基础生化实验-蛋白质纯化
蛋白质的分离纯化
蛋白质的分离纯化蛋白质是生命体中最基本的分子之一，它在细胞内发挥着重要的功能。
由于蛋白质的复杂性和多样性，研究人员通常需要从复杂的混合物中分离和纯化蛋白质。
蛋白质的分离纯化是生物化学和生物技术领域中非常重要的一项工作，它为我们深入研究蛋白质的结构和功能提供了必要的条件。
蛋白质的分离纯化可以通过多种不同的方法实现，这些方法包括离心法、凝胶过滤法、电泳法、层析法等。
在选择合适的方法时，研究人员需要考虑到蛋白质的特性以及实验的要求。
离心法是最常用的分离方法之一，在离心过程中，通过调整离心力和离心时间，可以实现不同密度的蛋白质的分层。
这种方法适用于分离大分子量的蛋白质。
凝胶过滤法是利用孔径不同的凝胶将蛋白质分离开来。
通常使用的凝胶有琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶，这些凝胶具有不同的孔径，可以根据蛋白质的分子量选择合适的凝胶进行分离。
电泳法是基于蛋白质的电荷和分子量差异而进行分离的方法。
最常用的电泳方法是SDS-PAGE电泳，通过使用SDS（十二烷基硫酸钠）对蛋白质进行解性和蛋白质间的形成复合物，使得蛋白质在电泳过程中仅仅受到电场力的影响，从而实现蛋白质的分离。
层析法是一种利用物质在载体上的分配和吸附性质进行分离的方法。
常见的层析方法有凝胶层析、亲和层析、离子交换层析等。
凝胶层析是通过利用载体颗粒的孔径进行分离，亲和层析是将特定配体固定在载体上，与目标蛋白质结合，从而实现分离，而离子交换层析是利用载体表面电荷与目标蛋白质的电荷相互作用进行分离。
在进行蛋白质的分离纯化时，需要注意以下几个关键步骤。
首先是样品制备，通常样品要经过细胞破碎、蛋白质提取等步骤，使得目标蛋白质从复杂的混合物中提取出来。
其次是样品的处理，包括去除杂质、调整蛋白质的溶液环境等。
然后是选择合适的分离方法，根据蛋白质的特性和实验要求来确定最适合的方法。
最后是纯化过程中的监测和分析，通过使用各种蛋白质分析方法，如SDS-PAGE、Western blot等，来确定目标蛋白质的纯化程度和鉴定其存在。
生化实习报告
实习报告一、实习背景及目的随着科学技术的不断发展，生物技术在各个领域中的应用日益广泛，生化实验技术也成为了现代科学研究的重要手段。
为了提高自己的实践操作能力，将所学理论知识与实际相结合，我参加了本次生化实习。
本次实习旨在培养我们的实验操作技能、科学研究能力和团队协作精神，深入了解生物化学实验的基本原理和方法。
二、实习内容与过程实习期间，我们进行了多个生化实验，包括蛋白质的提取与纯化、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、酶活性测定等。
以下为部分实验的详细过程及结果：1. 蛋白质的提取与纯化(1) 实验原理：利用不同浓度的盐溶液对蛋白质进行分级沉淀， followed by washing and elution with specific buffers to obtain purified protein.(2) 实验过程：首先，将样品与适量的高盐溶液混合，充分搅拌，置于冰箱中沉淀过夜。
次日，离心弃去上清液，用低盐溶液洗涤沉淀，然后用特定缓冲液进行洗脱，收集洗脱液。
(3) 实验结果：通过透析、凝胶过滤和离子交换层析等方法，成功获得了较纯净的蛋白质。
2. SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(1) 实验原理：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳是一种常用的蛋白质分离技术，通过蛋白质与SDS形成的复合物在电场中的迁移速率来实现分离。
