蛋白质分子量的测定
蛋白分子量和检测条带
蛋白分子量和检测条带
蛋白分子量是指蛋白质分子的质量大小，通常以千道尔顿（kDa）为单位。
蛋白质的分子量可以通过凝胶电泳等方法进行测定。
在凝
胶电泳中，可以根据蛋白质在电场中的迁移速率来估算其分子量。
另一种常用的方法是质谱分析，通过质谱仪可以准确测定蛋白质的
分子量。
而检测条带通常是指在蛋白质凝胶电泳或者免疫印迹等实验中
观察到的蛋白条带。
这些条带可以代表不同分子量的蛋白质，通过
与标准蛋白质分子量标记物进行比较，可以确定待测蛋白的分子量。
此外，检测条带的强度和位置也可以提供关于蛋白质表达水平和其
他特性的信息。
从实验角度来看，测定蛋白质分子量和观察检测条带是蛋白质
研究中非常重要的步骤。
这些数据可以帮助研究人员了解蛋白质的
结构和功能，以及在不同生理或病理条件下的变化。
同时，这些信
息也对于药物研发、疾病诊断和治疗等方面具有重要意义。
从应用角度来看，蛋白质分子量和检测条带的信息在许多领域
都有广泛的应用。
比如在生物医学研究中，可以通过测定蛋白质分
子量和观察检测条带来研究疾病机制、筛选药物靶点等。
在生物工程和生物制药领域，这些数据也可以用于优化蛋白质表达和纯化工艺。
总之，蛋白质分子量和检测条带的研究对于推动生命科学领域的发展具有重要意义。
综上所述，蛋白质分子量和检测条带在蛋白质研究中扮演着重要角色，从实验和应用两个角度来看，这些数据对于我们深入了解蛋白质的结构、功能和应用具有重要意义。
蛋白质分子量的测定方法
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◆ 1．根据化学组成测定最低相对分子质量
◆ 用化学分析方法测出蛋白质中某一微量元素的含量，并假 设分子中只有一个这种元素的原子，就可以计算出蛋白质 的最低分子量。肌红蛋白、血红蛋白均含铁0.335%，分别 求它们的最低分子量：
◆ 肌红蛋白为55.8（Fe原子量）÷0.335×100=16700，与其 他方法测分子量相符。
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◆ 4．沉降法（超速离心法） ◆ 沉降系数（S）是指单位离心场强度溶质的
沉降速度。S也常用于近似地描述生物大分 子的大小。蛋白质溶液经高速离心分离时 ，由于比重关系，蛋白质分子趋于下沉， 沉降速度与蛋白质颗粒大小成正比，应用 光学方法观察离心过程中蛋白质颗粒的沉 降行为，可判断出蛋白质的沉降速度。根 据沉降速度可求出沉降系数，将S带入公式 ，即可计算出蛋白质的分子质量。
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．蛋白质空间结构与功能的关系
◆ 蛋白质的空间结构是其生物活性的基础， 空间结构变化，其功能也随之改变。肌红 蛋白（Mb）和血红蛋白（Hb）是典型的例 子。
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◆ 肌红蛋白（Mb）和血红蛋白（Hb）都能与氧进行 可逆的结合，氧结合在血红素辅基上。然而Hb是 四聚体分子，可以转运氧；Mb是单体，可以储存 氧，并且可以使氧在肌肉内很容易地扩散。它们 的氧合曲线不同，Mb为一条双曲线，Hb是一条 S 型曲线。在低p(O2)下，肌红蛋白比血红蛋白对氧 亲和性高很多，p(O2)为2.8torr(1torr≈133.3Pa) 时，肌红蛋白处于半饱和状态。在高p(O2)下，如 在肺部（大约100torr）时，两者几乎都被饱和。 其差异形成一个有效的将氧从肺转运到肌肉的氧 转运系统。
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◆ 3．SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法
蛋白质分子量测定
蛋白质分子量测定方法目前，蛋白质分子量测定的常用方法主要有四种：年度法、凝胶过滤层析法、凝胶电泳法和凝胶渗透色谱(GPC)法。
