生物化学技术原理与应用全套课件443p

生物化学技术原理及应用
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第一章 生命大分子物质的制备
第一节 材料的选择与处理 第二节 确定测定方法 第三节 细胞的破碎 第四节 抽提 第五节 浓缩 第六节 纯化方案的设计与评价 第七节 有效成分纯度和性质的分析 第八节 应用实例
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一、材料的选择
有效成分：指欲纯化的某种单一的生命 大分子物质。有效成分具有含量少和稳定 性差的特性。
蛋白质的巯基还能与源于缓冲液金属离子铅、 铁、铜作用，产生沉淀。解决办法： 无离子水配制缓冲液 加入1-3mM EDTA
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第五节 浓缩
一.沉淀法 二.吸附法 三.超过滤法 四.透析法 五.减压蒸馏法 六.冰冻干燥法
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一.沉淀法 抽提液中加入适量的中性盐如硫酸氨或 有机溶剂,使有效成分沉淀，离心除去不 溶物，获得上清透析或层析柱去盐。
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6.氧化
一般蛋白质或酶含有必需集团巯基，若抽提液 中存在氧化剂或氧分子时，会使巯基形成分子内或 分子间二硫键，导致蛋白质变性。为此，常加入2巯基乙醇、半胱氨酸还原剂。
植物组织和微生物细胞中含酚类物质，在多酚氧化 酶作用下，可变为有色的醌类物质。加入苯基硫脲， 可抑制这一反应。
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7.金属离子
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二.纯化方案的评价 考察比活力、纯化倍数和收得率
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第二编 纯化方法
第二章 沉淀法 第三章 吸附层析 第四章 疏水层析 第五章 离子交换层析 第六章 凝胶过滤 第七章 亲和层析 第八章 聚焦层析 第九章 高效液相色谱 第十章 固定化的酶与微生物
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第二章 沉淀法
第一节 基本原理与沉淀类型 第二节 应用实例
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5.生物传感器 用生物传感器中的敏感膜与待测物质反
应，可通过显示器反映有效成分的含量。
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loge loge1
loge2
lmax1
lmax2
l/nm
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第三节 细胞的破碎
1.物理方法 2.化学处理 3.生物方法
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1.物理方法
（1）研磨法：研钵，匀浆器 （2）捣碎法：捣碎器 （3）超声波法：超声仪 （4）压榨法:挤压 （5）冻融法：低温冷冻迅速取出
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2、植物组织： (1)叶片：水洗净或在10小时内置零下4 ℃
到零下30 ℃冰箱贮藏备用; (2)种子：泡胀或粉碎。
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3、微生物： (1)胞内活性分子：离心法收集上清液，低温 下短时间贮存; (2)胞外活性分子：经破细胞膜处理后提取， 制成冻干粉。
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第二节 确定测定方法
一、目的和要求 二、常用的测定方法
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2.ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ化学法 有些反应可放出质子氢，可用PH计或
NaOH滴定等方法追踪变化计算出待测物的 含量。
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3.生物活性检测法 细胞或动物摄入待测物质后，待测物质
摄入量与细胞或动物的生理指标变化有相 关性，以此检测待测物质含量。
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4.免疫分析法 利用抗原与抗体的特异性反应，并结合
生物标记，可对待测物质进行定量定性分 析。
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二.吸附法 干葡聚糖凝胶G25或吸水棒加入抽提液， 两者比例一比五，能缩小抽提液体积三 倍左右.
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三.超过滤法 在空气或氮气压力下，使小分子物质通 过半透膜而大分子物质留在膜内的装置。
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四. 透析法 （1）把装透析液的透析袋埋在吸水力强的
聚乙二醇PEG或甘油中； （2）真空透析。
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五.减压蒸馏法 简易减压蒸馏装置（降低沸点）.
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二.抽提有效成分的影响因子
1.PH值 2.溶剂的极性和离子强度 3.水解酶 4.温度：选择合适的抽提温度 5.搅拌：温和搅拌可增加溶解度 6.氧化 7.金属离子 8.抽提液与抽提物的比例:1:5
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1.PH值 对蛋白质或酶等具有等电点的两性电
解质物质，选择抽提液的PH值在偏离等电 点。
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2.溶剂的极性和离子强度
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(2)荧光光谱法(fluo-spectrophotometry) 激发光激发待测物质发射发射光，读取
荧光强度。荧光强度与待测物质浓度成正 比。荧光光谱法的精确性、重复性和灵敏 度比吸收光谱法好。例如：乙醇中蒽的测定。
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(3)浊度法 极稀的悬浮液采用此法，测定悬浮液在
不被吸收的波长下表现的消光值。
材料选择原则(1)含量多、稳定性好； (2)来源丰富、保持新鲜； (3)工艺简单、有利用价值。
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二、材料的处理
1、动物脏器： (1)冰冻：短时间零下10℃冰库或零下70 ℃ 低温冰箱（数月）贮存； (2)脱脂：人工剥离；有机溶剂；快冷快热； 脂肪分离器； (3)干燥：丙酮中脱水；沸水中蒸煮烘干。
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六. 冰冻干燥法 冰冻的抽提液在真空状态下，可由固体
直接变为气体。
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第六节 纯化方案的设计与评价
一.纯化方案的设计 二.纯化方案的评价
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一. 纯化方案的设计 纯化的总原则：考虑抽提液中有效成分与
杂质的理化性质差异，几种方法组成一个 科学合理的纯化方案 切忌：一种方法重复使用
有些蛋白质或酶在极性大、离子强度大的溶液 中稳定，有些则相反
加入蔗糖、甘油、DMSO降低溶液极性 加入KCL、NaCL、NH4CL升高溶液离子强度
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3.水解酶 为防止酶与欲抽提的蛋白质或核酸发生
反应，采取以下措施： (1)加入PMSF等酶抑制剂； (2)调节抽提液的极性、离子强度和PH值。
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2.化学处理
（1）脂溶性溶剂：丙酮；氯仿；甲苯 （2）表面活性剂：十二烷甲基黄酸钠；十
二烷基硫酸钠
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3.生物方法
（1）溶胀 （2）自溶 （3）生物酶降解：溶菌酶；蛋白水解酶K
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第四节 抽提
一.抽提的含义 二.抽提有效成分的影响因子
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一、抽提的含义
用适当的溶剂和方法，从原料中把 有效成分分离出来的过程。用缓冲液， 稀酸，稀碱或有机溶剂（丙酮，乙醇） 等抽提，有时还可以用蒸馏水抽提。
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一、目的和要求
确定的方法简单、灵敏、需时少、专一性
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二、常用的测定方法
1.光谱法 (1)吸收光谱法（absorption spectrophotometry)
①直接测定法：将待测物配制成一定浓度的溶液 移至分光光度计，读取吸光度。吸光度与待测物 浓度成正比。例如：总蛋白含量的测定。 ②比色法（间接法）：将待测物与相关试剂或酶的 底物作用后，移至分光光度计，读取吸光度。例如： 酶活性的测定。