(2) 实验过程：首先，制备SDS-聚丙烯酰胺凝胶，然后将样品与SDS溶液混合，加热使蛋白质变性。
接着，将混合液加载到凝胶上，进行电泳。
最后，用染色剂对凝胶进行染色，观察蛋白质带。
(3) 实验结果：通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，成功地将不同分子量的蛋白质分离，并观察到清晰的蛋白质带。
3. 酶活性测定(1) 实验原理：酶活性测定是通过测定酶催化反应的速率来评估酶活性的大小。
本实验采用紫外分光光度法测定酶活性。
(2) 实验过程：首先，准备酶溶液和底物溶液。
然后，将酶溶液与底物溶液混合，置于恒温振荡器中反应。
蛋白质生化技术实验报告
蛋白质生化实验报告生殖免疫研究所薛樱子学号：1133111003实验一溶液中蛋白质浓度的测定一光吸收法（测量范围：0.1—2mg）1实验原理：由于蛋白质中存在着含有共轭双键的酪氨酸和色氨酸，它们具有吸收紫外光的性质，其吸收高峰在280nm波长处，且在此波长内吸收峰的光密度值OD280nm与其浓度成正比关系，故可作为蛋白质定量测定的依据。
纯蛋白的A280/A260为 1.8，纯核酸的A280/A260为2步骤：2.1）打开仪器的电源开关（接220V交流电），打开比色槽暗箱盖，选择光源，选档，选波长，用调零旋钮调暗电流至0 。
2.2）将空白对照样品和待测溶液装入石英比色杯2.3）将仪器的比色槽暗箱合上，比色槽处于蒸馏水（或校正缓冲液）校正位置，旋转光量调节器使电表指针正确处于0 。
2.4）拉出比色槽手柄拉杆使比色槽处于样品位置读数。
2. 5）在260nm和280nm分别读数（分别用缓冲液调0），根据上表查处相应蛋白浓度，根据喜事倍数计算原溶液蛋白浓度，根据体积计算总蛋白量。
3结果与分析：A280=0.571 A260=0.340根据公式：蛋白浓度=1.5 ×A280 —0.75 ×A260=1.5×0.571—0.75×0.340=0.6015也可以根据蛋白质和核算含量折算图表画出一条直线估算蛋白质的浓度。
结果说明我的蛋白样品浓度是0.6015mg/ml。
二Folin—酚法（测量范围：10-300ug/ml）1实验原理：在碱性条件下，蛋白质中的肽键与铜结合生成复合物。
Folin—酚试剂中的磷钼酸盐—磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原，产生深蓝色（钼兰和钨兰的混合物）。
在一定的条件下，蓝色深度与蛋白的量成正比。
2试剂：2.1）甲液：１，4%碳酸钠；2，0.2n氢氧化钠；3，1%硫酸铜；4,2%酒石酸钾钠。
1和2，4溶于500ml水中，然后和4以50：1混合。
提蛋白质的原理及步骤
蛋白质提取是一项基础实验，通常用于从组织或细胞中提取纯度较高的蛋白质样品，以便进行各种蛋白质研究。
常规的蛋白质提取步骤包括以下几个主要步骤：
1. 细胞或组织的裂解：将待提取的样品裂解以释放出蛋白质。
裂解方法取决于被裂解的细胞类型，可使用机械法、化学法、超声波或高压等方法进行裂解。
2. 蛋白质的分离：将蛋白质与非蛋白质组分进行分离，常用的方法有沉淀、过滤、离心和柱层析等。
3. 蛋白质的纯化：通过进一步的分离和纯化来获得高纯度的蛋白质。
这些步骤通常需要进行多次，每次都使用不同的方法来分离和纯化蛋白质。
提蛋白质的原理是基于蛋白质的化学和物理特性进行分离和纯化。
蛋白质分子量大小、电荷、亲水性等特性不同，容易与不同化学试剂、柱层析介质或生物酶相互作用。
通过调节这些条件和步骤，就可以使不同的蛋白质与其它组分分离出来，并得到纯度较高的蛋白质样品。