一、粘度法一定温度条件下，高聚物稀溶液的粘度与其分子量之间呈正相关性，随着分子量的增大，聚合物溶液的粘度增大。
通过测定高聚物稀溶液粘度随浓度的变化，即可计算出其平均分子量(粘均分子量)。
该方法操作简单、设备价格较低，通常不需要标准样品，但无法测定聚合物的分子量分布。
粘度法所需设备：恒温槽、乌倍路德粘度计。
二、凝胶过滤层析法在凝胶色谱柱中，分子量不同的聚合物分子，由于其渗入凝胶微孔的能力不同而在柱中得以分离。
分子量较大的分子，渗入凝胶微孔较浅，随洗脱液流动速度较快，因而先流出色谱柱；相反，分子量较小的聚合物分子后流出。
通过测定从进样到聚合物分子流出色谱柱期间流过凝胶柱的洗脱液的体积，并与标准样品比较，即可计算聚合物的分子量，并估算其分子量分布。
凝胶层析技术操作方便，设备简单，样品用量少，而且有时不需要纯物质，用一粗制品即可，目前已得到相当广泛的应用。
凝胶层析法测定分子量也有一定的局限性，在pH6—8的范围内，线性关系比较好，但在极端pH时，一般蛋白质有可能因变性而偏离。
糖蛋白在含糖量超过5%时，测得分子量比真实的要大，铁蛋白则与此相反，测得的分子量比真实的要小。
凝胶过滤层析法所需设备：层析柱、紫外分光光度计。
三、SDS-凝胶电泳法SDS是十二烷基硫酸钠的简称，它是一种阴离子表面活性剂，加入到电泳系统中能使蛋白质的氢键和疏水键打开，并结合到蛋白质分子上（在一定条件下，大多数蛋白质与SDS的结合比为1.4gSDS/1g蛋白质），使各种蛋白质-SDS复合物都带上相同密度的负电荷，其数量远远超过了蛋白质分子原有的电荷量，从而使其电泳迁移率只取决于分子大小这一因素，于是根据标准蛋白质分子量的对数和迁移率所作的标准曲线，可求得未知物的分子量。
SDS-凝胶电泳法是目前蛋白质分子量测定中使用最广泛的方法，实验成本较低，仪器设备也相对很简单，一套电泳装置即可。
分子量大约为5000kd的蛋白质分子量检测体积排阻
为了测定分子量大约为5000kd（即5×10^6 Da）的蛋白质分子的分子量，采用体积排阻色谱法（SEC）是一种常用的方法。
这种方法基于分子流过凝胶孔洞时的排阻作用来分离不同大小的分子。
在体积排阻色谱中，凝胶或聚合物的孔径决定了它们能够分离的最大分子量。
通常，商用SEC柱的孔径范围从几百纳米到几微米不等。
因此，对于5×10^6 Da的蛋白质分子，需要选择孔径足够小的凝胶来确保其完全排阻。
具体的选择取决于所使用的SEC柱的规格和性能。
一般来说，对于这种分子量范围的蛋白质，使用具有较小孔径的SEC柱是一种理想的选择，如使用细粒度的Superdex或Toya Soka GEL。
在实际操作中，使用适当规格的SEC柱并遵循色谱柱的操作指南至关重要。
通过这种方式，可以获得准确且可靠的分子量测定结果。
同时，也可以根据所使用的设备规格和手册，进行具体的色谱柱选择和操作步骤。
蛋白质 分子量 色谱
蛋白质 分子量 色谱
蛋白质的分子量可以通过色谱法进行测定。
色谱法是一种分离和分析混合物的技术，它基于混合物中各成分在固定相和流动相之间的分配系数不同而实现分离。
在蛋白质分子量的测定中，常用的色谱技术是凝胶过滤色谱（Gel Filtration Chromatography，GFC）和高效液相色谱 （High Performance Liquid Chromatography，HPLC）。
凝胶过滤色谱是一种基于分子筛原理的色谱技术，它使用具有一定孔径大小的凝胶作为固定相，通过分子量大小的差异来分离蛋白质。
蛋白质分子通过凝胶孔时，分子量较小的蛋白质会更容易进入凝胶孔中，而分子量较大的蛋白质则会被排除在凝胶孔外，从而实现分离。
通过测量蛋白质的洗脱时间和分子量标准品的洗脱时间，可以计算出蛋白质的分子量。
高效液相色谱则是一种基于吸附-解吸原理的色谱技术，它使用高效液相色谱柱作为固定相，通过蛋白质与固定相之间的相互作用来分离蛋白质。
在高效液相色谱中，蛋白质的分子量可以通过测量其保留时间和分子量标准品的保留时间来计算。
蛋白质的分子量通常是一个范围，而不是一个确定的值，因为蛋白质
