生化大实验生技实验2
生化实验基本操作生化实验基本技能训练
个人观点供参考，欢迎讨论！
插入液面下0.5-１cm，吸至最高刻度上方1-2cm。
4、调准刻度（三点一线）
溶液弯月面、视线和刻度线在同一水平上。
5、放液（贴壁勿内）
刻度吸管有“吹”、“快”两种规格。 “吹” ：溶液停止流出后，应 将管内剩余的溶液吹出； “快”：待溶液停止流出后，一般等待15秒钟 拿出。
6、放置（放回吸管架）禁止平放在实验台面上！ 7、洗涤（操作结束后）
（检查一下试管架上的试管是否干净？）
09年秋季学期
5
溶液的混匀技术
❖甩动混匀(最常用的方法） 右手持试管上部，
❖弹打混匀
轻轻甩动振摇
❖旋转混匀
❖倒转混匀
❖玻棒搅拌混匀
❖吸管混匀
❖振荡器混匀
❖电磁搅拌混匀
选用原则：
根据所使用的器皿和液体的容量选用。
09年秋季学期
6
09年秋季学期
7
刻度吸管的使用
1、选管（大小合适）总容量最好等于或稍大于取液量。 2、执管（左球右管） 3、取液（一下一上）取液之前必须用样品润洗吸管2-３次！！
实验内容
1 生化实验基本技能训练 2 分光光度计的使用
Folin-酚试剂法 3 测定蛋白质含量
1
生化实验基本技能训练
生物化学与分子生物学实验教学中心
内容
1 玻璃器皿的洗涤 2 溶液的混匀技术 3 吸量管和加样器的使用
09年秋季学期
3
玻璃器皿的洗涤及干燥
❖ 1、使用过的玻璃器皿的洗涤（即常规洗涤方法） ❖ 2、新购置的玻璃器皿的洗涤 ❖ 3、血清堵塞刻度吸管洗涤 ❖ 4、油污烧杯试管洗涤 ❖ 5、比色杯的洗涤（禁用毛刷刷洗）液体，则及时用水洗净。
生化大实验——精选推荐
实验一密度梯度离心法提取叶绿体探索新鲜菠菜叶片叶绿体的分离纯化及其叶绿体蛋白质提取方法，为深入研究甘蔗叶绿体蛋白质组学奠定基础。
以叶片为材料，通过差速离心法制备粗叶绿体制品，分别利用蔗糖密度梯度离心和Percoll梯度离心进一步分离纯化完整叶绿体；提取叶绿体蛋白质，并进行电泳分析。
两种密度梯度离心法均可获得纯度和完整率较高的叶绿体，但蔗糖密度梯度离心法具有分离时间较短、成本较低，分离的叶绿体完整率、纯度和含量高等特点，并且提取的叶绿体蛋白质电泳条带清晰,蛋白质数量多且较全。
与Pecoll梯度离心法相比，蔗糖密度梯度离心法更适宜于在亚细胞水平上进行甘蔗蛋白质组学研究。
1 实验目的掌握手工制作密度梯度技术，了解蔗糖密度梯度离心的原理及优缺点。
2 实验原理密度梯度离心就是通过扩散法用相同的缓冲液把梯度介质配成不同浓度的梯度液，采用上铺法（或下铺法）将密度最大的梯度液置于离心管的底部，而把密度最小的梯度液铺在梯度的最上层，然后经之一段时间（最好放在与离心管温度相同的温度下，一般为24小时），让密度梯度溶质扩散，最后形成一种较为平坦的梯级梯度。
然后在密度梯度介质液柱的顶部铺上一层样品溶液，在离心期间，样品中的各种亚细胞组分会按照它们各自的沉降速度，被分成一系列的样品区带离心。
这种离心方法的基本依据是利用样品颗粒或大分子的不同沉降速率从而达到分离的目的。
密度梯度的作用在于一方面支撑样品溶液，另一方面用来稳定区带以防离心期间梯度柱中产生的对流对它的破坏。
颗粒在梯度中移动的快慢。
取决于它们的大小、形状、密度和离心力以及梯度介质的密度和黏度。
在含有不同颗粒的混合样品中，各种颗粒的移动是相互独立的，因此在各种颗粒的S值相差很小的情况下也能达到分离目的。
用两种或若干种浓度的蔗糖制成的梯度，在离心条件下，叶绿体和比它沉降系数小的细胞组分聚集到梯度交界处，而沉降系数较大的细胞组分沉到离心管底部。
通过这种方法可粗略的分离叶绿体。
生化实验报告2
实验二蛋白质含量的测定一、实验目的1.学习微量凯氏定氮法的原理。
2.掌握微量凯氏定氮法的操作技术，包括标准硫酸铵含氮量的测定、未知样品的消化、蒸馏、滴定及其含氮量的计算等。
