微机模拟蛋白质纯化实验
蛋白质分离纯化及鉴定综合实验
百泰派克生物科技
蛋白质分离纯化及鉴定综合实验
在蛋白组学研究中，如果要对某一混合体系中的蛋白质进行定性或定量分析，就需要先对蛋白组分进行分离、纯化，然后再进行后续的鉴定分析。
这一系列实验环环相扣，每一步都至关重要，直接影响实验结果的准确性。
理想的蛋白质分离技术首先要有超高的分辨率，能够将成千上万不同类型的蛋白质包括它们修饰物进行有效的分离。
目前常用的蛋白质分离技术包括一维/二维凝胶
电泳技术、双向电泳技术以及凝胶色谱技术等。
经分离的蛋白质需要进行纯度检测来评价是否含有其他杂蛋白或者杂质，通常利用聚丙烯电泳法、免疫化学法、沉降速率测定法、色谱法、质谱法等进行纯度检测。
对于含有杂质的蛋白需进行纯化，如含有核酸、糖类或脂类杂质，可以利用核酸沉淀法或有机溶剂沉淀法对杂质进行去除。
对蛋白质进行鉴定主要是基于其基本的理化参数对其进行鉴定，包括相对分子量、等电点、翻译后修饰、氨基酸序列以及高级结构等，可以选择单一的性质进行鉴定，也可以进行全面分析，根据实验需求进行选择。
百泰派克生物科技基于先进的质谱仪以及专业的技术团队提供蛋白质分离纯化及鉴定一站式技术服务，包括蛋白样品分离、纯化、纯度鉴定以及定性和定量鉴定，还可提供定制化分析服务，满足不同的实验需求，欢迎免费咨询。
计算机模拟“蛋白质纯化”短学期实践报告(10号蛋白)
计算机模拟“蛋白质纯化”短学期实践报告姓名：学号：班级：成绩：一、计算机模拟实验初始条件：样品号：10样品稳定的条件：10号样品在pH3.5～11.5稳定；温度< 69°C稳定。
二、计算机模拟“蛋白质纯化”实验内容：（1）粗分离（盐析）硫酸铵饱和度沉淀蛋白(mg)沉淀酶活力(U)上清蛋白(mg)上清酶活力(U)沉淀比活力(U/mg)上清比活力(U/mg)酶回收率纯化倍数8%498 9800100% 1.0 9% 497.9 975799.8% 1.0 10% 497.5 958698.9% 1.0 18% 89.9 9029 100.4396.2% 5.1 19% 105.6 9543 90.3798.9% 4.6 20% 117.3 9713 82.8099.8% 4.221%126.1 9757 77.38100% 3.9计算机模拟“蛋白质纯化”短学期实践时间：20 年月日如表格中所示，根据相关理论及实验经验，选择了从8％硫酸铵饱和浓度起进行梯度盐析测定，经过数据对比，最终选择9％作为除杂（取上清液）的“低浓度”，因为该浓度下上清中酶的比活力和纯化倍数较相近浓度而言具有优势。
在选定低浓度并进行取上清液步骤后，我们就开始对选择高浓度。
同样地经过数据对比，最终选择了20％作为把绝大部分目标蛋白沉降的“高浓度”，其原则也是要保证在比活力和纯化倍数大的情况下，选择比活力最大的硫酸铵浓度。
注：比活力(U/mg)＝酶活力(U)：蛋白质量(mg)。
选择了9％和20％这两个浓度后，我们开始正式的盐析过程，即先在9％浓度下取上清液，然后20％浓度下取沉淀。
具体操作及所取上清/沉淀数据（如图1）。
图1 盐析结果计算机模拟“蛋白质纯化”短学期实践时间：20 年月日（2）细分离（各种纯化技术条件及结果）阴离子交换层析：Start conc设为0 M，End conc设为0.6M，Equilibration ph（平均PH）设为6，用100％的样品去进行跑样层析（如图2）。
微机模拟蛋白质纯化实验报告