虽然蛋白质提取步骤较多，但因为各种蛋白质的特性不同，所以实验时需要根据需要选择不同的提取和分离方法以获得更理想的效果。
生物化学实验--蛋白质性质试验
（三）黄色反应 原理：蛋白质分子中含有苯环结构的氨基酸（如
酪氨酸、色氨酸等），于浓硝酸可反应并生成黄色物 质，此物质在碱性环境下变为桔黄色的硝基苯衍生物 硝醌酸等。
操作：取一支试管，加入1ml蛋白液及浓硝酸5滴。加 热，冷却后注意颜色变化。然后再加入10%NaOH溶液 1ml，颜色有什么变化？
（四）茚三酮反应 原理：蛋白质与茚三酮共热，产生兰紫色的还原茚三
操作：
1、尿素实验
取少量尿素晶体放在干燥的试管中，微火加热使其
熔化成液体，此时有氨气放出，可用湿润的试纸检验，
至液体重新结晶出现白色固体时，停止加热，冷却。然
后加10%NaOH溶液1ml，摇匀，再加2-4滴1% 混匀，观察有无紫色出现。
CuSO4溶液，
2、蛋白液实验
取蛋白液1ml，加10%NaOH溶液1ml，摇匀，再加2-4 滴1% CuSO4溶液，混匀，观察有无紫色出现。
荧光法gml不同种类蛋白最大吸收波长nm标准方法准确操作麻烦费时灵敏度低适用于标准的测定紫外分光光度280205灵敏快速不消耗样品核酸类物质有影响100010000540重复性线性关系好灵敏度低测定范围窄样品需要量大folin酚试剂750灵敏费时较长干扰物质多25050500595灵敏度高稳定误差较大颜色会转移bca50500562灵敏度高稳定干扰因素少费时较长蛋白质不同方法比较一实验原理一实验原理蛋白质或多肽分子中有带酚基酪氨酸或色氨酸在碱性条件下可使酚试剂中的磷钼酸化合物还原成蓝色生成钼蓝和钨蓝化合物
察结果。 （四）生物碱试剂沉淀蛋白质 取一支试管，加入蛋白液2ml及醋 酸4-5滴，再加饱和苦味酸数滴，
观察现象。
http://222.195.234.199/openclass 登录名：自己的学号 密码：自己的学号 大家先把电子版的实验报告作好，然后在
蛋白质提取与纯化技术
蛋白质提取与纯化技术选择材料及预处理以蛋白质和结构与功能为基础，从分子水平上认识生命现象，已经成为现代生物学发展的主要方向，研究蛋白质，首先要得到高度纯化并具有生物活性的目的物质。
蛋白质的制备工作涉及物理、化学和生物等各方面知识，但基本原理不外乎两方面。
一是得用混合物中几个组分分配率的差别，把它们分配到可用机械方法分离的两个或几个物相中，如盐析，有机溶剂提取，层析和结晶等；二是将混合物置于单一物相中，通过物理力场的作用使各组分分配于来同区域而达到分离目的，如电泳，超速离心，超滤等。
在所有这些方法的应用中必须注意保存生物大分子的完整性，防止酸、硷、高温，剧烈机械作用而导致所提物质生物活性的丧失。
蛋白质的制备一般分为以下四个阶段：选择材料和预处理，细胞的破碎及细胞器的分离，提取和纯化，浓细、干燥和保存。
微生物、植物和动物都可做为制备蛋白质的原材料，所选用的材料主要依据实验目的来确定。
对于微生物，应注意它的生长期，在微生物的对数生长期，酶和核酸的含量较高，可以获得高产量，以微生物为材料时有两种情况：（1）得用微生物菌体分泌到培养基中的代谢产物和胞外酶等；（2）利用菌体含有的生化物质，如蛋白质、核酸和胞内酶等。
植物材料必须经过去壳，脱脂并注意植物品种和生长发育状况不同，其中所含生物大分子的量变化很大，另外与季节性关系密切。
对动物组织，必须选择有效成份含量丰富的脏器组织为原材料，先进行绞碎、脱脂等处理。
另外，对预处理好的材料，若不立即进行实验，应冷冻保存，对于易分解的生物大分子应选用新鲜材料制备。
蛋白质的分离纯化一，蛋白质（包括酶）的提取大部分蛋白质都可溶于水、稀盐、稀酸或碱溶液，少数与脂类结合的蛋白质则溶于乙醇、丙酮、丁醇等有机溶剂中，因些，可采用不同溶剂提取分离和纯化蛋白质及酶。
