微机模拟蛋白质纯化实验
蛋白质分离纯化及鉴定综合实验
百泰派克生物科技
蛋白质分离纯化及鉴定综合实验
在蛋白组学研究中，如果要对某一混合体系中的蛋白质进行定性或定量分析，就需要先对蛋白组分进行分离、纯化，然后再进行后续的鉴定分析。
这一系列实验环环相扣，每一步都至关重要，直接影响实验结果的准确性。
理想的蛋白质分离技术首先要有超高的分辨率，能够将成千上万不同类型的蛋白质包括它们修饰物进行有效的分离。
目前常用的蛋白质分离技术包括一维/二维凝胶
电泳技术、双向电泳技术以及凝胶色谱技术等。
经分离的蛋白质需要进行纯度检测来评价是否含有其他杂蛋白或者杂质，通常利用聚丙烯电泳法、免疫化学法、沉降速率测定法、色谱法、质谱法等进行纯度检测。
对于含有杂质的蛋白需进行纯化，如含有核酸、糖类或脂类杂质，可以利用核酸沉淀法或有机溶剂沉淀法对杂质进行去除。
对蛋白质进行鉴定主要是基于其基本的理化参数对其进行鉴定，包括相对分子量、等电点、翻译后修饰、氨基酸序列以及高级结构等，可以选择单一的性质进行鉴定，也可以进行全面分析，根据实验需求进行选择。
百泰派克生物科技基于先进的质谱仪以及专业的技术团队提供蛋白质分离纯化及鉴定一站式技术服务，包括蛋白样品分离、纯化、纯度鉴定以及定性和定量鉴定，还可提供定制化分析服务，满足不同的实验需求，欢迎免费咨询。
计算机模拟“蛋白质纯化”短学期实践报告(10号蛋白)
计算机模拟“蛋白质纯化”短学期实践报告姓名：学号：班级：成绩：一、计算机模拟实验初始条件：样品号：10样品稳定的条件：10号样品在pH3.5～11.5稳定；温度< 69°C稳定。
二、计算机模拟“蛋白质纯化”实验内容：（1）粗分离（盐析）硫酸铵饱和度沉淀蛋白(mg)沉淀酶活力(U)上清蛋白(mg)上清酶活力(U)沉淀比活力(U/mg)上清比活力(U/mg)酶回收率纯化倍数8%498 9800100% 1.0 9% 497.9 975799.8% 1.0 10% 497.5 958698.9% 1.0 18% 89.9 9029 100.4396.2% 5.1 19% 105.6 9543 90.3798.9% 4.6 20% 117.3 9713 82.8099.8% 4.221%126.1 9757 77.38100% 3.9计算机模拟“蛋白质纯化”短学期实践时间：20 年月日如表格中所示，根据相关理论及实验经验，选择了从8％硫酸铵饱和浓度起进行梯度盐析测定，经过数据对比，最终选择9％作为除杂（取上清液）的“低浓度”，因为该浓度下上清中酶的比活力和纯化倍数较相近浓度而言具有优势。
在选定低浓度并进行取上清液步骤后，我们就开始对选择高浓度。
同样地经过数据对比，最终选择了20％作为把绝大部分目标蛋白沉降的“高浓度”，其原则也是要保证在比活力和纯化倍数大的情况下，选择比活力最大的硫酸铵浓度。
注：比活力(U/mg)＝酶活力(U)：蛋白质量(mg)。
选择了9％和20％这两个浓度后，我们开始正式的盐析过程，即先在9％浓度下取上清液，然后20％浓度下取沉淀。
具体操作及所取上清/沉淀数据（如图1）。
图1 盐析结果计算机模拟“蛋白质纯化”短学期实践时间：20 年月日（2）细分离（各种纯化技术条件及结果）阴离子交换层析：Start conc设为0 M，End conc设为0.6M，Equilibration ph（平均PH）设为6，用100％的样品去进行跑样层析（如图2）。
微机模拟蛋白质纯化实验报告
微机模拟蛋⽩质纯化实验报告微机模拟蛋⽩质纯化实验⼀、实验⽬的：1. 了解模拟⽣化⼲实验的⽅法和意义，掌握⽤protein软件提纯蛋⽩质的⽅法。