微机模拟蛋⽩质纯化实验报告微机模拟蛋⽩质纯化实验⼀、实验⽬的：1. 了解模拟⽣化⼲实验的⽅法和意义，掌握⽤protein软件提纯蛋⽩质的⽅法。
2. 进⼀步熟悉层析、热变性、盐析等常⽤⽣化分离⽅法的原理和应⽤。
⼆、实验原理：“Protein”软件有36个任务，即36组待分离纯化的蛋⽩。
任务要求利⽤软件提供的⼏种实验技术，提纯每⼀个⽬的蛋⽩，最终达到单向电泳⼀条带，双向电泳⼀个点，⽽且使⽤的⼈时和经费(根据提取步骤计算得到)不得超过⼀个特定值。
在每个任务开始时，软件给出⽬的蛋⽩的⼀些性质，如热稳定的温度范围和pH稳定范围等，利⽤这些信息，可以使实验少⾛弯路。
“Protein”提供的分离纯化⽅法有七种：①热变性；②硫铵沉淀；③排阻层析(凝胶⾊谱)；④离⼦交换层析；⑤吸附层析；⑥聚焦层析；⑦制备电泳。
在“Protein”所提供的各种分离纯化⽅法中，热变性法和盐析法是⽐较好的粗提⽅法，在提纯的早期使⽤效果较好。
层析是各种⽅法中最强有⼒的⽅法，制备电泳虽然纯化倍数⾼，但是回收率低。
在各种层析⽅法中，⼜以离⼦交换层析最为有效和易于使⽤，并且耗费的⼈时和经费也较少。
排层层析和聚焦层析耗费较⼤，但在某些特定情况下，这两种⽅法是不可替代的。
“Protein”提供了四种电泳⽅法：即，SDS-PAGE、PAGE、等电聚焦电泳和双向电泳。
这些电泳⽅法不但可以⽤以检测样品的纯度，⽽且也给出了样品的⼀些信息，如分⼦量、等电点等，这些信息对于后续提纯有重要的参考价值，等电聚焦电泳和PAGE还可以⽤于制备。
本实验要求完成实验软件中三种酶的分离纯化。
1 酸性条件下稳定的蛋⽩（Windows 3号酶）3号酶在62℃以下稳定，稳定pH范围3.8～5.8（酸性条件）。
分离纯化步骤:1 热变性：⽔浴温度61℃，⽔浴时间60min2 离⼦交换：然后进⾏PAGE和SDS-PAGE检测结果分析：在检测时出现两条带的时候可能是由于蛋⽩质的含有两个亚基。
蛋白质纯化实验方案与应用
蛋白质纯化实验方案与应用1. 引言蛋白质是生物体内最重要的分子之一，它们参与调节细胞功能、传递信号、催化反应等生命活动。
为了全面了解蛋白质的功能和结构，需要进行蛋白质的纯化实验。
蛋白质纯化是从细胞提取蛋白质并去除其他成分的过程，通过纯化蛋白质可以获得高纯度的样品，便于后续的结构和功能研究。
本文将介绍常用的蛋白质纯化实验方案及其应用。
2. 蛋白质纯化的步骤蛋白质纯化可以分为几个关键步骤，包括细胞破碎、溶液处理、分离纯化和纯化蛋白质的检验。
2.1 细胞破碎细胞破碎是蛋白质纯化的第一步，目的是破坏细胞膜并释放蛋白质。
常用的方法有机械破碎、超声波破碎、冻融法等。
机械破碎是将细胞悬浮液通过高速离心等手段分离得到上清液，其中含有蛋白质。
超声波破碎则是利用超声波的机械作用产生震荡，破坏细胞膜。
冻融法则是通过多次冻结和融解来破坏细胞膜。
2.2 溶液处理在细胞破碎之后，需要对样品进行溶液处理，包括调节pH值、添加蛋白质稳定剂和抗菌剂等。
调节pH值可以提高纯化效果，一般在6-8之间为宜。
蛋白质稳定剂可以保护蛋白质避免其降解和失活，常用的有甘油、甜菜碱、牛血清白蛋白等。
抗菌剂可以防止细菌污染，常用的有氨基苄青霉素、氯霉素等。
2.3 分离纯化分离纯化是蛋白质纯化的核心步骤，其目的是将目标蛋白质与其他杂质进行有效的分离。
常见的分离纯化方法包括离子交换层析、凝胶过滤层析、亲和层析、凝胶电泳等。
离子交换层析是通过蛋白质与离子交换树脂之间的相互作用来分离目标蛋白质。
树脂上的固定的功能基团可以选择性地结合目标蛋白质，而其他杂质则被排除。