（一）水溶液提取法稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶剂，通常用量是原材料体积的1-5倍，提取时需要均匀的搅拌，以利于蛋白质的溶解。
【生物化学】第八章 蛋白质的分离纯化
㈤、凝胶过滤层析技术
⒈ 基原理
概念（排阻层析，分子筛层析）： 当生物大分子通过装有凝胶颗粒 的层析柱时，根据它们分子大小 不同而进行分离的技术。 原理：凝胶颗粒内部具有多孔网 状结构，被分离的混合物流过层 析柱时，比凝胶孔径大的分子不 能进入凝胶孔内，在凝胶颗粒之 间的空隙向下移动，并最先被洗 脱出来； 比网孔小的分子能不同程度的自 由出入凝胶孔内外，在柱内经过 的路程较长移动速度较慢，最后 被洗脱出来。
⒊ 分配纸层析
纤维素吸附的水是固定相，展层用的有 机溶剂是流动相
层析时混合氨基酸在这两相中不断分配， 使他们分布在滤纸的不同位置上。
此项技术可用于氨基酸成分的定量定性 测定。
⒊ 分配纸层析
操作：点样→展层→显 色用茚三酮显色时，得到 一个滤纸层析谱。 定义：原点到氨基酸停 留点的距离与原点至溶剂 前沿之比称为Rf值。 只要把溶剂系统、温度、 滤纸型号等条件确定，则 每一种氨基酸的Rf值是一 个确定值。
⒊ 分析型超速离心机
XL-A分析型超速离 心机 主要技术指标： 检测波长范围 200nm800nm 转子最大转速 40000RPM
什么是酶的活性中心？ 三维结构上比较接近的少数特异的氨基酸残基参与底物的 结合与催化作用，这一与酶活力直接相关的区域称酶的活 性部位。 在很多酶的活性中心均有His残基参与，原因是什么? 酶蛋白分子中组氨酸侧链咪唑基pK值为6.0-7.0，在生理条 件下，一半解离，一半不解离，因此既可以做质子供体，也 可以做质子受体，可以作为广义酸碱共同催化反应。 胰凝乳蛋白酶活性中心的催化三联体是指哪三种氨基酸？
⑵ 按两相所处的状态分类 流动相有两种状态：
*液体作为流动相 *气体作为流动相 固定相也有两种状态： *固体吸附剂作为固定相 *以吸附在固体上的液体作为固定相
生化大实验实验报告范文
生化大实验实验报告范文一蛋白质提取、纯化及分析技术实验一多酚氧化酶（PPO）的分离提取一、材料与试剂（1）马铃薯（大约每小组200-300g）（2）试剂：0.03M磷酸缓冲液PH6.0(内含0.02m巯基乙醇，0.001mEDTA，5%甘油，1%的聚乙烯吡咯烷酮)配制时配某10倍的浓缩液1000ml；固体硫酸铵；0.03M磷酸缓冲液PH6.0（内含0.02m巯基乙醇，0.001mEDTA，0.005mMgCL2）配置时配。
（3）实验器械与仪器设备：试管与试管架；烧杯、玻璃搅棒；移液管、滴管等；试剂瓶；透析袋；过滤纱布；植物组织匀浆器；PH计和PH试纸；GL-20C高速冷冻离心机；DL-7A大容量低速冷冻离心机二、操作步骤1：粗酶提取：马铃薯组织按1：1（W/V）比例与0.03m磷酸缓冲液PH6.0（内含0.02M巯基乙醇，0.001mEDTA，5%甘油，1%聚乙烯吡咯烷酮）混合，匀浆4层后纱布过滤，滤液以6000rpm离心10min，弃除沉淀获得酶提取液。
2：盐析分级沉淀：在酶提取液中加入固体硫酸铵使其达到40%饱和度（边加边搅拌达到充分溶解），然后6000rpm离心20min弃除沉淀；离心上清液在加入固体硫酸铵达到70%饱和度（边加边搅拌达到充分溶解），再以6000rpm离心20min，弃除上清夜，收集粗酶沉淀。
沉淀用0.03M磷酸缓冲液PH6.0（内含0.02巯基乙醇，0.001MEDTA，0.005MMgCL2）溶解，装入透析袋中用0.02NKCL溶液透析至无硫酸铵根离子，获得粗酶液供上柱使用。
