应用巢式PCR方法检测牛支原体肺炎_李大伟

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支原体pcr检测方法

支原体pcr检测方法支原体PCR检测方法。

支原体是一类细菌，可以引起多种感染性疾病，如支原体肺炎、支原体性关节炎、支原体性尿道炎等。

支原体感染对人体健康造成威胁，因此及时准确地检测支原体感染至关重要。

PCR（聚合酶链式反应）是一种高灵敏度的检测方法，已被广泛用于支原体的检测。

首先，准备样本。

支原体PCR检测的样本通常为患者的呼吸道分泌物、尿液、生殖道分泌物等。

收集样本时，需注意避免污染，保证样本的纯净度和完整性。

其次，提取DNA。

支原体是一种细菌，其遗传物质为DNA。

因此，在进行PCR检测前，需要从样本中提取支原体的DNA。

DNA提取的关键在于保证提取的DNA完整，避免污染和降解。

接下来，进行PCR反应。

PCR反应是在特定的温度条件下，通过DNA聚合酶将DNA扩增成百万甚至亿倍。

在PCR反应中，需设计特异性的引物，以确保扩增的是支原体的DNA而非其他微生物的DNA。

PCR反应的条件和参数需要严格控制，以确保扩增的准确性和稳定性。

最后，进行PCR产物的检测。

PCR反应后，得到的产物可以通过凝胶电泳、实时荧光定量PCR等方法进行检测。

凝胶电泳可以直观地观察PCR产物的大小和数量，而实时荧光定量PCR则可以定量地检测PCR产物的数量。

通过检测PCR产物，可以判断样本中是否存在支原体感染，以及感染的程度。

总的来说，支原体PCR检测方法具有高灵敏度、高特异性、操作简便等优点，已成为支原体感染检测的重要手段。

然而，在进行支原体PCR检测时，需严格控制实验条件，避免污染和假阳性结果的产生。

同时，对PCR产物的检测也需要选择合适的方法，以确保结果的准确性和可靠性。

希望本文介绍的支原体PCR检测方法能够为相关人员提供参考，帮助他们更好地开展支原体感染的检测工作。

牛支原体肺炎流行RT-PCR方法的初步诊断

显示，牛支原体阳性样品７份，牛生殖道支原体、牛眼支原体和牛丝状支原体全部为阴性；测序结果显示，所测样品核酸序列与牛
支原体和无乳支原体核酸序列都具有很高的同源性。对核酸序列进行遗传进化树分析表明，相对于无乳支原体而言，所测核酸序
２３序列比对结果．
天气、通风不良、度拥挤、输等将加剧病情［过运习。患有牛支原体的病牛可通过鼻腔分泌物排出牛
支原体，健康牛可通过近距离接触病牛而感染发病。
牛支原体在环境中存活力差，但在无阳光情况下可存活数天，如４℃下可在海绵中或牛奶中存活２个月，或水中存活２周以上；０℃存活ｌ２周，或３２￣７℃存
１３方法．
ｐ，Ｖ０５ｐ，ＬＭＬ．Ｌ上游引物（Ｍ）Ｌ下游引物２２ｐ１，０
（０ｐ２Ｍ）１ｐＲｎｓｒｅＨＥ１．５ｐＬ，ａｅｆｅＯ４１Ｌ。
反应程序：首先４２℃ ４ｉ；０ｍｎ接着９５℃变性３ｍｉ；然后９ｎ４℃ ３，５℃ ４，２℃ ４３个循０５ｓ０ｓ７０，５ｓ
１３２ＩＡ提取．．
主要特征的呼吸道传染病，病牛出现咳嗽，食欲不振，消瘦等症状，有的病牛出现继发性关节炎或腹泻［］１。－２
本实验室对山东某一牛交易市场部分牛群进行鼻腔棉拭子采样，采用ＰＲ方法对引起牛发生类似症状Ｃ的主要支原体进行了检测。