凝胶过滤层析是利用凝胶孔径的不同分离蛋白质，大分子量的蛋白质会被滞留在凝胶中，而小分子量的蛋白质则通过。
亲和层析是利用蛋白质与某些特定配体之间的特异性结合来分离目标蛋白质。
配体可以是金属离子、抗体、某些亲和剂等。
凝胶电泳是根据蛋白质在电场中的迁移速度不同来分离目标蛋白质。
凝胶电泳可通过聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）、等电聚焦电泳（IEF）等方法进行。
蛋白共纯化实验报告
1. 学习蛋白质纯化的基本原理和方法。
2. 掌握利用亲和层析法进行蛋白质共纯化的技术。
3. 通过实验验证蛋白质共纯化的效果。
二、实验原理蛋白质共纯化是指从混合蛋白质样品中同时分离和纯化两种或两种以上的目的蛋白。
亲和层析法是蛋白质共纯化常用的技术之一，其原理是利用蛋白质与特定配体的亲和力，通过柱层析将目的蛋白从混合样品中分离出来。
三、实验材料1. 试剂：亲和层析柱、亲和配体、洗脱液、样品缓冲液、SDS-PAGE凝胶、考马斯亮蓝染色液等。
2. 仪器：离心机、层析柱、凝胶成像仪等。
四、实验方法1. 准备亲和层析柱：将亲和配体固定在层析柱上，制成亲和层析柱。
2. 样品处理：将混合蛋白质样品加入亲和层析柱，进行预平衡。
3. 亲和层析：将样品溶液通过亲和层析柱，目的蛋白与亲和配体结合，其他蛋白质通过柱。
4. 洗脱：用洗脱液洗脱亲和配体上的目的蛋白，收集洗脱液。
5. 检测：将洗脱液进行SDS-PAGE分析，观察目的蛋白的纯度。
6. 收集目的蛋白：将SDS-PAGE凝胶上的目的蛋白条带切割下来，进行后续处理。
五、实验结果与分析1. 亲和层析柱制备成功，亲和配体固定在层析柱上。
2. 样品溶液通过亲和层析柱，目的蛋白与亲和配体结合，其他蛋白质通过柱。
3. 用洗脱液洗脱亲和配体上的目的蛋白，收集洗脱液。
4. SDS-PAGE分析结果显示，洗脱液中含有目的蛋白，且纯度较高。
通过亲和层析法进行蛋白质共纯化实验，成功分离和纯化了两种目的蛋白，验证了实验方法的有效性。
七、实验注意事项1. 亲和层析柱制备过程中，要注意配体的固定量和固定效果。
2. 样品处理过程中，要确保样品溶液的浓度适宜，避免样品过浓或过稀。
3. 亲和层析过程中，要注意控制洗脱液的pH值和离子强度，以保证目的蛋白的稳定性。
4. 实验过程中，要注意层析柱的清洗和保存，避免污染。
5. 实验结束后，要对实验数据进行整理和分析，总结实验结果。
蛋白质分离纯化及实验技术
第一节 能用作纯化依据的蛋白质性质
1 大小 2 形状
8 密度 9 配体结合能力
3 电荷
10 金属结合能力
4 等电点
11 可逆性缔合
5 电荷分布 12 特异性序列或结构
6 疏水性 7 溶解度
13 非寻常性质 14 基因工程构建的纯化标记
蛋白质分离纯化及实验技术
1. 大小 蛋白质的大小各不相同，可从含几个氨基酸 的小肽（几百个Da）至含10 000多个氨基酸 （上百万个Da）的巨大蛋白质不等。多数蛋 白质的分子量在10 000—150 000Da之间。
蛋白质分离纯化及实验技术
15. 基因工程构建的纯化标记 随着基因工程技术的进步，克隆编码某一蛋 白质的cDNA已变得比较容易。通过改变cDNA 而在被表达蛋白质的氨基端或羧基端加入少 许几个额外氨基酸，这个加入的“标记”可 用来作为一种有些的纯化依据。 最通行的标记之一是在蛋白质的氨基端加上 6—10个组氨酸，这样可以使肽链能与Ni2+螯 合柱紧密结合，经洗脱，再用游离咪唑洗脱 或通过将pH降至5.9，使组氨酸充分质子化， 与Ni2+分离而使蛋白质得以纯化。