2. 进⼀步熟悉层析、热变性、盐析等常⽤⽣化分离⽅法的原理和应⽤。
⼆、实验原理：“Protein”软件有36个任务，即36组待分离纯化的蛋⽩。
任务要求利⽤软件提供的⼏种实验技术，提纯每⼀个⽬的蛋⽩，最终达到单向电泳⼀条带，双向电泳⼀个点，⽽且使⽤的⼈时和经费(根据提取步骤计算得到)不得超过⼀个特定值。
在每个任务开始时，软件给出⽬的蛋⽩的⼀些性质，如热稳定的温度范围和pH稳定范围等，利⽤这些信息，可以使实验少⾛弯路。
“Protein”提供的分离纯化⽅法有七种：①热变性；②硫铵沉淀；③排阻层析(凝胶⾊谱)；④离⼦交换层析；⑤吸附层析；⑥聚焦层析；⑦制备电泳。
在“Protein”所提供的各种分离纯化⽅法中，热变性法和盐析法是⽐较好的粗提⽅法，在提纯的早期使⽤效果较好。
层析是各种⽅法中最强有⼒的⽅法，制备电泳虽然纯化倍数⾼，但是回收率低。
在各种层析⽅法中，⼜以离⼦交换层析最为有效和易于使⽤，并且耗费的⼈时和经费也较少。
排层层析和聚焦层析耗费较⼤，但在某些特定情况下，这两种⽅法是不可替代的。
“Protein”提供了四种电泳⽅法：即，SDS-PAGE、PAGE、等电聚焦电泳和双向电泳。
这些电泳⽅法不但可以⽤以检测样品的纯度，⽽且也给出了样品的⼀些信息，如分⼦量、等电点等，这些信息对于后续提纯有重要的参考价值，等电聚焦电泳和PAGE还可以⽤于制备。
本实验要求完成实验软件中三种酶的分离纯化。
1 酸性条件下稳定的蛋⽩（Windows 3号酶）3号酶在62℃以下稳定，稳定pH范围3.8～5.8（酸性条件）。
分离纯化步骤:1 热变性：⽔浴温度61℃，⽔浴时间60min2 离⼦交换：然后进⾏PAGE和SDS-PAGE检测结果分析：在检测时出现两条带的时候可能是由于蛋⽩质的含有两个亚基。
蛋白纯化整体实验报告
蛋白纯化整体实验报告实验目的本实验的主要目的是学习和掌握蛋白纯化的基本原理和方法，通过实验操作了解蛋白质纯化的整体过程，从而得到纯净的蛋白质样品。
实验原理蛋白纯化是将复杂混合物中的目标蛋白提取出并得到纯净样品的过程。
蛋白质的纯化一般包括以下几个步骤：1. 细胞破碎：将含有目标蛋白的细胞破碎，使目标蛋白从细胞中释放出来。
2. 澄清：通过离心等方法去除破碎细胞中的固体残渣，得到澄清的蛋白质上清液。
3. 分离目标蛋白：根据目标蛋白的特性选择适当的分离方法，如对目标蛋白进行亲和层析、凝胶渗透层析等。
4. 浓缩：将目标蛋白从大量的上清液中浓缩，以得到更纯净的样品。
5. 纯化检验：对所得样品进行纯度和活性的检验，确保得到纯净的、具有活性的蛋白质样品。
实验步骤步骤一：细胞破碎1. 将待检测的细胞进行冻融处理，用PBS缓冲液洗涤细胞两次。
2. 加入细胞破碎缓冲液，使细胞完全破裂释放蛋白质。
3. 低速离心去除细胞碎片和核酸。
步骤二：澄清1. 取得上清液，初步除去细胞残渣。
2. 用高速离心对上清液进行超速离心，去除大部分颗粒和碎片。
3. 将上清液过滤，去除细微残渣。
步骤三：分离目标蛋白1. 根据目标蛋白的特性选择适当的分离方法，如亲和层析、凝胶渗透层析等。
2. 对蛋白质样品进行层析操作，同时根据各分离步骤的参数进行条件优化。
步骤四：浓缩1. 使用合适的蛋白质浓缩方法，将目标蛋白质从大量上清液中浓缩。
步骤五：纯化检验1. 对所得的蛋白质样品进行纯度检验，如SDS-PAGE电泳分析等。
2. 对纯化样品进行活性检验，如酶活性测定或其它适当方法。
实验结果和讨论在本次实验中，我们成功地利用细胞破碎、澄清、分离、浓缩等步骤对目标蛋白进行了纯化。