二、实验设备及材料1. 所需试剂（1）硫酸铜（2）硫酸钾（3）浓硫酸（3）氢氧化钠（4）硼酸（5）盐酸（6）溴甲酚绿（7）95%乙醇（8）甲基红（9）无水碳酸钠（10）蒸馏水2. 仪器1）BUCHI定氮仪（型号）、消化炉（型号）及消化管、消化管架、消化管夹2）超声波清洗机3）塑料桶4）电子天平（0.1mg）5）称样勺6）烧杯7）玻璃棒8）1000ml或2000ml定容瓶9）电炉10）酸式滴定管11）马弗炉12. 250ml锥形瓶13. 胶头吸管14. 棕色小瓶15）10ml移液管16）洗耳球17）50ml定量瓶三、实验原理、内容、步骤1. 原理：天然有机物(如蛋白质、核酸及氨基酸等)的含氮量常用微量凯氏定氮法来测定。
当被测的天然含氮有机物与浓硫酸共热时，分解出氮、二氧化碳及水。
氮转变出的氨与硫酸化合生成硫酸铵。
分解反应进行得很慢，可加入硫酸铜及硫酸钾或硫酸钠促进之，其中硫酸铜为催化剂，硫酸钾或硫酸钠可提高消化液的沸点。
氧化剂过氧化氢也能加速反应。
消化完了后，在凯氏定氮仪中加入强碱碱化消化液，使硫酸铵分解，放出氨。
用水蒸汽蒸馏法，将氮蒸入过量标准无机酸溶液中，然后用标准碱溶液进行滴定，准确测定氨量，从而折算出含氮量。
以甘苷酸为例，该过程的化学反应如下:1. CH2-COON│ ＋3H2S04→2C02＋3S02＋4H20+NH3 NH22. 2NH3十H2S04→(NH4)2SO43. (NH4)2S04+2NaOH→2H2O+Na2SO4＋2NH3↑测定时常用硼酸溶液收集氨，氨与溶液中的氢离子结合，生成铵离子，使溶液中氢离子浓度降低。
然后再用强酸滴定，直至恢复溶液中原来氢离子浓度为止。
所用的强酸的当量数即相当于被测样品中氨的当量数。
生化大实验
目录
实验一 蛋白质含量的测定 实验二 离子交换法血清纯化IgG 实验三 离子交换层析法分离血清白蛋白 实验四 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定分子量 实验五 等电聚焦法测定样品的等电点 实验六 质粒的分离与纯化 实验七 PCR扩增目的基因片段 实验八 酶联免疫吸附实验
实验一 蛋白质含量的测定
（一）考马斯亮蓝法
表1-2 紫外分光光度法测定蛋白质浓度---标准曲线的绘制
项目 标准蛋白液/ml
蒸馏水/ml 蛋白质浓度/ml
A280
1 2 3 4 5 6 78 0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 4.0 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0 0 0.125 0.25 0.375 0.50 0.625 0.75 1.0
《生化大实验》
实验课程简介
生化大实验是一门综合性的实验课程， 教学的目的在于通过对生命物质的分离制 备，纯化，分析等综合性实验，在已掌握 的基础生物化学理论知识和生化实验常用 方法的基本原理、基本操作技术（如滴定、 比色、层析、电泳等）的基础上，训练学 生的综合实践动手能力，掌握蛋白质、酶、 核酸等重要物质的分离、纯化等的测定技 术。
【试 剂 和 器 材】 1. 2.0mg/mL牛血清白蛋白溶液 2. 容量瓶10ml（×6） 3. 试管1.5cm×15cm（×8） 4. 双缩脲试剂：溶解0.175g硫酸铜（CuSO4
5H2O）溶于15ml水中，在100ml容量瓶中加入30ml 浓氨水、30ml冷蒸馏水和20ml饱和氢氧化钠，摇匀， 室温1-2h定容100ml，摇匀备用。在搅拌下加入 300ml 10%氢氧化钠溶液，用水稀释到1000ml， 贮存在内壁涂以石腊的瓶中。此试剂可长期保存。若 贮存瓶中有黑色沉淀出现，则需要重新配制。
生化大实验生技实验2
细菌的生长现象