支原体PCR检测方法的建立和应用

ｉｆｎｉｓｈｅｄｐｒｏｄｕｃｔｓ）ｗｅｒｅ１００％．ＴｈｉｓｍｅｔｈｏｄｃａｎｇｒｅａｔｌｙｒｅｄｕｃｅｔｈｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｔｉｍｅｏｆＭｙｃｏｐｌａｓｍａｉｎｖａｃｃｉｎｅ
２０１３，４７（５）：１９— ２２／巢伟，等
中国兽药杂志
・１９・
支原体ＰＣＲ检测方法的建立和应用
巢伟，张桂红，徐雷
（湖南省中岸生物药业有限公司，长沙４１０１００）
［收稿日期］２０１２— ０９一ｌ３［文献标识码］Ａ［文章编号］１００２—１２８０（２０１３）０５— ００１９—０４［中图分类号］￥８５２．６２
视法对其进行检测，而且它对细胞的生长率影响较小，不易引起注意。目前已有多种方法可检测细胞
界分布十分广泛。细胞培养（特别是传代细胞）被支原体污染是世界性问题。国内外研究表明，目前
已知的２０多种细胞污染支原体中，９５％的的来源于口腔支原体、精氨酸支原体、猪鼻支原体、发酵支原体、莱氏无胆甾原体。支原体感染发生后能改变细胞的ＤＮＡ／ＲＮＡ及蛋白表达，但不能通过可
［摘

西昌某牛场疑似牛支原体肺炎RT-PCR方法的诊断

ｐＤ１ — ＶｅｔｒＭ８— ＴｃｏｌＬｕ
样品采自西吕市某牛场，共采集４，份全部为鼻腔棉拭子。其中，份肺炎病牛样品，份临床健康２２
牛样品。１２酶、剂和主要仪器．试
ＰＲ扩增产物Ｃ
ｄｄＨ２ＯＳｌｔｏｏｕｉｎＩ
西昌某牛场疑似牛支原体肺炎Ｒ — ＣＴＰＲ方法的诊断
尹灿友
（昌市西乡乡畜牧兽医站，西四川西昌６５１）１０３
【摘要】应用Ｒ－Ｃ方法对西昌市某牛场采集的２ＴＰＲ份疑似牛支原体肺炎鼻腔拭子进行检测，显示，样品均扩结果两份增出预期大小（０ｂ）Ｎ３０ｐ的ＤＡ片段。将其纯化回收、克隆、测序，结果表明，两份样品均与ＧｎａｋｅＢｎ中牛支原体（ｙｏｌｓａＭｃｐａｍ
２结果与分析
２１Ｒ — ＣＲ扩增结果．ＴＰ
两份病牛鼻腔拭子经Ｒ —ＣＴＰＲ扩增出预期约
物Ｐ：’ＣＴＡＧＴＧＡＣ ¨ＴＣ一 ’ ２５一ＧＣＡＧＡＣＴＡｒ３。提交上
３０ｐ０ｂ片段，临床健康牛及空白对照无条带出现，具体见图１。
ｂｖｓ１ＳＲＡｏｉ）６ｒＮ序列（ｅＢｎ登录号：Ｆ３７４同源性为９％牛支原体可能是导致牛发生肺炎的原因之一。ＧｎａｋＡ３２５）９；
【关键词】牛支原体； — Ｃ；ＲＰＲ诊断Ｔ【中图分类号Ｉ８８３．【ｓ５．６２３文献标识码】【Ａ文章编号】６３１９（０００—０２０１７—８１２１）１０２—２

