸大蜜丸剪碎，称取 1. 0 g 置蒸馏 瓶中，精密加稀甲醇 40 mL，称定质量，超声处理 30 min，超声功率为 250 W，频率为 40 KHz，置水浴上 回流 3 h，放冷，称定质量，用稀甲醇补足减失的重 量，静置，取上清液，经 0. 45 μm 微孔滤膜过滤，即 得供试品溶液。Agilent HC-C18 （ 4. 6 mm × 250 mm， 5 μm） WondaSil-C18 。 1、3015192 ） 。甲醇为色谱纯，水为 超纯化水，其他试剂均为分析纯。
2 方法与结果 2. 1 对照品溶液的制备
分别精密称取对照品绿原酸、栀子苷、盐酸小檗 碱、黄芩苷、大黄素和大黄酚适量，精密称定，置于同 一 10 mL 量瓶中，用甲醇定容并混匀，制成含绿原酸 0. 011 mg·mL － 1 、栀子苷 0. 48 mg·mL － 1 、盐酸小檗 碱 0. 073 mg·mL － 1 、黄芩苷 0. 1 mg·mL － 1 、大黄素 0. 004 mg·mL － 1 、大黄酚 0. 01 mg·mL － 1 的混合对 照品溶液。 2. 2 供试品溶液的制备
高效液相色谱法同时测定牛黄上清丸中 6 种成分的含量
郝乘仪，郭淑英，冯波* ，朱鹤云（ 吉林医药学院药学院药物分析教研室，吉林 吉林 132013）
摘要： 目的 建立同时测定牛黄上清丸中 6 种成分的方法。方法 采用 DIKMA Platisil ODS 色谱柱（ 4. 6 mm × 250 mm，5 μm） ，柱温 30 ℃ ，流动相为甲醇-0. 1% 磷酸水溶液，采用梯度洗脱 （ 0 ～ 5 min，40% ～ 40% A； 5 ～ 10 min，40% ～ 55% A； 10 ～ 16 min，55% ～ 55% A； 16 ～ 35 min，55% ～ 90% A； 35 ～ 52 min，90% ～ 90% A） ，检测波长为 254 nm，流速为 1 mL·min －1 。结果 绿原酸、栀子苷、盐酸小檗碱、黄芩苷、大黄素、大黄酚的线性范围分别为 0. 11 ～ 2. 2 μg（ r = 0. 999 6） ，0. 048 ～ 0. 96 μg（ r = 0. 999 8） ，0. 073 ～ 1. 46 μg （ r = 0. 999 9） ，0. 1 ～ 2 μg （ r = 0. 999 9） ，0. 04 ～ 0. 8 μg （ r = 0. 999 5） ，0. 01 ～ 0. 2 μg （ r = 0. 999 6） ， 平均回收率在 98. 26% 和 99. 44% 之间。结论 该法检测简便，稳定，可靠，可用于牛黄上清丸质量控制。 关键词： 高效液相色谱法； 牛黄上清丸； 绿原酸； 栀子苷； 盐酸小檗碱； 黄芩苷； 大黄素； 大黄酚 doi： 10. 11669 / cpj. 2014. 09. 016 中图分类号： Ｒ917 文献标志码： A 文章编号： 1001 － 2494（ 2014） 09 － 0769 － 04
按处方制备阴性对照溶液。分别制备不含菊花 和栀子的阴性对照溶液； 不含栀子的阴性对照溶液； 不含黄连、黄柏的阴性对照溶液； 不含黄芩的阴性对 照溶液、不含大黄的阴性对照溶液。 2. 4 色谱条件
色谱柱： DIKMA Platisil ODS 色谱柱（ 4. 6 mm × 250 mm，5 μm） ； 流动相为甲醇（ A） -0. 1% 磷酸水溶 液（ B） ，梯度洗脱 （ 0 ～ 5 min，40% ～ 40% A； 5 ～ 10 min，40% ～ 55% A； 10 ～ 16 min，55% ～ 55% A； 16 ～ 35 min，55% ～ 90% A； 35 ～ 52 min，90% ～ 90% A） ， 流速为 1 mL·min － 1 ，柱温 30 ℃ ，检测波长为 254 nm，进样 10 μL，各待测组分分离度均大于 1. 5、理 论塔板数均大于 5 000。混合对照品溶液、样品溶液