通过SDS-PAGE电泳分析，我们确定所得样品具有较高的纯度。
经过活性检验，我们也发现纯化后的蛋白具有一定的活性，符合预期结果。
然而，我们在实验过程中也遇到了一些问题。
首先，在细胞破碎过程中需要选择合适的破碎缓冲液和破碎时间，否则可能会导致目标蛋白的降解或损失。
蛋白质纯化实验步骤
蛋白质纯化实验步骤引言:蛋白质是生物体内重要的基本组成部分，对于深入了解蛋白质的结构和功能具有重要意义。
蛋白质纯化是一个关键步骤，可以从复杂的混合物中分离出目标蛋白质，并去除杂质。
下面将介绍一种常用的蛋白质纯化实验步骤。
一、样品制备在开始蛋白质纯化实验之前，首先需要准备样品。
样品可以是细胞提取物、培养基中的蛋白质等。
样品制备的关键是要保证样品的完整性和纯度，避免蛋白质的降解和杂质的污染。
二、离心将样品进行离心，以去除细胞碎片和细胞核等大颗粒物质。
离心过程中，可以根据颗粒物质的大小和密度来选择合适的离心条件，如转速、离心时间等。
三、初步分离将离心后的上清液取出，进行初步分离。
可以采用一些常用的分离技术，如离子交换色谱、凝胶过滤等。
这些技术可以根据蛋白质的电荷、大小等特性进行分离，从而使目标蛋白质得到部分纯化。
四、亲和层析亲和层析是一种常用的蛋白质纯化技术，通过利用目标蛋白质与某种亲和剂之间的特异性相互作用来实现纯化。
亲和剂可以是金属离子、抗体、配体等，可以根据目标蛋白质的性质和特点来选择合适的亲和剂。
五、凝胶电泳凝胶电泳是一种常用的蛋白质分离和分析技术，通过电场作用使蛋白质在凝胶中迁移，根据蛋白质的大小和电荷来实现分离。
凝胶电泳可以用于检测和鉴定目标蛋白质，同时也可以用于纯化蛋白质。
六、柱层析柱层析是一种常用的蛋白质纯化技术，通过将样品溶液通过填充在柱子中的吸附剂层析，实现蛋白质的分离和纯化。
柱层析可以根据蛋白质的性质和特点来选择合适的吸附剂，如离子交换柱、凝胶过滤柱等。
七、透析透析是一种常用的蛋白质纯化技术，通过溶液之间的渗透压差来实现目标蛋白质的分离和杂质的去除。
透析可以用于去除一些小分子杂质，如盐类、小分子药物等。
八、浓缩浓缩是一种常用的蛋白质纯化技术，通过去除大量的水分来提高目标蛋白质的浓度。
常用的浓缩技术有深度过滤、超滤等，可以根据蛋白质的分子量和颗粒大小来选择合适的浓缩方法。
九、纯化验证在蛋白质纯化实验结束之后，需要对纯化后的目标蛋白质进行验证。
蛋白表达纯化实验步骤
蛋白表达纯化实验步骤(待改进）1、取适当相应蛋白高表达的动物组织提total-RNA.2、设计蛋白表达引物。
引物要去除信号肽，要加上适当的酶切位点和保护碱基。
3、RT—PCR，KOD酶扩增获取目的基因c DNA。
4、双酶切，将cDNA.克隆入PET28/32等表达载体。
5、转化到DH5α感受态细菌中扩增，提质粒。
6、将质粒转化入表达菌株,挑菌检测并保种。
表达菌株如Bl21（DE3)、Rosetta gami（DE3)、Bl21 codon（DE3)等。
7、蛋白的诱导表达。
1）将表达菌株在3ml LB培养基中摇至OD=0.6左右,加入IPTG,浓度梯度从25μM到1m M。
37度诱导过夜（一般3h以上即有大量表达)。
2）SDS—PAGE电泳检测目的蛋白的表达.注:目的蛋白包涵体表达量一般会达到菌体蛋白的50％以上，在胶上可以看到明显的粗大的条带。
3)将有表达的菌株10%甘油保种，保存1ml左右就足够了，并记录IPTG浓度范围.甘油是用0。