分子在溶液中的构象可能会发生变化，从而影响其分子量的测量结果。
因此，在使用色谱法测量蛋白质分子量时，需要选择合适的色谱条件和分子量标准品，并进行适当的校正和验证。
蛋白直径 分子量
蛋白直径分子量蛋白质是生物体中至关重要的分子，其结构和功能的研究对于深入了解生命现象和疾病机制具有重要意义。
在蛋白质研究中，蛋白直径和分子量是两个关键参数。
本文将介绍蛋白直径与分子量的基本概念、测量方法以及在生物科学中的应用和重要性。
一、蛋白直径与分子量的基本概念蛋白直径是指蛋白质分子在空间中的最大尺寸，通常用纳米（nm）作为单位。
分子量则是指蛋白质分子中所有原子质量的总和，单位为道尔顿（Da）。
这两个参数可以反映蛋白质的结构特征和功能性质。
二、蛋白直径与分子量的测量方法1.光散射法：通过测量蛋白质溶液中的光散射强度，结合斯托克斯-埃雷尔方程，计算出蛋白直径和分子量。
2.动态光散射法：通过测量蛋白质溶液在动态条件下的光散射强度，计算出蛋白直径和分子量。
3.电泳法：利用电场驱动蛋白质分子在凝胶中迁移，根据迁移速度和分子量的关系，计算出蛋白直径和分子量。
4.质谱法：通过对蛋白质进行断裂解离，分析断裂片段的质量，推算出蛋白质的分子量。
三、蛋白直径与分子量的应用领域1.生物化学与分子生物学研究：蛋白直径和分子量对于研究蛋白质结构与功能的关系具有重要意义。
2.药物研发：通过测量药物靶点蛋白的直径和分子量，有助于筛选潜在的药物候选分子。
3.生物传感器：利用蛋白直径和分子量的特异性，开发具有高灵敏度和特异性的生物传感器。
4.生物工程：在蛋白质工程中，精确测量蛋白直径和分子量有助于优化蛋白质设计和生产过程。
四、蛋白直径与分子量在生物科学中的重要性1.结构生物学：蛋白直径和分子量是蛋白质结构研究的基础数据，有助于揭示蛋白质的空间构象和功能域。
2.功能研究：蛋白直径和分子量与蛋白质的生物活性、相互作用、定位等生物学功能密切相关。
3.疾病诊断与治疗：蛋白质异常导致的疾病，如肿瘤、炎症等，其蛋白直径和分子量的变化可作为疾病诊断和治疗的生物标志物。
五、提高蛋白直径与分子量测量技术的展望随着生物科学技术的不断发展，蛋白直径和分子量测量技术也在不断进步。
高等生化实验报告：蛋白质分子量的测定
实验一蛋白质分子量的测定—凝胶层析法一、原理凝胶层析法也称分子筛层析法，是利用具有一定孔径大小的多孔凝胶作固定相的层析技术。
当混合物随流动相经过凝胶层析柱时，其中各组分按其分子大小不同而被分离的技术。
该法设备简单、操作方便、重复性好、样品回收率高。
凝胶是一种不带电的具有三维空间的多孔网状结构、呈珠状颗粒的物质，每个颗粒的细微结构及筛孔的直径均匀一致，像筛子，小的分子可以进入凝胶网孔，而大的分子则排阻于颗粒之外。
当含有分子大小不一的蛋白质混合物样品加到用此类凝胶颗粒装填而成的层析柱上时，这些物质即随洗脱液的流动而发生移动。
大分子物质沿凝胶颗粒间隙随洗脱液移动，流程短，移动速率快，先被洗出层析柱；而小分子物质可通过凝胶网孔进入颗粒内部，然后再扩散出来，故流程长，移动速度慢，最后被洗出层析柱，从而使样品中不同大小的分子彼此获得分离。
若分子大小介于上述完全排阻或完全渗入凝胶的物质，则居二者之间从柱中流出。
总之，各种不同相对分子质量的蛋白质分子，最终由于它们被排阻和扩散的程度不同，在凝胶柱中所经过的路程和时间也不同，从而彼此可以分离开来。
将凝胶装在柱后，柱床体积称为“总体积”，以Vt表示。
实质上Vt是由Vo，Vi与Vg三部分组成，Vo称为“孔隙体积”或“外水体积”，即存在于柱床内凝胶颗粒外面空隙之间的水相体积，相应于一般层析法中柱内流动相的体积；Vi为内体积，即凝胶颗粒内部所含水相的体积。
Vg为凝胶本身的体积。
洗脱体积（Ve）与Vo与Vi之间的关系可用下式表示：Ve=Vo+KdVi。
式中Ve为洗脱体积，自加入样品时算起，到组分最大浓度（峰）出现时所流出的体积；Kd为样品组分在二相间的分配系数，也可以说Kd是分子量不同的溶质在凝胶内部与外部的分配系数。
它只与被分离的物质分子的大小和凝胶颗粒孔隙的大小分布有关，而与柱的长度粗细无关，也就是说它对每一物质为常数，与柱的物理条件无关。