培养基 组成 0.3% 牛肉膏 1% 蛋白胨 0.5% NaCl 液体培养基 ＋ 1.8% 琼脂 液体培养基 ＋ 0.5% 琼脂 生长现象 均匀混浊 沉淀生长 表面生长(菌膜) 表面生长(菌膜) 主要用途
液体培养基
增菌
固体培养基
菌落(colony) 菌落(colony) 菌苔(mossy) 菌苔(mossy)
实验结果
培养后
（三）纯种接种培养
1、斜面接种 2、平板密集划线 3、液体接种 4、半固体穿刺接种
1、斜面接种
用途： 用途：保存菌种 分类：点种、中央划线、稀波状蜿蜒划线、 分类：点种、中央划线、稀波状蜿蜒划线、密波状
蜿蜒划线、分段划线、纵向划线、挖块接种等。 蜿蜒划线、分段划线、纵向划线、挖块接种等。
用接种针接种，要求原路返回！ 用接种针接种，要求原路返回！
三、实验器材
菌种：混合菌悬液，大肠杆菌、 1. 菌种：混合菌悬液，大肠杆菌、表 枯草芽孢杆菌、 葡、枯草芽孢杆菌、甲型副伤寒杆菌 培养基：固体平板、液体培养基、 2. 培养基：固体平板、液体培养基、 斜面、半固体。 斜面、半固体。 其它：接种环、接种针、酒精灯、 3. 其它：接种环、接种针、酒精灯、 无菌平板等
镍铬丝
2、刻度吸管：主要用于接种液体培养物 、刻度吸管：
实验室中常用的吸管
10ml移液管 10ml移液管
1ml移液管 1ml移液管
毛细吸管
3、玻璃涂布棒：主要用于分离或微生物 、玻璃涂布棒： 计数时的平板涂抹。 计数时的平板涂抹。
接种工具在使用前后都应该进行灭菌！ 接种工具在使用前后都应该进行灭菌！
3、液体接种 、
用途： 用途：增菌 菌种：大肠杆菌、 菌种：大肠杆菌、枯草芽孢杆菌
生化实验2-2010.6.30
实验操作
取6支10ml干净试管 按下表取样，混匀，放置2min。在595nm 下比色，纪录数据。以OD值为纵坐标、标准蛋白含量（mg/ml） 为横坐标作图，得到标准曲线。由此标准曲线，根据测出的未 知样品的OD值，即可查出未知样品的蛋白含量。 试管编号 1mg/ml标准蛋白溶液(ml) 0 0.0 1 0.01 2 0.02 3 4 5
持稳定。
实验器材
（1）分析天平 （2）移液器 （3）试管、试管架 （4）离心机、离心管 （6）烧杯、量筒
Hale Waihona Puke （7）分光光度计762分光光度计
主要试剂
1、生理盐水：称0.9g NaCl，用蒸馏水定溶至100mL。 2、蛋白质标准液（1 mg/ml）：称小牛血清白蛋白100mg，用蒸 馏水定溶至100mL。 4、考马斯亮蓝G-250溶液：称100mg考马斯亮蓝G-250，加95% 乙醇50mL，加85%（W/V）H3PO4 100mL，用蒸馏水定溶至 1000mL，置棕色瓶过夜，再用二层滤纸过滤。最终试剂中含 0.01%(W/V)考马斯亮蓝G-250，4.7%(W/V)乙醇。
白质结合后变为蓝色，前者最大吸收波长为 488nm ，后者为
595nm。在一定蛋白浓度范围内（0.01~1.0mg/ml），蛋白质-色 素结合物在 595nm 波长下的光吸收与蛋白质含量成正比，故可 用于蛋白质的定量分析。蛋白质和考马斯亮蓝G-250结合2min左 右达到平衡，完全反应十分迅速，其结合物在室温下1小时内保
可用乙醇将比色杯壁上的蓝色洗干净。
结 束！
实验二
蛋白质的比色定量分析
——考马斯亮蓝法
实验目的
熟悉分光光度计的基本原理和使用方法 掌握利用考马斯亮蓝定量分析蛋白质的方法
生化实验二
试管编号 试剂 1（种子酶稀释液） V（0.2%淀粉溶液）/ml V(标准麦芽糖溶液）/ml V( V(蒸馏水）/ml /ml V(酶液）/ml 1 0.5 2（幼苗酶稀释液） 1 0.5 3（空白管） 1 0.5 -
混匀各管，45 ℃恒温水浴，水解3min，加入1% 3，5-二硝基水杨酸溶液2ml 入沸水浴，准确加热5min，迅速冷却至室温，加水稀释至20ml，混匀