22μm过滤除菌的，储存浓度一般是30%—60%,使用时自己计算用量.4）用上述IPTG浓度范围的最低值诱导10ml表达菌，18度,低转速（140-180rpm）,诱导过夜作为包涵体检测样品。
注意：1。
如果表达的蛋白对菌体有毒性，可以在加IPTG之前的培养基中加入1％的葡萄糖用来抑制本底表达。
葡萄糖会随着细菌的繁殖消耗殆尽，不会影响后面的表达。
2.保种可以取一部分分成50μl一管,每次用一管，避免反复冻融。
8、包涵体检测.方案见附件29、如有上清表达,则扩大摇菌。
1)取保种的表达菌株先摇10ml,37度，300rpm摇至OD>=1.5，约5h左右,视菌种的活性而异，也可过夜摇菌.2)将上一步中的8ml加入300ml培养基中37度,250rpm摇至OD= 1。
0左右(约2.5h～3h)，然后加IPTG（浓度同包涵体检测中使用的浓度.）注:菌液浓度要适当的浓一些,否则第二天收集不到足够的菌体，因为低温低转速细菌生长非常缓慢。
“干实验”研究——在微机上模拟蛋白质纯化实验
１ “ 干实验” 软件的开发
１ １ 开发思 路和 功能 ．
模 拟动 态的实 验过程 难度 较 大 ， 目前成 熟 的实用 软 件还 不 多见 。而用计 算机 模拟 蛋 白质纯 化实 验是 其
蛋 白质纯 化实 验模 拟软件 的最 终形 态应该 是一 个人 机交 互 的模拟 程序 。 由于用户 主要是 在校 学 习 生物 化学 课程 的本科 生 和研究 生 ，程序应 该 面向用
据 中归 纳 出相应 的规律 。我 们在 多年实 验教 学 的过 程 中积 累了大量 的实验 数据 ，从 理论上 建模 或是 用
ｐｅ ｅ ｙ ｓｍｕ ａｉｎ ｓ ｆ ａ ｅ ｈ ｄ ａｆ ｒｄ ｖ ｌｐ ｎ ｈ ｓ Ｃ ｏｔ ａ ｅ ａ ｄ ｐ ｏ ｅ ｕ ｅ ｆｔ ｅ ｄ ｖ ｌ ｐ ｎ ｒ ｉ－ ｌｔ ｄ ｂ ｉ ｌｔ ｏｔ ｒ ．Ｔ ｅ ｉｅ ｏ ｅ ｅｏ ｉ ｇ ｔｉ ＡＩｓ ｆ ｒ ｎ ｒｃ ｄ ｒ ｓ ｏ ｈ ｅ ｅｏ ｍｅ ｔａ ｅ ｄ ｓ ｏ ｗ ｗ
ｃ ｓ ｅ ．Ｔ ｅ ｅ ｃ ｉｇ ｅ ｅ ｔ ，ｕ ｉｇ ｃｒ ｕ ｔｎ ｅ ，ａ ｄ ｃ ｍｍｅ ｔ ｆ ｓ ｄ ｎ ｓ ａ ｏ ｔｔ ｅ ｓ ｆ ａ ｅ ａ ｅ ｉ ｔ ｄ ｃ ｄ ｕｓｄ ｈ ｎ ｔ ａ ｈ ｎ ｆ ｃｓ ｓｎ ｉ ｍｓａ ｃ ｓ ｎ ｏ ｃ ｎｓ ｏ ｔ ｅ ｔ ｂ ｕ ｈ ｏｔ ｒ ｙ ｎｒ ｕ ｅ ． ｕ ｗ ｏ Ｆ ｎ ｌ ，ｔ ｅ ｉ ｅ ｒｆ ｒｈ ｒｕ ｄ ｔ ｎ ｏｌｗ ｎ ｅ ｅｏ ｍｅ ｔ ｆｔ ｉ ｓ ｆ ａ ｅ ｉ ｐ ｏ ｏ ｅ ． ｉａ ｙ ｈ ｄ ａ ｆ ｕ ｔ ｅ ｐ ａｅ ａ ｄ ｆｌ ｉ ｇ ｄ ｖ ｌ ｐ ｎ ｓ ｏｔ ｒ ｓ ｒ ｐ ｓ ｄ ｌ ｏ ｏ ｏ ｈ ｗ
微量蛋白纯化实验报告
实验目的：本实验旨在学习并掌握微量蛋白纯化的基本原理和方法，通过实验操作，实现对目标蛋白的有效提取和纯化，并对其纯度和活性进行初步评估。
实验原理：蛋白质的纯化是基于蛋白质在物理化学性质上的差异，如分子量、电荷、溶解度等，通过不同的分离技术将目标蛋白从复杂混合物中分离出来。
本实验采用离子交换层析和凝胶过滤层析相结合的方法进行微量蛋白纯化。
实验材料：1. 蛋白质样品：细胞裂解液或组织匀浆等。
2. 离子交换层析柱：Sephadex G-25或类似产品。
3. 凝胶过滤层析柱：Sephadex G-75或类似产品。
4. 蛋白质标记物：如考马斯亮蓝G-250等。
5. 试剂：Tris-HCl缓冲液、NaCl、Gel Loading Buffer等。