8. 密度 多数蛋白质的密度在1.3—1.4g/cm3之间。分级 分离蛋白质时一般不用这个性质。但是，在含 有大量磷酸盐（如卵黄高磷蛋白，密度为1.8） 或脂质部分（如脂蛋白，密度为1.03）的蛋白 质，与一般蛋白质在密度上确有不同，可用密 度梯度法将它们从大部分蛋白质中分离出来。
蛋白质分离纯化及实验技术
蛋白质分离纯化及实验技术
（一）前处理
1、选材 2、破碎 3、混合物的分离
蛋白质分离纯化及实验技术
（二）粗分级分离
（1）盐析 （2）等电点沉淀 （3）有机溶剂分级分离 （4）超滤 （5）凝胶过滤 （6)冷冻干燥
纯化蛋白,实验总结
实验汇总实验内容1近两周主要做了肿瘤多肽疫苗Vbp3的诱导表达和纯化以及鉴定实验。
2学习培养细胞一些技能，给细胞换液并传代，自己培养了一瓶E3细胞，并学习处理细胞，传代，计数。
学习使用倒置显微镜观察细胞，以及细胞实验室的一些注意事项。
3 取得杂交瘤细胞，然后我给小鼠注射，每只0.5ml制备抗体用。
实验结果1先培养了菌株进行原核表达多肽，经过表达后SDS-PAGE电泳鉴定可以得出目的蛋白得到了表达。
通过与Maker对比可以看出有目的蛋白表达。
2然后进行超声破碎菌体，使表达的蛋白裂解，然后进行洗脱纯化。
洗脱液的浓度梯度分别为5mM 咪唑，20 mM 咪唑，80mM 咪唑，250 mM 咪唑，500mM 咪唑。
通过SDS-PAGE电泳鉴定出，在250 mM 咪唑处有目的蛋白被洗脱出。
如下图所示：Maker 样品PBS洗脱5Mm 20 mM 80 mM 250 mM 500mM 250Mm图中开始加的为maker，然后为裂解后未洗脱的样品，然后pbs,接着是不同浓度的咪唑洗脱下来的蛋白。
在不同浓度洗脱液的紫外峰值分别为：3以bFGF 为抗原包板做ELISA实验，以鼠单抗和人源化抗体为一抗，以羊抗鼠酶标抗体为二抗，进行检测鼠单抗的效价。
结果如下表所示：Measurement count: 1 Filter:4501 2 3 420000 0.121 0.121 2.563 2.733 0.121 2.648 0 0.120208 40000 0.105 0.116 2.52 2.533 0.1105 2.5265 0.007778 0.009192 80000 0.11 0.131 2.15 1.93 0.1205 2.04 0.014849 0.155563 160000 0.084 0.084 1.361 1.654 0.084 1.5075 0 0.207182 320000 0.109 0.131 0.824 1.082 0.12 0.953 0.015556 0.182434 640000 0.112 0.113 0.578 0.632 0.1125 0.605 0.000707 0.038184 1280000 0.115 0.126 0.429 0.423 0.1205 0.426 0.007778 0.004243 2560000 0.111 0.12 0.112 0.082 0.1155 0.097 0.006364 0.021213ELISA 结果结果分析图标准误差图图中1，2中一抗为人源化抗体，3，4中一抗为鼠单抗。
关于纯化的实验报告
一、实验目的1. 学习蛋白质纯化的基本原理和方法。
2. 掌握蛋白质纯化的操作技术。
3. 了解蛋白质纯度的鉴定方法。