Kd可通过实验求得，上式可以改写为:Kd=(Ve-Vo)/Vi。
蛋白质的分子量测定
蛋白质的分子量测定-SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法目的要求∙学会SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法原理。
∙掌握用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质分子量的操作技术。
实验原理:SDS是十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate）的简称，它是一种阴离子表面活性剂，加入到电泳系统中能使蛋白质的氢键、疏水键打开，并结合到蛋白质分子上（在一定条件下，大多数蛋白质与SDS 的结合比为1.4g SDS/1g蛋白质），使各种蛋白质-SDS复合物都带上相同密度的负电荷，其数量远远超过了蛋白质分子原有的电荷量，从而掩盖了不同种类蛋白质原有的电荷差别。
这样就使电泳迁移率只取决于分子大小这一因素，于是根据标准蛋白质分子量的对数和迁移率所作的标准曲线，可求得未知物的分子量。
试剂和器材一、试剂30％分离胶贮存液：30g Acr,0.8g Bis, 用无离子水溶解后定容至100mL,不溶物过滤去除后置棕色瓶贮于冰箱。
10％浓缩胶贮存液：10g Acr,0.5g Bis, 用无离子水溶解后定容至100mL,不溶物过滤去除后置棕色瓶贮于冰箱。
分离胶缓冲液（Tris-HCl缓冲液PH8.9）:取1mol/L盐酸48mL，Tris 36.3g,用无离子水溶解后定容至100mL。
浓缩胶缓冲液（Tris-HCl缓冲液PH6.7）:取1mol/L盐酸48mL, Tris 5.98g,用无离子水溶解后定容至100mL。
电泳缓冲液（Tris-甘氨酸缓冲液PH8.3）:称取Tris 6.0g, 甘氨酸28.8g, SDS 1.0g, 用无离子水溶解后定容至1L。
样品溶解液：取SDS 100mg，巯基乙醇0.1mL，甘油1mL，溴酚蓝2mg，0.2mol/L，pH7.2磷酸缓冲液0.5mL，加重蒸水至10mL（遇液体样品浓度增加一倍配制）。
用来溶解标准蛋白质及待测固体染色液：0.25g考马斯亮蓝R-250，加入454mL 50%甲醇溶液和46mL冰乙酸即可。
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南京林业大学实验报告
专业学号姓名日期
实验四蛋白质分子量的测定
SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳法
一、实验原理
1.聚丙烯酰胺凝胶电泳（ PAGE ）是根据被分离物质所带的电荷多少及其分子大小、形状的不同，在电场的作用下，产生不同的移动速度而分离的方法。
它具有电泳和分子筛的双重作用。
2.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（ SDS-PAGE) ，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS （十二烷基硫酸钠）。
3.SDS是阳离子去污剂，作用有四：去蛋白质电荷、解离蛋白质之间的氢键、取消蛋白分子内的疏水作用、去多肽折叠。
（空间构象破坏）
4.蛋白质与SDS分子按比例(1.4gSDS/g蛋白质)结合，形成带负电荷的SDS-蛋白质复合物，其负电荷远远超过了蛋白质分子原有的电荷,因而降低或消除了各种蛋白质分子之间天然的电荷差异，由于SDS与蛋白质的结合是按重量成比例的，因此在进行电泳时，蛋白质分子的迁移速度取决于分子大小。
5.当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bX，
式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b均为常数。