糖含量为横坐标， A500nm值为纵坐标，绘制标准曲线。 2、萌发小麦种子 浸泡小麦种子24h，入25℃恒温箱或在室温下发芽。 3、提取小麦萌发前后的酶液 1）幼苗酶的提取：取萌发的幼苗10株，剪去根部，入研钵加石英砂， 10ml1%NaCl，研磨成匀浆，0-4 ℃下放置20min。离心（2000rpm， 10min），测定上清酶液的总体积。 2）种子酶的提取：取干燥种子10粒作对照，操作方法同上。 4、二硝基水杨酸法测定酶活力 量取待测酶液1ml，ph6.9的0.02mol/L磷酸缓冲液稀释10倍，作为酶活力 测定物。按下表加各物质。
实验二 小麦萌发前后淀粉酶活性的比较
一、实验目的及要求 1、学习分光光度法测定淀粉酶活力的原理与方法 2、了解小麦萌发前后的淀粉酶活力的变化 二、实验基本原理 淀粉酶是水解淀粉的糖苷键的一类酶的总称。实验证明，在某些植物如小 麦、大麦的休眠种子中只含有β-淀粉酶，α-淀粉酶是在发芽过程中形成的， 所以在禾谷类萌发的种子和幼苗中，这两类淀粉酶都存在。其活性随萌发时 间的延迟而增高。 本实验以淀粉酶催化淀粉生成麦芽糖的速度来测定酶的活力。麦芽糖是还 原糖，能使3，5-二硝基水杨酸还原成棕色的3-氨基-5-硝基水杨酸，后者在 500nm处有最大吸光度，而进行定量测定。 三、主要仪器设备及实验耗材 小麦种子，可见分光光度计，离心机，恒温水浴，研钵等 标准麦芽糖，淀粉， 3，5-二硝基水杨酸溶液，氯化钠，磷酸缓冲液，石英 砂 四、实验内容和步骤 1、制作标准曲线 以不同浓度梯度的标准麦芽糖液与3，5-二硝基水杨酸反应，测定A500nm，以麦芽
生物大实验2(酶工程实验)
实验一酶促反应中初速度时间范围测定一、实验目的1.了解酶促反应中初速度时间范围测定的基本原理；2.掌握酶促反应中初速度时间范围的测定方法。
二、实验原理酸性磷酸酯酶（acid phosphatase, EC 3.1.3.2）广泛分布于动植物体中，尤其是植物的种子、动物肝脏和人体的前列腺中。
它对生物体内核苷酸、磷蛋白和磷脂的代谢起着重要作用。
酸性磷酸酯酶能专一性水解磷酸单酯键。
以人工合成的对硝基苯磷酸酯（4-nitrophenyl phosphate,NPP）作底物，水解产生对硝基苯酚和磷酸。
在碱性溶液中，对硝基酚的盐离子于405nm处光吸收强烈，而底物没有这种特性。
利用产物的这种特性，可以定量的测定产物的生成量，从而求得酶的活力单位。
即通过测定单位时间内405nm处光吸收值的变化来确定酸性磷酸酯酶的活性。
酸性磷酸酯酶的一个活力单位是指在酶反应的最适条件下，每分钟生成1μmol产物所需的酶量。
要进行酶活力测定，首先要确定酶反应时间。
而酶的反应时间应该在初速度时间范围内选择。
可以通过进程曲线的制作来求出酶的初速度时间范围。
进程曲线的制作是指在酶反应的最适条件下，采用每隔一定时间测定产物生成量，以酶反应时间为横坐标，产物生成量为纵坐标绘制而成。
从进程曲线可知，在曲线起始的一段时间内为直线，其斜率代表初速度。
随着反应时间的延长，曲线趋于平坦，斜率变小，反应速度下降。
要真实反映出酶活力大小，就应在初速度时间内测定。
三、实验试剂与器材1.试剂（1）酸性磷酸酯酶原液（从绿豆芽中提取）（2）酸性磷酸酯酶液（通过原酶液稀释得到）取原酶液，用0.05mol/L、pH5.0柠檬酸盐缓冲液稀释，使进程曲线中第11号管吸光度A在0.6～0.7之间。
405（3）1.2mmol/L对硝基苯磷酸酯精确称取NPP0.4454g，加缓冲液定容至100mL。
（4）0.3mol/LNaOH溶液2．器材恒温水浴槽，可见分光光度计，试管，刻度吸管，离心机。
实验2 酶切 片段回收和连接