应用巢式POR方法检测牛支原体肺炎

Ａｂｔ￣：ＢａｅｎｔｅｒｐｒｎｅｕｎｅｕｌｈｄｎｓｒａｓｄｏｈｅｏｔａｄｓｑｅｃｓｐｂｉｅｉＧｅｂｎ，ｔａｒｆｓｅｉｃｒｍｅｓｗｅｅｄｓｎｄａｃｒｉｇｓｓｎａｋｗｏｐｉｏｐｃｆｐｉｒｒｅｉｅｃｏｄｎｓｉｇ
ＸＩＯＮＧｏｇｌｎ３ＡＮｈ — ｕｎＺｈｎ — ａｇ，ＲｉＺｉａｇ，ＧＵＡＮｉｇｙａＡＮｅ— ｉｇｇＰｎ — ｕｎ，ＦＷｉｘｎ
（．ＩｎｒＭｏｇｌｒｕｔｒｌＵｉｅｓｙＨｈｏ１０８Ｃｉａ．ＣｉａＡｉｌＨａｔａｄＥｉｅｏｏｙＣｎｅｉｇａ１ｎｅｎｏｉＡｇｉｌａｎｖｒｔ，ｕｈｔ００１，ｈｎ；ｈｎｎｍａｅｌｎｐｄｍｉｌｇｅｔｒｎｄｏａｃｕｉ２ｈ，Ｑ
ｓｏｄｔａｏｆａｍｅｔｗｈｌｄｔｃｉｇＭｙｏｌｓｃｉｅｕｓ．ｃｉｅｍａｌＣｏｏｙＴｐｎｙｏｌｓｇｌｅｉｅｈｗｅｔｎｒｇｎｉｅｅｔｃｐａｍａｍｙｏｄｓｓｂｐｍｙｏｄｓｓｌｈｅｎｌｎｙｅａｄＭｃｐａｍａａａａｔ．ａＲｅｕｔｆｓｎｉｖｔｓｏｄｔｅｅｅｔｎｌｔｏｈｓｍｅｈｄｗａ１ ‘ ｇｍ１ｓｌｏｅｓｔｉｓｉｙｈｗｅｈｄｔｃｉｉｆｔｉｔｏｓ０７／．Ａｕｏｉｖａｌｓｏｍｉｕｐｓｔｅｓｍｐｅｗｅｅｍｐｉｅｔｈｓｉｒａｌｄｗｉｔｉｉｆｈ

牛支原体和牛病毒性腹泻病毒二重二温式PCR检测方法的建立

牛支原体和牛病毒性腹泻病毒二重二温式PCR检测方法的建立谢志勤，范　晴，谢芝勋，张民秀，谢丽基，黄娇玲，张艳芳，曾婷婷，王　盛，罗思思，邓显文，李　孟，李　丹，刘加波（广西壮族自治区兽医研究所，广西兽医生物技术重点实验室，广西南宁，　530001）摘　要：为建立一种牛支原体（Mycoplasma bovis，MB）和牛病毒性腹泻病毒（Bovine viral diarrhea virus，BVDV）的快速鉴别诊断方法，针对MB的uvr C基因和BVDV的5'端非编码区（5'-UTR）保守基因序列，分别设计两对特异引物，并将三温式PCR扩增程序简化为二个温度梯度，建立了鉴别MB和BVDV的二重二温式PCR方法。

该方法能同时扩增MB和BVDV，扩增产物大小分别为412和170 bp。

特异性试验结果显示，该方法对参试的所有毒株只扩增MB和BVDV基因组，对其它牛病原体无扩增；敏感性试验结果显示，该方法最低能同时检测到104拷贝的两种目的核酸；干扰性试验结果显示，该方法能同时检测两个模板不同浓度的组合，试验结果不受模板影响。