三、实验结果获得PPO粗酶液供上柱使用。
实验二柱层析纯化PPO一、材料与试剂试剂：0.02MTri-HCL缓冲液Ph7.4(内含0.001MEDTA)配制时配某10倍浓缩液1000ml;NaCL;聚已二醇；葡聚糖凝胶Sephade某G-200等；实验器械与仪器设备：试管与试管架、烧杯、玻璃搅棒、移液管、滴管等；试剂瓶、层析柱、pH计和pH试纸、恒流泵、梯度混合仪、核酸蛋白监测仪、GL-20C高速冷冻离心机、DL-7A大容量低速冷冻离心机二、操作步骤1．葡聚糖凝胶的处理、装柱及平衡（1）柱材处理称取一定量的Sephade某G-200干粉，加无离子水或蒸馏水浸泡溶胀48h,去掉悬浮的细微颗粒，为防止凝胶颗粒中的空气存在，影响层析效果，凝胶装柱前一定要将凝胶液中的气体除掉，其办法是将凝胶液放进抽滤瓶中，进行抽真空处理，直到凝胶液中没有气泡出现为止。
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蛋白质纯化一、目的:利用金属亲和性管柱(metal affinity column)来大量纯化带有affinity tag的基因重组蛋白。
二、原理:由于六个Histidine 所组成的His Tag (metal affinity tag)可与Ni2+ bind，所以利用基因重组技术在表现的蛋白质加上His Tag，再以金属亲和性管柱(Ni-NTA) (此His- tag序列可与带二价正电的阳离子相螯和)及liquid chromatography来大量纯化蛋白质。
三、试剂与器材:1.loading(binding) buffer (10mM imidazole,0.3M NaCl,50Mm Tris-HClPh7)✧细菌回溶成为蛋白质的载体以保持活性2.wash buffer (20mM imidazole,0.3M NaCl,50Mm Tris-HCl,Ph7)3.elution buffer (20mM EDTA,0.3M NaCl,50Mm Tris-HCl,Ph7)上课补充:✧蛋白质很脆弱，需要在特殊的buffer里。
四、仪器与设备:FPLC(速液相色谱仪)五、步骤:1.将管柱架在铁架上，把亲和性胶体悬浮装填于管柱内。
2.以2~3倍CV loading buffer清洗管柱后，注入蛋白质样本。
3.以wash buffer梳洗，2到3倍column体积。
4.用wash buffer和elution buffer进行线性梳洗，并收集流出液体，以FPLC UV monitor上的OD280数据读取样品流出与否，并观察冲离液之曲线图。
上课补充:✧胞内型分泌需要用超音波破菌，因为会放热所以要放在冰中使用。
✧线性梳洗为加入elution buffer会有颜色变化会把镍离子跟imidazole冲洗掉，剩下胶体溶液。
✧其中imidazole和Histidine类似也会和镍离子结合所以会竞争，可拿来洗涤蛋白质。
(可详见问题一及补充资料2)六、问题:问题一: Imidazole的结构与特性。
Imidazole又名咪唑即1,3-二氮唑，是一个五元杂环芳香性有机化合物，化学式C3H4N2。
它也是一个生物碱。
白色或浅黄色固体结晶，可溶于水、氯仿、醇、醚，具有酸性，也具有碱性。
氢原子在两个氮原子之间移动，因此存在两个互变异构体。
咪唑环结构在生物分子中广泛存在，例如组氨酸和对应的荷尔蒙组胺。
很多药物也包含有咪唑环，例如硝基咪唑和咪唑类抗真菌药物。
结构与性质咪唑为平面五元环状化合物，易溶于水（以无限比例）和其它极性溶剂。
咪唑的两个氮原子间存在永久偶极，极性很强，偶极矩为3.61D，并且分子间存在氢键缔合，导致了咪唑具有反常高的沸点（256°C）。