酶切、片段回收与连接黄华如（生命科学学院，生技091，29号）摘要：实验用bt2质粒和pet质粒做酶切材料，回收目的片段，经连接后，转入以氯化钙罚制备的大肠杆菌感受态细胞中，并让转化大肠杆菌在含有抗生素培养基上生长，最后用长出来的大肠杆菌做验证PCR。
本次试验中，质粒经过双酶切后，可以清晰的看到目的条带，转化后的大肠杆菌也可以在含有抗生素培养基中长出来，但是最后的验证PCR验证在培养基上生长的是假阳性大肠杆菌。
说明了实验中目的基因没有成功转入大肠杆菌。
关键词：重组；酶切；连接；转化；片段回收基因文库的建立为重组DNA研究工作提供了方便的、有意义的基因。
构建基因文库的意义不只是使生物的遗传信息以稳定的重组体形式贮存起来，更重要的是它是分离克隆目的基因的主要途径。
对于复杂的染色体DNA分子来说，单个基因所占比例十分微小，要想从庞大的基因组中将其分离出来，一般需要先进行扩增，所以需要构建基因文库。
基因工程(gene engineering)是20世纪70年代以后兴起的一门新技术，即用人工的方法，把遗传物质DNA分离出来，在体外进行基因切割、连接、重组，然后再转移到生物体内并进行表达的技术。
基因工程中的关键一步是将目的基因与DNA载体连接成重组DNA，获得重组子，并把重组子筛选出来。
近年来，建立了许多方法来筛选重组子，其中较为常用的是利用a互补原理，根据菌落的蓝白颜色进行筛选1oL一互补是指E．coli B一半乳糖苷酶的两个无活性片段(N端片段和c端片段)组合而成为功能完整的酶的过程。
现在使用的许多质粒载体都带有一个E．coli DNA的短片段，其中含有B．半乳糖苷酶N端146个氨基酸的编码信息及调控序列。
在这个编码区中插入了一个多克隆位点，可在此处插入外源DNA 片段。
这种类型的载体适用于可编码B．半乳糖苷酶c端部分的宿主细胞。
尽管宿主和载体编码的两个片段都没有活性，但他们能够融合为具有酶活性的蛋白质，在含有底物X-gal的培养基中形成蓝色菌落。
生化实验二预习报告范文
生化实验二预习报告范文生物112周泓兆1102040226一、研究背景：酶作为生物体中最为重要的催化剂，其活性尤其受到关注，因为酶活性决定了酶的催化效率，也就是决定了酶的效果，这对于生化研究是非常有意义的。
二、研究目标：在这次实验中，我们将对一些经典经典酶活力测定实验进行分析，对比其思路与设计差异，了解测定酶活力的基本方向和实验技巧。
完成小麦萌发过程中淀粉酶活力的测定并分析测定结果是否合理。
三、研究策略：小麦种子内，60%—70%的成分为淀粉。
因此可以想到，在小麦萌发的过程中，需要有淀粉酶分解胚乳中的淀粉产生小分子糖类作为直接碳源和能源物质。
萌发过程中，如果有不同淀粉酶的作用，我们可以通过控制反应条件来抑制其它酶的活性，从而测定其中一种酶的活性。
我们测定酶活力的总体思路是：通过测定在一定时间（较短时间）后生成的产物量多少来量度这种酶的活性。
四、研究方案及可行性分析：本实验中，我们定义酶活力单位为1g鲜重麦种1分钟所催化生成的麦芽糖毫克数为酶活力单位。
而酶促反应是有很多抑制条件的，因此首先我们应当控制温度及pH，使得至少有一种酶处于最适温度及pH；其次我们需要控制反应时间，防止因产物浓度过高对淀粉酶产生抑制影响结果；第三我们底物浓度需要将酶过饱和，使得测定结果与底物浓度无关。
设置对照，用以排除麦种中本来含有的麦芽糖和其它吸光杂质对结果的影响、操作过程中试剂对结果的影响。
产物的测定方法使用可以测定微量物质的分光光度法，因此还需要麦芽糖溶液绘制标准曲线。
五、具体实验设计：（1）麦芽糖的测定1mg/ml麦芽糖标准液dH2O1020.130.340.550.760.971.01.00.90.70.50.30.103,5二硝摇匀后分别加入1ml3,5二硝基水杨酸，摇匀，在水浴中准确保温5min取出冷基水杨酸却。
dH2O用蒸馏水稀释至15ml，混匀，用分光光度计在520nm波度下比色，记录消光值，绘制标准曲线。