若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。
二、凝胶的原理
1.聚丙烯酰胺（Acr）单体和交联剂 N ， N –亚甲基双丙烯酰胺（Bis 在催化剂的作用下聚合成含有酰胺基侧链的脂肪族长链。
相邻的两个链通过亚甲基桥交联起来就形成三维网状结构的聚丙烯酰胺凝胶。
2.双丙烯酸铵决定交联形成的程度，丙烯酰胺决定决定交联的长度
3.常用的催化剂（包括催化剂和加速剂）
（1）过硫酸铵 (AP) – TEMED （四甲基乙二胺）系统
在 Acr 和 Bis 的溶液中放入这个催化系统后，过硫酸铵 [（NH4）2S2O8 ] 产生出游离氧原子使单体成为具有游离基的状态，从而发生聚合作用。
聚合的初速度和过硫酸铵浓度的平方根成正比。
这种催化系统需要在碱性条件下进行（pH8.8)。
（2）核黄素– TEMED 系统
这是一个光激发的催化反应。
核黄素在光照下分解，被还原成无色型，但在有氧条件下，无色型又被氧化成有游离基的黄素环，使聚合作用开始。
4.凝胶的浓度：
常用的所谓标准胶是指浓度为 7.5 ％的凝胶，大多数生物体内的蛋白质在此
胶中电泳都能得到满意的结果。
当分析一个未知样品时，常常先用 7.5 ％的标准凝胶或用4％～ 10％的凝胶梯度来试测，选出适宜的凝胶浓度。
5.SDS-PAGE电泳系统有两种：
（1）连续聚丙烯酰胺电泳系统：凝胶全部有分离胶组成，不具备浓缩效应。
（2）不连续的聚丙烯酰胺电泳系统：由浓缩胶和分离胶组成。
通过浓缩效应、电荷效应和分子筛效应，使蛋白质在进入分离胶之前，快、慢离子之间浓缩成一薄层，有利于提高电泳的分辨率。
三、实验试剂：
Acr（acrylamide）/Bis 储备液
10% (w/v) SDS ：
TEMED(四甲基乙二胺)
过硫酸铵 (AP):10%现配现用
Tris－HCL缓冲系统，
分离胶缓冲液（1.5 mol/L Tris-HCl, pH 8.8）
浓缩胶缓冲液（0.5 mol/L Tris-HCl, pH 6.8
电极泳缓冲液：使用的Tris－甘氨酸缓冲系统：pH 8.3内含SDS
样品缓冲液（62.5 mmol/L Tris-HCl, pH 6.8 ）
染色液（考马斯亮蓝 R-250）
脱色液：（甲醇：冰醋酸：水=4：1：5）
溴粉兰：0.1%
四、实验步骤：
l. 贮液配制：
应注意：
（1）配好的贮液用棕色瓶盛装置冰箱内保存，可放 l ～ 2 个月。
（2）过硫酸铵应当天配制。
（3）如有不溶物要过滤。
（4）显色液用前再混和。
（5）电极缓冲液用时稀释 10 倍。
2. 安装夹心式垂直板电泳槽
3.配胶：采用不连续系统
1）分离胶的制备（10ml，12%）：
4. 样品的处理及点样：
将提取的蛋白质（或标准蛋白）中加入等体积的上样缓冲液，混匀，置于沸水浴中加热5min，冷却后经10000rpm离心15min，取上清液点样。
5.电泳：
将制好胶的电泳槽放入底座中，加入电极缓冲液，上层液中加入溴粉兰指示剂，连接好电泳仪，开始电泳。
浓缩胶恒压75V，分离胶恒压120V，电泳时间约90min。
6.染色和脱色：
当蓝色染料迁移至距离橡胶框下缘 1 cm 时，电泳结束。
将胶剥离，放入容器中，用蒸馏水清洗2-3遍，倒入染色液染色2-3h或静置过夜。
染色结束后，用蒸馏水冲洗胶2-3遍，以清除多余的染料，倒入脱色液，置于脱色摇床上脱色，中间换1-2次脱色液，直至背景色完全脱掉。
附：样品的制备
称取植物材料 1 g ，放入研钵内，加 pH8.0 提取液 1 mL ，于冷水浴中研成匀浆，然后以 2 mL 提取液分几次洗入离心管，在高速离心机上以8000 rpm 离心 10min
注意事项 :
制备凝胶应选用高纯度的试剂，否则会影响凝胶聚合与电泳效果。
五、实验结果
logMV=K-bX
由图线得：K= 8.44 b=4.51
六、反思总结
本次实验操作十分复杂并且耗时长，所以我们就以理论方式来完成这次实验。
通过学习理论知识我知道这次实验有一定的危险性，所以在做实验时就要需要注意人身安全。