分子中存在一个6电子共轭大π键，故具有典型的芳香性。
与氢以σ键相连的氮原子提供一对电子，环内其余四个原子各提供一个电子成键。
1N上有氢的咪唑环中，氢原子可以在两个氮原子间迁移，存在两个互变异构体，C-4和C-5是等同的。
这两个互变异构体无法分离，当有取代基时，常以「4(5)-取代咪唑」（如4(5)-甲基咪唑）来命名。
组氨酸生成组胺的反应如下所示：咪唑一个用途是在金属螯合亲和层析(IMAC)中用于His标签蛋白的纯化。
标签蛋白与层析柱表面珠孔内的镍离子介质发生结合，过量的咪唑通过层析柱，将与镍配位的标签蛋白洗脱下来，得到高纯度的目标蛋白。
咪唑是许多药品的重要组成部分。
许多杀菌剂和抗真菌、抗原虫和抗高血压的药物中含有合成咪唑。
咪唑是茶叶和咖啡豆中含有的茶碱分子的组成部分，具有刺激中枢神经系统的作用。
通过干扰DNA的活动抑制白血病的抗癌药物巯嘌呤中也含有咪唑。
问题二:2.ETDA的资料(整理)EDTA又名乙二胺四乙酸(Ethylene Diamine Tetraacetic Acid)简称：EDTA俗名；依地酸（特别是它的钙盐络合物，医学上称为依地酸钠钙）分子量：292.248分子式：C10H16N2O8为白色无臭无味、无色结晶性粉末，熔点240℃(分解)。
不溶于冷水、醇及一般有机溶剂，微溶于热水，溶于氢氧化钠，碳酸钠及氨的溶液中，能溶于160份100℃沸水。
为一种有机化合物。
它是一个六齿配体，可以螯着多种金属离子。
它的4个酸和2个胺的部分都可作为配体的齿，与锰（II）、铜（II）、铁（III）及钴（III）等金属离子组成螯合物化学家曾经用多种不同的字来形容EDTA，例如将配体本身叫做EDTA4−，而它的共轭酸叫做H4EDTA。
配合物EDTA和金属的螯合物，EDTA 和其他化合物如H2IDA（亚胺基二乙酸）和H3NTA（氨三乙酸）等属于同类的螯合物，这些配体都是由一种叫做甘氨酸的胺基酸制成的。
EDTA类的螯合物都极易溶于水。
这些配体都为三或四齿配体，而合成出来的螯合物都是光学异构物。
用途在1999年欧洲EDTA年消耗量为35,000吨，在美国为50,000吨，其重要的用途如下：∙工业：清理重金属离子及Ca2+和Mg2+离子。
∙肥皂：与硬水中的Ca2+和Mg2+离子结合来降低硬度。
∙摄影：以Fe(III)EDTA作为氧化剂。
∙纺织品：与重金属结合。
∙食物：作为防腐剂来避免重金属的氧化。
∙化妆品：加上EDTA 来保存化妆品。
∙油生产：加上EDTA 来防止矿物沈淀。
∙牛奶：清洗牛奶瓶。
∙氮氧化物：废气的处理。
∙生物医学：o汞毒治疗：使用EDTA的二钠钙盐-乙二胺四乙酸二钠钙[3]（EDTA Na2-Ca）治疗重金属中毒。
可治疗汞中毒的人，也可治疗铅中毒的人。
利用EDTA与重金属结合的特性，生成穏定而可溶的盐，随尿液排出。
o检验医学：作为血液等液体类标本的抗凝剂（如全血细胞计数时所采用的血液标本）。
o牙医学：在根管治疗术中用来清除一些有机或无机的物质。
o生物化学：在分子生物学中用EDTA 来防止金属离子对酶的影响[4]。
∙汽水：汽水中含有的维生素C和苯甲酸钠有机会产生致癌物质苯，可以EDTA来处理。
∙水的测试：测试水的硬度。
环境问题EDTA 不能在污水处理中被分解，不过在控制着pH值的情况下，经长时间后EDTA 就会几乎完全反应了，当其时要将其他微生物抽离，来让EDTA 完成结合的过程。
在水中，太多或太少的螯合物都会影响浮游生物和藻类的数量，可以是增加或者减少。
EDTA 对细菌来说是有毒的，在哺乳类动物的粪便中会破坏生物的细胞膜。