二、实验原理蛋白质纯化是指从复杂的蛋白质混合物中分离出目标蛋白质的过程。
常用的蛋白质纯化方法有盐析、离子交换层析、凝胶过滤层析、亲和层析等。
本实验采用盐析法对蛋白质进行初步纯化，并通过SDS-PAGE电泳和考马斯亮蓝染色对纯化效果进行鉴定。
三、实验材料1. 蛋白质样品：酶溶液、标准蛋白质样品2. 试剂：硫酸铵、SDS-PAGE电泳缓冲液、考马斯亮蓝G250、Tris-HCl、甘氨酸、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、TEMED、尿素、十二烷基硫酸钠（SDS）、琼脂糖、双蒸水等3. 仪器：电泳仪、紫外观察分析仪、离心机、移液器、烧杯、玻璃棒、滴管、剪刀等四、实验步骤1. 盐析法纯化蛋白质（1）将酶溶液与硫酸铵溶液按照一定比例混合，室温静置一段时间。
（2）离心分离，收集沉淀。
（3）将沉淀用双蒸水洗涤，去除杂质。
（4）将洗涤后的蛋白质沉淀溶解于适量的双蒸水中，得到初步纯化的蛋白质溶液。
2. SDS-PAGE电泳鉴定纯化效果（1）配制10%的琼脂糖凝胶，加入适量的SDS-PAGE电泳缓冲液。
（2）将标准蛋白质样品和纯化后的蛋白质样品进行电泳分离。
（3）关闭电源，取出琼脂糖凝胶，用考马斯亮蓝G250染色。
（4）观察电泳图谱，比较纯化前后蛋白质的条带变化，判断纯化效果。
五、实验结果与分析1. 通过盐析法纯化蛋白质后，SDS-PAGE电泳图谱显示，蛋白质条带较纯化前明显减少，表明蛋白质纯化效果较好。
2. 纯化后的蛋白质条带与标准蛋白质样品的条带基本一致，进一步说明纯化效果良好。
六、实验结论本实验通过盐析法对蛋白质进行初步纯化，并采用SDS-PAGE电泳对纯化效果进行鉴定。
结果表明，蛋白质纯化效果较好，达到了实验目的。
七、实验讨论1. 盐析法是一种简单、经济、有效的蛋白质纯化方法，适用于初步纯化。
2. 实验过程中，蛋白质沉淀的收集和洗涤是关键步骤，直接影响纯化效果。
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微机模拟蛋白质纯化实验
学号： 1035130150
：睿
班级：生命科学学院 10级生物工程
： 1059508633qq.
一、实验目的：
1. 了解模拟生化干实验的方法和意义，掌握用protein
软件提纯蛋白质的方法。
2. 进一步熟悉层析、热变性、盐析等常用生化分离方法
的原理和应用。
二、实验原理：
1：“Protein”软件有36个任务，即36组待分离纯化的蛋白。
任务要求利用软件提供的几种实验技术，提纯每一个目的蛋白，最终达到单向电泳一条带，双向电泳一个点，而且使用的人时和经费(根据提取步骤计算得到)不得超过一个特定值。
在每个任务开始时，软件给出目的蛋白的一些性质，如热稳定的温度围和pH稳定围等，利用这些信息，可以使实验少走弯路。
2：“Protein”提供的分离纯化方法有七种：①热变性；
②硫铵沉淀；③排阻层析(凝胶色谱)；④离子交换层析；
⑤吸附层析；⑥聚焦层析；⑦制备电泳。
3：在“Protein”所提供的各种分离纯化方法中，热变
性法和盐析法是比较好的粗提方法，在提纯的早期使用效果较好。
层析是各种方法中最强有力的方法，制备电泳虽然纯化倍数高，但是回收率低。
在各种层析方法中，又以离子交换层析最为有效和易于使用，并且耗费的人时和经费也较少。
排阻层析和聚焦层析耗费较大，但在某些特定情况下，这两种方法是不可替代的。