综上，本研究所建立的二重二温式PCR方法特异、敏感、快速、简便，可应用于MB 和BVDV临床鉴别诊断和流行病学调查。

关键词：二重二温式PCR；牛支原体；牛病毒性腹泻病毒；检测中图分类号：S854.43 文献标识码：A 文章编号：1005-944X（2019）01-0070-06DOI：10.3969/j.issn.1005-944X.2019.01.018Development of Two-temperature Duplex PCRfor Detection of Mycoplasma bovis and Bovine Viral Diarrhea VirusXie Zhiqin，Fan Qing，Xie Zhixun，Zhang Minxiu，Xie Liji，Huang Jiaoling，Zhang Yanfang， Zeng Tingting，Wang Sheng，Luo Sisi，Deng Xianwen，Li Meng，Li Dan，Liu Jiabo（Guangxi Veterinary Research Institute，Guangxi Key Laboratory of Veterinary Biotechnology，Nanning，Guangxi　530001，China）Abstract：In order to establish a rapid identiﬁcation and detection method for Mycoplasma bovis（MB）and bovine viral diarrhea virus（BVDV），two pairs of specific primers were designed based on the conserved sequences of MB uvrC gene and BVDV 5'-UTR，and a new modified two-temperature duplex PCR was developed from three-temperature conventional PCR. According to the results，the developed assay could amplify the genes of both MB and BVDV simultaneously，and the PCR products were 412 bp for MB and 170 bp for BVDV，respectively. The speciﬁcity test results showed no cross-reaction with other bovine pathogens was observed. The sensitivity test results showed that the detection limit was 104 copies of nucleic acids of two target genes. The interference test results showed the combination of different concentrations of the two templates could be detected by the method，and the experimental results were not affected by the template concentrations. In conclusion，the developed two-temperature duplex PCR assay was speciﬁc，sensitive，rapid and simple，and it could be applied in differential diagnosis for clinical samples and epidemiological investigation.Key words：two-temperature duplex PCR；Mycoplasma bovis；bovine viral diarrhea virus； detection收稿日期：2018-10-30修回日期：2018-11-23基金项目：广西科技重大专项（桂科AA17204057）；广西科技重点研发计划（桂科AB16380003）通信作者：谢芝勋2019年第36卷第1期牛支原体（Mycoplasma bovis，MB）和牛病毒性腹泻病毒（Bovine viral diarrhea virus，BVDV）都能引起牛呼吸系统疾病。

牛支原体双重PCR检测方法的建立

牛支原体双重PCR检测方法的建立牛支原体（Mycoplasma bovis）是一种常见的病原微生物，它引起的牛支原体感染常导致牛的呼吸道疾病、乳腺炎、关节炎等严重疾病。