实验步骤：一、离子交换层析1. 准备样品：将蛋白质样品用Tris-HCl缓冲液（pH 7.4）稀释至适当浓度。
2. 洗柱：用Tris-HCl缓冲液（pH 7.4）平衡离子交换柱，去除柱中杂质。
3. 加样：将稀释后的样品上柱，控制流速，使样品均匀分布在柱床上。
4. 洗脱：用不同浓度的NaCl溶液进行梯度洗脱，收集洗脱液。
5. 分析：取部分洗脱液进行SDS-PAGE电泳，观察目标蛋白的洗脱峰。
二、凝胶过滤层析1. 准备样品：将离子交换层析后的目标蛋白样品用Gel Loading Buffer稀释。
2. 洗柱：用Gel Loading Buffer平衡凝胶过滤柱，去除柱中杂质。
3. 加样：将稀释后的样品上柱，控制流速，使样品均匀分布在柱床上。
4. 洗脱：用Gel Loading Buffer进行洗脱，收集洗脱液。
5. 分析：取部分洗脱液进行SDS-PAGE电泳，观察目标蛋白的洗脱峰。
三、蛋白纯度评估1. 蛋白质标记：取部分纯化后的样品，加入蛋白质标记物，进行比色法或荧光法测定蛋白质浓度。
2. SDS-PAGE电泳：取部分纯化后的样品，进行SDS-PAGE电泳，观察目标蛋白的条带。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
微机模拟蛋白质纯化实验一、实验目的：1. 了解模拟生化干实验的方法和意义，掌握用protein软件提纯蛋白质的方法。
2. 进一步熟悉层析、热变性、盐析等常用生化分离方法的原理和应用。
二、实验原理：“Protein”软件有36个任务，即36组待分离纯化的蛋白。
任务要求利用软件提供的几种实验技术，提纯每一个目的蛋白，最终达到单向电泳一条带，双向电泳一个点，而且使用的人时和经费(根据提取步骤计算得到)不得超过一个特定值。
在每个任务开始时，软件给出目的蛋白的一些性质，如热稳定的温度范围和pH稳定范围等，利用这些信息，可以使实验少走弯路。
“Protein”提供的分离纯化方法有七种：①热变性；②硫铵沉淀；③排阻层析(凝胶色谱)；④离子交换层析；⑤吸附层析；⑥聚焦层析；⑦制备电泳。
在“Protein”所提供的各种分离纯化方法中，热变性法和盐析法是比较好的粗提方法，在提纯的早期使用效果较好。
层析是各种方法中最强有力的方法，制备电泳虽然纯化倍数高，但是回收率低。
在各种层析方法中，又以离子交换层析最为有效和易于使用，并且耗费的人时和经费也较少。
排阻层析和聚焦层析耗费较大，但在某些特定情况下，这两种方法是不可替代的。
“Protein”提供了四种电泳方法：即，SDS-PAGE、PAGE、等电聚焦电泳和双向电泳。
这些电泳方法不但可以用以检测样品的纯度，而且也给出了样品的一些信息，如分子量、等电点等，这些信息对于后续提纯有重要的参考价值，等电聚焦电泳和PAGE还可以用于制备。
本实验要求完成实验软件中三种酶的分离纯化。
三、实验步骤：实验中为了比较在样品性质不同情况下，如何有效分离，以及各种方法的优劣，拟分离如下三种样品：1. pH稳定范围较大的蛋白（Windows 1号酶）2. 酸性条件下稳定的蛋白（Windows 3号酶）3. 碱性条件下稳定的蛋白（Windows 36号酶）1.pH稳定范围较大的蛋白（Windows 1号酶）1号酶在50度下稳定，稳定范围2-11(稳定范围较大)（1）分离纯化步骤：先通过DI－DEM看一下样品的情况：pH3~10，分离胶浓度10％（体积分数），浓缩胶浓度3％（体积分数）由图片可以看出，杂蛋白含量比较少，各种蛋白的Mr和pI相差较大。