4：“Protein”提供了四种电泳方法：即，SDS-PAGE、PAGE、等电聚焦电泳和双向电泳。
这些电泳方法不但可以用以检测样品的纯度，而且也给出了样品的一些信息，如分子量、等电点等，这些信息对于后续提纯有重要的参考价值，等电聚焦电泳和PAGE还可以用于制备。
三、实验要求：
完成实验软件中三种酶的分离纯化。
四、实验步骤：
实验中为了比较在样品性质不同情况下，如何有效分离，以及各种方法的优劣，拟分离如下三种样品：
1. pH稳定围较大的1号蛋白
2. 碱性条件下稳定的36号蛋白
3. 酸性条件下稳定的3号蛋白
1：酸性条件下稳定的3号蛋白
3号酶在62℃以下稳定，稳定pH围3.8～5.8（酸性条件）。
以上为总步骤
二维电泳，pH 3～10，分离胶浓度10％（体积分数），浓缩胶浓度3％（体积分数）
以上为第一步骤具体参数
以上为第二步骤具体参数
以上为第三步骤集体参数
以上为第三步洗脱曲线
以上为第三步之后的二维电泳，pH 3～10，分离胶浓度10％（体积分数），浓缩胶浓度3％（体积分数）
以上为第四步的具体参数
以上为第四步的洗脱曲线
以上为第四步之后的二维电泳，pH 3～10，分离胶浓度20％（体积分数），浓缩胶浓度3％（体积分数）
已经达到一个点的要求
PAGE：分离胶浓度10％（体积分数），浓缩胶浓度3％（体积分数），缓冲体系：磷酸二氢钾-NaOH，pH 8.0
已经达到一个点要求
SDS-PAGE：分离胶浓度20％（体积分数），浓缩胶浓度3％（体积分数）。
已经达到一条线要求
由以上试验可得酶活力回收91.86％，纯化倍数为20.577，耗费986.8054元，费时35小时。
2：碱性条件下稳定的36号蛋白36号酶在31度下稳定，稳定pH围7.7-10
以上为总步骤
二维电泳，pH 3～10，分离胶浓度10％（体积分数），浓缩胶浓度3％（体积分数）
第一步的具体参数
第一步的洗脱曲线
第一步之后的二维电泳，pH 3～10，分离胶浓度10％（体积分数），浓缩胶浓度3％（体积分数）
第二步的具体参数
第二步的洗脱曲线
二维电泳，pH 3～10，分离胶浓度10％（体积分数），浓缩胶浓度3％（体积分数）已经达到一个点
PAGE 缓冲体系：Gly-NaOH（pH8.6-10.6），pH8.6。
可以看出，已经基本达到一个点。
SDS-PAGE：分离胶浓度10%（体积分数），浓缩胶浓度3%（体积分数）
已经达到只有一条清晰的线
由以上试验可得酶活力回收93.01％，纯化倍数为15.605，耗费340元，费时20小时。
3： pH稳定围较大的1号蛋白
1号酶在50度下稳定，稳定围2-11(稳定围较大)
以上为总步骤
二维电泳，pH 3～10，分离胶浓度10％（体积分数），浓缩胶浓度3％（体积分数）
以上为第一步的具体参数
以上为第二步的具体参数
以上为第二步骤的洗脱曲线
以上为第二步后二维电泳，pH 3～10，分离胶浓度10％（体积分数），浓缩胶浓度3％（体积分数）
以上为第三步的具体参数
以上为第三步的洗脱曲线
二维电泳，pH 3～10，分离胶浓度10％（体积分数），浓缩胶浓度3％（体积分数）已经达到一个点
PAGE：分离胶浓度10％（体积分数），浓缩胶浓度3％（体积分数），缓冲体系：磷酸二氢钾-NaOH，pH 8.0
已经达到一个点要求
SDS-PAGE：分离胶浓度10％（体积分数），浓缩胶浓度3％（体积分数）。
已经达到一条线要求
由以上试验可得酶活力回收95.07％，纯化倍数为5.746，耗费752.7元，费时25小时。