牛支原体感染对养殖业造成的经济损失巨大，因此快速和准确地检测牛支原体感染对于疾病的防控和治疗至关重要。

目前常用的检测方法包括传统培养法、血清学检测、PCR等。

然而，传统培养法需要耗费大量时间，并且易受外界因素的影响，血清学检测虽然能够快速检测，但存在较高的假阳性和假阴性率。

相比之下，PCR技术具有快速、敏感、特异性高等优点，成为目前牛支原体检测的主要方法。

为了建立牛支原体双重PCR检测方法，首先需要设计引物。

引物的设计是检测方法成功与否的关键因素。

牛支原体是一种细菌，其基因组中有多个可作为靶标的基因。

在选择引物时，需要选择高保守性的基因片段，以确保检测方法的特异性。

常用的靶基因包括16S rRNA基因、Hsp70基因等。

通过比对和分析多个牛支原体菌株的基因序列，可以筛选出适合的引物对。

根据选定的引物对，可以进行PCR反应。

首先，需要提取牛支原体的DNA。

这可以通过采用商业DNA提取试剂盒或传统方法来实现。

提取到的DNA需要进行定量和质量检测，确保反应中的DNA含量和质量的稳定性。

在进行PCR反应之前，需要确定PCR反应体系的组成和优化。

反应体系包括引物、DNA模板、dNTPs、酶、缓冲液等。

反应温度和时间的选择对于PCR反应的成功与否至关重要。

根据引物的碱基组成和长度，可以选择合适的退火温度和延伸时间。

为了最大限度地提高PCR反应的特异性和敏感性，可以尝试不同的反应条件，包括酶浓度、Mg2+浓度、嵌套PCR等。

PCR反应结束后，可以利用琼脂糖凝胶电泳等方法进行PCR产物的分析。

通过与已知大小的DNA标准物进行比较，可以确定PCR产物的大小。

可视化的PCR产物可以通过染色剂（如EtBr）染色，然后在紫外光下观察。

此外，也可以使用进一步的分子生物学技术，如测序或限制性酶切等方法来确认PCR产物的准确性。

巢式PCR在动物疫苗支原体污染检测中的应用

ｓａｍｐｌｅ．Ｔｈｅｍｅｔｈｏｄｗｅｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄｈａｓｆａｓｔ，ｈｉｇｈｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ，ｇｏｏｄｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ，ｗｈｉｃｈｃａｎｏｆｆｅｒａｔｅｃｈｎｉｃａｌｒｅｆｅｒｅｎｃｅ
学术研究
ｄｏｉ：ｌＯ．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１９
巢式ＰＣＲ在动物痘苗支原体污染检测中的应用
蒙业军
（广西正康种猪有限公司广西柳州５４５００２）
ｏｒｆｄｅｃｔｉｏｎｏｆＭｙｃｏｐｌａｓｍａｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｏｎｉｎｔｈｅｖａｃｃｉｎｅｃｕｌｔｕｒｅ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｎｅｓｔｅｄＰＣＲ；ｉｎｔｅｒｇｅｎｉｃｓｅｑｕｅｎｃｅ；ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｄｅｔｅｃｔｉｏｎ
ｐｌｉｆｉｅｄｓｐａｃｅｒｒｅｇｉｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅｓｂｅｔｗｅｅｎ１６Ｓａｎｄ２３ＳｒＲＮＡｇｅｎｅｏｆＭｙｃｏｐｌａｓｍａ．Ａｃｃｏｒｄｉｎｇｔｏｔｈｅｒｅｓｕｌｔ，ｗｅｃａｎｄｅｔｅｃｔｃｏｍｍｏｎＭｙｃｏｐｌａｓｍａｓｐｅｃｉｅｓｗｈｉｃｈｃａｕｓｅｃｅｌｌｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｏｎ．Ｂｙｔｈｅａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｍｅｔｈｏｄ，ｗｅｄｅｔｅｃｔｅｄｏｆｔｈｒｅｅｂａｔｃｈｅｓｏｆｓａｍｐｌｅｓａｎｄｎｅｇａｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌｓ，ｔｈｅｒｅｗａｓｎｏｓｐｅｃｉｉｆｃｔａｒｇｅｔｂａｎｄｓ，ｓｈｏｗｅｄｔｈｅｔｈｒｅｅｂａｔｃｈｅｓｏｆｖａｃｃｉｎｅｓａｍｐｌｅｓｗｅｒｅｎｅｇａｔｉｖｅｆｏｒｍｙｃｏｐｌａｓｍａ．Ｔｈｅｒｅｗａｓａ２００－４００ｂｐｓｐｅｃｉｉｆｃｔｒｇａｅｔｂａｎｄｉｎｔｈｅｐｏｓｉｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌ

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中国动物检疫2010年第27卷第4期近年来，山东、湖北、湖南、重庆、贵州等１６个省发现了牛支原体肺炎疫情。

经验证是由牛支原体引起的牛支原体肺炎，临床以呼吸系统症状为主，主要表现为发热、咳嗽、流鼻涕。

犊牛和体质弱的牛发病严重，在不治疗的情况下死亡率可达４０％－８０％，部分病例出现关节炎，少数病例出现结膜炎；剖检病变主要集中在胸腔与肺部，肺和胸膜轻度粘连，有少量积液；心包积水，液体黄色澄清；肺部病变的严重程度在不同病牛表现出差异，与病程有关。