A.硫铵沉淀法初始百分饱和度0，终末饱和度50%，收集沉淀B.离子交换层析：填料：DEAE-Sephadex A-50,柱长=10CM，柱内径=2CM；缓冲体系：乙酸-乙酸钠（pH3.6-5.8），pH4.4，流速0.3ml/min；离子强度梯度洗脱：0.01mol/L-0.15mol/L，洗脱体积：300ml。
（如下图）洗脱曲线如下图：由洗脱曲线可以看出，目的酶和杂蛋白有一定的重合，可以通过收集来避免一些杂蛋白的干扰，收集70-95ml的组分，做如下检验。
（2）检测纯化结果：A.二维电泳：pH3-10，分离胶浓度10%（体积分数），浓缩胶浓度3%（体积分数）已达一个点的要求。
B.PAGE 缓冲体系：乙酸-乙酸钠（3.6-5.8），pH=5结果显示一条带，证明纯化效果不错。
再用SDS-PAGE对比一下。
C.SDS-PAGE：分离胶浓度10%（体积分数），浓缩胶浓度3%（体积分数）经检验，发现有两条很近的带，故目的蛋白提纯不够彻底，应对收集到的70-95ml的组分继续用离子交换层析。
（3）第二次离子交换层析：填料DEAE－Sephadex A-50，柱长：10cm，柱内径：2.0cm，缓冲体系：磷酸氢二钠-Citrate（2.2－8.0），pH 4.3，流速：0.3ml/min，离子强度梯度洗脱：0.01mol/L-0.15mol/L，洗脱体积：300ml。
（如下图）洗脱曲线如下：收集10-40ml组分后进行蛋白质纯化检测（4）第二次检测纯化结果：A.二维电泳，pH 3～10，分离胶浓度10％（体积分数），浓缩胶浓度3％（体积分数）已达到一个点的要求。
B.PAGE 缓冲体系：乙酸-乙酸钠（3.6-5.8），pH=5用PAGE检验，已达到一条带的要求，作为对比再用SDS－PAGE检验。
C.SDS-PAGE：分离胶浓度10%（体积分数），浓缩胶浓度3%（体积分数）SDS－PAGE检验结果显示，有一条带。
此次分离效果很好，整体的分离效果比较好，花费较少。
（5）实验结果分析：1号目的酶的Mr约为29000，PI=4.4。
稳定pH 2～11,稳定温度<50℃。
2.酸性条件下稳定的蛋白（Windows 3号酶）3号酶在62℃以下稳定，稳定pH范围3.8～5.8（酸性条件）（1）分离纯化步骤:先通过DI－DEM看一下样品的情况：pH3~10，分离胶浓度10％（体积分数），浓缩胶浓度3％（体积分数）由图片可以看出，杂蛋白含量比较少，各种蛋白的Mr和pI相差较大。
我们可以利用热变性或者是硫铵沉淀的办法进行初提纯处理。
A.热变性：水浴温度61℃，水浴时间60min，可以得到22.162g,99%的酶活力初提取效果很好。
B.硫铵沉淀：初始百分饱和度40％，终末百分饱和度80％(质量分数)，收集沉淀组分。
C.吸附层析：填料Bio-Gel HTP，柱长：35cm，柱内径：2.0cm，缓冲体系：乙酸-乙酸钠（3.6－5.8），pH 5.0，流速：0.3ml/min，离子强度梯度洗脱：0.02mol/L-0.30mol/L，洗脱体积：300ml洗脱曲线如下：由洗脱曲线可以看出，目的酶和杂蛋白有一定的重合，可以通过收集来避免一些杂蛋白的干扰，收集72-96ml的组分，做如下检验。
（2）检测纯化结果：二维电泳：pH3-10，分离胶浓度10%（体积分数），浓缩胶浓度3%（体积分数）出现两个点，不符合要求，进行凝胶层析分析。
（3）凝胶层析：填料Sephadex G-75，柱长：100cm，柱内径：2.0cm，缓冲体系：磷酸氢二钠-Citrate（2.2－8.0）pH 5.6，浓度0.02mol/L，流速：0.3ml/min，洗脱曲线如下收集290-340ml的组分，做如下检验。