问题三:Tris-HCL是甚么?答:Tris-HCl是三羟甲基氨基甲烷盐酸盐的英文名称的缩写, 用作生物缓冲剂,添加剂英文名Tris(hydroxymethyl)aminomethane hydrochloride别名2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol hydrochloride; Tromethanehydrochloride; Trizma hydrochloride别名:2-氨基-2-羟甲基-1,3-丙二醇盐酸盐三羟甲基氨基甲烷盐酸盐分子式:C4H11NO3.HCl分子量:157.59物理化学性质熔点:150-152°C为水溶性SOLUBLE结构式:pKa ( 25℃ ):pH ( 0.5M in water ) 3.5 ~ 5.0问题四:为何使用UV波长为280 nm?答:一般有机物质，对于波长在250 nm 以下的光才有吸收作用，但含有苯环的胺基酸(aromatic amino acids)，对于波长250 nm 以上的光却有吸收作用。
凡含有此等胺基酸的蛋白质，其水溶液对于波长在260 nm至290 nm (通常取280 nm波长)之光，均有吸收作用，其吸收量与蛋白质溶液的浓度成正比。
所以含有phenylalanine、tyrosine或tryptophan的蛋白质，均可采用此法来定量。
利用UV光OD280(波长280nm)可侦测蛋白质的特性，可以将从管柱流出的蛋白质绘出吸收峰图型，在对照圆盘内所收集纯化蛋白质的tube，搭配蛋白质电泳SDS-PAGE观测，取自tube内的液体进行蛋白质电泳，可以更加确定蛋白质的分子量及纯度。
七、补充资料:1. 快速液相色谱仪(FPLC)利用快速液相色谱仪搭配不同性质和特性的纯化蛋白质用的管柱，依照研究目标蛋白质的特性，可以从已破菌的菌液中分离出来。
纯化蛋白质用的管柱，可以分为:亲和性管柱：经典代表为镍金属的树脂，当将研究目标在其蛋白质的头尾端，加上6个His(与镊金属结合形成敖合物)，之后在利用与His类似的化合物，与镍金属结合的蛋白质竞争，进而分离出带走6个His的研究目标蛋白质✧分子筛管柱: 可以依照分子量大小不同，导致流出管柱的时间点不同来分离✧离子树质管柱：利用蛋白质在不同pH值下，会使蛋白质改变其本身的电荷，来达到吸附管柱的效果，将研究目标蛋白质与其他大肠杆菌本身所携带的蛋白质分离。
←快速液相色谱仪(FPLC)2.组胺酸(Histidine)组胺酸缩写:His, H化学式:C6H9N3O2摩尔质量:155.16 g·mol−1p K a2 = 6.0 (咪唑环)而这次实验所使用的六个Histidine结构与镍离子结合如下图3.螯合物与螯合剂螯合物又称内络合物，是螯合物形成体（中心离子）和某些合乎一定条件的螯合剂（配位体）配合而成具有环类架构的配合物。
“螯合”即成环的意思，犹如螃蟹的两个螯把形成体（中心离子）钳住似的，故叫螯合物。
形成螯合物的第一个条件是螯合剂必须有两个或两个以上都能给出电子对的配位原子（主要是N，O，S等原子）。
第二个条件是每两个能给出电子对的配位原子，必须隔着两个或三个其他原子，因为只有这样，才可以形成稳定的五原子环或六原子环。
例如，在氨基乙酸根离子（H2N-CH2-COO-）中，给出电子的羟基氧和氨基氮之间，隔着两个碳原子，因此它可以形成稳定的具有五原子环的化合物。
常用的螯合剂是氨螯合剂，是一类似以氨基二乙酸[HN（CH2COOH）2]为基体的螯合剂，它以N，O为螯合原子，与金属离子螯合时形成环类的螯合物常用的氨羧螯合剂有︰1.氨羧螯合剂Ⅰ（ATA）指的是氨三乙酸2.氨羧螯合剂Ⅱ（EDTA）指的是乙二胺四乙酸。
EDTA是应用最广的一种氨羧螯合剂，用EDTA标准液可以滴定几十种金属离子，这个方法就称EDTA滴定法。
目前所谓螯合滴定法主要是指EDTA滴定。