严重者可见肺部广泛分布有干酪样或化脓性坏死灶，俗称“烂肺病”。

我们已从发病牛场病牛肺组织中检测到了牛支原体特异性核酸片段，并分离到了牛支原体。

排除了牛传染性胸膜肺炎（牛肺疫）感染的可能性。

在我国，牛支原体肺炎是一种新发传染病，近几年才有相关报道，具体的流行情况和流行趋势还有待调查。

而且牛支原体存在牛体的下呼吸道，所以鼻腔粘膜和口腔内的病原含量很低，常规的检测方法很难做出检测。

而我们建立的巢式ＰＣＲ检测方法，其敏感性是单一ＰＣＲ方法的１０３倍，并且具有鉴别牛肺疫和无乳支原体的特异性。

可以用于活体检测和流行病学调查。

1材料与方法1.1对照菌株与病料丝状支原体丝状亚种小克隆和无乳支原体基因组由哈尔滨兽医研究所提供，阳性病料采自５省市５个典型的发病牛场。

1.2主要试剂Ｔａｑ酶为宝生物工程（大连）有限公司产品，ＤＮＡＭａｒｋ－ｅｒ为天根生化公司产品，ｄＮＴＰｓ为ＭＢＩ公司产品，引物由上海生工合成。

1.3主要仪器设备低温台式高速离心机为ＳＩＧＭＡ公司产品；ＹＹ２Ⅲ－８Ｂ稳压稳流型电泳仪为北京六一仪器厂产品，ＰＴＣ２００ＰＣＲ仪为ＢＩＯ－ＲＡＤ公司产品；凝胶成像系统为美国通用电器公司产品。

1.4基因组提取病料经常规处理，采用ＤＮＡ提取试剂盒提取模板，购自上海华舜生物技术有限公司。

1.5引物设计根据ＧｅｎＢａｎｋ发表牛支原体基因序列设计２对引物，扩增片段长度分别为１９１２ｂｐ、４２２ｂｐ。

引物由上海生工合成。

经高压灭菌超蒸水配制成５０ｐｍｏｌ／Ｌ，－２０℃保存。

用时稀释成１００ｐｍｏｌ／Ｌ。

第一轮引物：Ｐ１：５'－ＴＴＴＴＡＧＴＣＴＴＴＴＴＧＡＡＣＡＡＡＴ－３'；Ｐ２：５'－ＧＧＣＴＣＴＣＡＴＴＡＡＧＡＡＴＧＴ－３'第二轮引物：Ｐ３：５'－ＣＣＡＧＣＴＣＡＣＣＣＴＴＡＴＡＣＡＴＧＡＧＣＧＣ－３'；Ｐ４：５'－ＴＧＡＣＴＣＡＣＣＡＡＴＴＡＧＡＣＣＧＡＣＴＡＴＴＴＣＡＣＣ－３'1.6巢式ＰＣＲ第一轮ＰＣＲ扩增２５ｕμＬ反应体系（模板２．５μＬ，引物各１μＬ，ｄＮＴＰｓ（２．５ｍｍｏｌ／Ｌ）２．０μＬ，ＰＣＲｂｕｆｆｅｒ２．５μＬ，Ｔａｑ酶０．５μＬ，ｄｄＨ２Ｏ１５．５μＬ）经过优化试验得到应用巢式PCR 方法检测牛支原体肺炎李大伟1,2，张彦明2，黄灿平2，谢建华3，熊仲良3，冉智光3，关平原1，范伟兴2（1．内蒙古农业大学，内蒙古呼和浩特011118；2．中国动物卫生与流行病学中心，山东青岛266032；3．重庆市疫病预防控制中心，重庆渝北401100）摘要：根据G enbank 发表的牛支原体全基因序列，设计2对特异性引物，建立了诊断牛支原体肺炎的巢式PC R 方法，第一轮引物P1、P2扩增片段长度为1912bp,第二轮引物P3、P4扩增片段长度为422bp ：该方法特异性试验未扩增出丝状支原体丝状亚种小克隆和无乳支原体特异性条带；敏感性试验证明扩增DN A 最低含量达到10-7μg/m L ，是单一PC R 的103倍；用该方法对阳性病料进行检测，均扩增出特异性片段。