（4）第二次进行蛋白纯化检验：A.二维电泳：pH3-10，分离胶浓度10%（体积分数），浓缩胶浓度3%（体积分数）已达到一个点的要求。
B.PAGE 缓冲体系：分离胶浓度10％（体积分数），浓缩胶浓度3％（体积分数），缓冲体系：磷酸二氢钾-NaOH，pH 8.0用PAGE检验，已达到一条带的要求，作为对比再用SDS－PAGE检验。
C.SDS-PAGE：分离胶浓度20%（体积分数），浓缩胶浓度3%（体积分数）已达到一条带的要求，此次分离效果很好，整体的分离效果比较好，花费较少。
（5）结果分析：3号蛋白Mr约为6800，p I=6.0，稳定pH 3.8～5.8,稳定温度<62℃。
3.碱性条件下稳定的蛋白（Windows 36号酶）36号酶在31度下稳定，稳定pH范围7.7-10（1）分离纯化步骤：先通过DI－DEM看一下样品的情况：pH3~10，分离胶浓度10％（体积分数），浓缩胶浓度3％（体积分数）由图片得知，蛋白比较杂，在pH7.2-10这个范围内，蛋白质的分子量差异较大，比较分散。
目的酶的温度比较低，故不用热变性法，在用硫铵沉淀法后发现对杂蛋白的分离效果不大，所以直接用细分离。
A.吸附色谱填料：氧化铝，柱长=35CM，直径=2CM；缓冲体系：Gly-NaOH（pH8.6-10.6），pH8.6。
洗脱曲线如下：由洗脱曲线可以看出，目的酶和杂蛋白有一定的重合，可以通过收集来避免一些杂蛋白的干扰，收集210-280ml的组分，做如下检验。
（2）蛋白纯化检验：发现各种蛋白的Mr和pH差异比较大，用凝胶过滤层析和离子交换层析都可以。
（3）第二次分离纯化：离子交换层析：填料：DEAE-Sephadex A-50,柱长=10CM，柱内径=2CM；缓冲体系：Gly-NaOH（pH8.6-10.6），pH=8.6，流速0.3ml/min；离子强度梯度洗脱：0.01mol/L-0.15mol/L，洗脱体积：300ml。
（如下图）洗脱曲线如下：由洗脱曲线可以看出，目的酶和杂蛋白有一定的重合，可以通过收集来避免一些杂蛋白的干扰，收集70-100ml的组分，做如下检验。
（4）第二次蛋白纯化检验：A.二维电泳：pH3-10，分离胶浓度10%（体积分数），浓缩胶浓度3%（体积分数）已达到一个点的要求。
B.PAGE 缓冲体系：Gly-NaOH（pH8.6-10.6），pH8.6。
由图可以看出，除了目的蛋白的条带外，在它上面还有一条浅浅的带，杂蛋白未除尽。
由杂蛋白和目的蛋白条带的接近程度可大致得出，杂蛋白和目的蛋白的PI接近。
作为对比再用SDS-PAGE 检测一下。
C.SDS-PAGE：分离胶浓度10%（体积分数），浓缩胶浓度3%（体积分数）结果显示，只有一条清晰的带。
二维电泳一条带，PAGE虽两条带，不过杂蛋白的量很少，条带不明显。
如果接下来的实验对蛋白纯度要求不是特别高，达到上述纯度即可。
（5）实验结果分析：36号目的酶的Mr约为30800，PI=8.4。
稳定pH 7.7～10,稳定温度<31℃。
实验小结：这次实验的情况让我了解了各种蛋白质的相关性质的测定方法，同时也了解到了相关的方法的一些具体的操作过程，学到了很多书本上没有的知识。
实验的结果整体比较令人满意，用的相关步骤也是比较简单省钱的，所以效果比较好！不过还是有些遗憾就是第三个在等点检测和PAGE 检测的时候是出现了两条带，说明自己还有很多的不足需要进一步的学习！。