该体系的成功构建，可以为牛支原体肺炎的活体检测，和流行病学调查提供技术支持。

关键词：牛支原体；巢式PC R ；活体检测中图分类号：S852.62文献标识码：A 文章编号：1005－944X （2010）04－0028－02A nested PCR method for detecting mycoplasma bovis pneumoniaLI Da-wei 1,2,ZHANG Yan-ming 2,HUANG Can-ping 2,XIE Jian-hua 3,XIONG Zhong-liang 3,RAN Zhi-guang 3,GUAN Ping-yuan 1,FAN Wei-xing 1(1.Inner Mongolia Agricultural University,Huhhot 010018,China;2.China Animal Health and Epidemiology Center,Qingdao 266032China;3.Chongqing Center for Animal Disease Control and Prevention,Chongqing 401120,China)Abstract :Based on the reports and sequences published in Genbank,two pairs of specific primers were designed according to the conservative compass.The primers were designed for the establishment of the nested PCR.The amplificated product of primer P1and P2was about 1912bp,and the amplificated product of primer P3and P4was about 422bp.The specific tests showed that no fragment while detecting Mycoplasma mycoides subsp.mycoides small Colony Type and Mycoplasma agalactiae.Results of sensitivity showed the detection limit of this method was 10-7ug/ml.Au positive samples were amplified with this method.This specific and sensitive method is suitable for the detection of living body Mycoplsma bovis pneumonia and gived proofs for the research of epidemiological analysis.Key words :Mycoplsma bovis;nested-PCR ；detection of living body本栏目主持人：胡藕祥zgdwjy@通讯作者：关平原试验研究－28－中国动物检疫2010年第27卷第4期ＰＣＲ条件为：９４℃１１．５ｍｉｎ；９４℃３０ｓ，４８℃６０ｓ，７２℃１５０ｓ，共进行３５个循环；７２℃延伸５ｍｉｎ，最后置４℃保存。

第二轮ＰＣＲ以第一轮扩增产物为模板，反应体系相同；扩增条件为：９４℃１１．５ｍｉｎ；９４℃４５ｓ，５４℃６０ｓ，７２℃１２０ｓ，共进行３０个循环；７２℃延伸５ｍｉｎ。

最后置４℃保存。

1.7特异性试验分别以牛支原体、无乳支原体、丝状支原体丝状亚种小克隆基因组为模板，进行巢式ＰＣＲ扩增。

同时设阴性对照。

1.8敏感性试验提取阳性病料总基因组，经紫外分光光度计测得ＤＮＡ含量为１００μｇ／ｍＬ，然后按１０倍梯度倍比稀释到１０－７μｇ／ｍＬ。

以此为模板进行ＰＣＲ扩增。

1.9样品检测对部分病料提取ＤＮＡ，用巢式ＰＣＲ方法进行检测。

2结果2.1特异性试验结果两轮巢式ＰＣＲ扩增的产物经１％琼脂糖凝胶电泳观察，发现只有牛支原体扩增出４２２ｂｐ条带（见图１）。

2.2敏感性试验结果第１轮ＰＣＲ产物经１％琼脂糖凝胶电泳观察，发现ＤＮＡ稀释度从１０－１～１０－４扩增产物在１９１２ｂｐ附近有一条与预计大小相符的条带；第２轮ＰＣＲ产物经１％琼脂糖凝胶电泳观察，发现ＤＮＡ从１０－３～１０－９ｍｇ／ｍＬ时扩增产物在４２２ｂｐ附近有一条与预计大小相符的条带（见图２、图３）。

2.3临床样品检测结果经实验室检测确定部分牛支原体阳性病料，用确定的巢式ＰＣＲ方法进行扩增，以下是经过２轮ＰＣＲ扩增后的结果（见图４、图５）。

3讨论牛支原体于１９６１从患乳房炎病牛中首次分离到［３］，随着牛群的调运扩散到大部分国家和地区：西班牙（１９６７年）、澳大利亚（１９７０年）、韩国（１９８９年）、北爱尔兰（１９９３年）、智利（２０００年）等。

目前已遍及到包括欧洲在内的世界大部分地区［５］。

本病已在欧洲和北美和欧洲造成了严重的经济损失［７］。

我国自２００２年以来部分省市每年都有新引入牛只“疑似牛肺疫”的零星报道。

经我中心人畜共患病监测室与重庆动物疫控中心的监测和调查，山东、湖北、重庆等１６个省发现“疑似牛肺疫”疫情为牛支原体肺炎。

本试验建立的巢式ＰＣＲ检测方法通过使样品核酸累加，提高了检测的敏感性。

在活体检测中可以通过采取鼻拭子的方法鉴定是否存在牛支原体感染。

试验也证明，该方法具有较高的特异性，能够区别丝状支原体丝状亚种小克隆和无乳支原体。

因此巢式ＰＣＲ方法可以用于活体检测和流行病学调查。

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