枯草杆菌蛋白酶活力测定
蛋白酶酶活测定方法及原理简介
蛋白酶酶活测定方法及原理Protease activity assay method and principle 方法原理福林酚法福林-酚试剂在碱性条件下可被酚类化合物还原呈蓝色钼蓝和钨蓝混合物，而蛋白质分子中有含酚基的氨基酸如酪氨酸、色氨酸等，可使蛋白质及其水解产物呈上述反应，利用此原理测定蛋白酶酶活。
考马斯亮蓝法考马斯亮蓝染料与蛋白质在酸性条件下结合，主要是染料与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合，使染料的最大吸收峰的位置由465nm变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色，在595nm下测定的吸光度值A595，与蛋白质浓度成正比。
甲醛滴定法蛋白酶催化蛋白质水解成氨基酸，再用甲醛固定氨基酸的氨基，用0.1mol/LNaOH溶液滴定生成的氨基酸，从而测定其酶活。
DHT-酪蛋白法用5-氨基四唑重氮盐将氨基酸中部分组氨酸和酪氨酸重氮化，得到黄色的重氮5-氨基四唑酪蛋白（DHT-酪蛋白）。
以DHT-酪蛋白为底物，在蛋白酶作用下，水解生成DHT-肽，二价离子可与DHT-蛋白与DHT-肽形成稳定的可溶性红色螯合物，而锌离子可迅速沉淀DHT-酪蛋白，但不沉淀DHT-肽。
选用合适浓度的锌离子和镍离子作为沉淀剂和显色剂，利用比色法可测定蛋白酶酶活。
DNA-溴乙锭荧光分析法溴乙锭插入双链DNA的碱基对之间时，可使DNA的荧光增加25倍。
接近饱和的溴乙锭(0.5µg/mL) 与DNA 混合时，其荧光增加量与DNA的浓度呈正比。
在DNA-组蛋白-溴乙锭溶液中加入蛋白酶时，蛋白酶水解结合在DNA链上的组蛋白，使DNA 结合部位暴露出来，溴乙锭重新插入DNA双链中，荧光增加量与蛋白酶活性呈正比。
通过测定DNA溶液的荧光增量来计算蛋白酶的活性。
X-光胶片法酶的底物明胶涂抹在X-光胶片上，当待测酶液滴加到X-光胶片上时，酶将X-光胶片上的明胶水解，用水冲洗胶片，即可看到胶片上明胶被酶水解的地方，出现透明的圆圈。
蛋白酶活性的测定方法
蛋白酶活性的测定方法(GB/T23527-2009)1 原理蛋白酶对酪蛋白、乳清蛋白、谷物蛋白等都有很好的水解作用。
磷钨酸和磷钼酸混合试剂，即福林-酚试剂，碱性条件下极不稳定，易被酚类化合物还原而呈蓝色反应（钨兰和钨兰混合物）。
由于蛋白质中含有具有酚基的氨基酸（酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸），因此，蛋白质及其水解产物也呈此反应。
利用蛋白酶分解酪素（底物）生成含酚基氨基酸的呈色反应，来间接测定蛋白酶的活力。
2 仪器和设备2.1 分析天平：精度0.0001g2.2 恒温水浴：精度±0.2℃2.3 计时表2.4 分光光度计2.5 沸水浴器2.6 振荡混合器2.7 pH计: 精度0.01pH单位3 试剂和溶液3.1 乳酸缓冲液（pH=3.0）适用于酸性蛋白酶甲液：称取乳酸（80%-90%）10.6g,加水溶解并定容至1000ml。
乙液：称取乳酸钠（70%）16g,加水溶解并定容至1000ml.使用溶液：取甲液8ml,加乙液1ml,摇匀，稀释一倍，即成0.05mol/L乳酸缓冲溶液。
3.2 磷酸缓冲液的制备（pH=7.5）适用于中性蛋白酶准确称取磷酸氢二钠（Na2HPO3.12H2O）6.02和磷酸二氢钠（NaH2PO3.2H2O）0.5g,加水定容至1000ml3.3 硼酸缓冲液(pH=10.5) 适用于碱性蛋白酶甲液：称取硼酸钠19.08g,加水溶解并定容至1000ml。
乙液：称取氢氧化钠4.0g,加水溶解并定容至1000ml.使用溶液：取甲液500ml,加乙液400ml,摇匀，用水稀释至1L。
3.4 0.4mol/L碳酸钠溶液：准确称取无水碳酸钠42.4g,以蒸馏水溶解定溶至1000ml.3.5 0.4mol/L的三氯醋酸液：准确称取65.4三氯醋酸,以蒸馏水溶解定溶至1000ml3.6 0.5mol/L的NaOH：准确称取2g NaOH溶解并定至100ml3.7 10.00mg/ml酪素溶液称取酪素1.000g,准确至0.001g,用少量的0.5mol/L的氢氧化钠溶液(若为酸性蛋白酶则用浓乳酸2-3滴)润湿,,加入适量的各适宜的缓冲液约80ml,在沸水浴中边加热边搅拌,直至完全溶解,冷却后,转入100ml容量瓶中,用适宜的缓冲液稀释至刻度,此溶液在冰箱内贮存,有效期为三天.3.8 100μg/ml酪氨酸标准溶液3.8.1 准确称取预先于105℃干燥至恒重的L-酪氨酸0.1000g ,用1mol/L 的盐酸60ml 溶解后定容至100ml,即为1.00mg/ml的酪氨酸溶液.3.8.2 吸取1.00mg/ml酪氨酸标准溶液10.00ml,用0.1mol/L盐酸定容至100ml,即得100.0μg/ml L-酪氨酸标准溶液.3.9 酶样的制备准确称取1.000g固体酶或移取1ml液体酶样，用少量的适宜缓冲液溶解并用玻璃棒捣研,然后将上清液倒入100ml容量瓶,沉渣中再添入少量缓冲液捣研多次,最后全部移入容量瓶,稀释到刻度,用四层纱布过滤。
枯草杆菌蛋白酶新食品原料-概述说明以及解释
枯草杆菌蛋白酶新食品原料-概述说明以及解释1.引言1.1 概述概述部分的内容：枯草杆菌蛋白酶是一种在生物界广泛存在的一类酶，具有很强的蛋白质降解能力。
随着食品工业的发展和消费者对食品质量的要求不断提高，寻找新的食品原料和改进传统食品工艺的需求也越来越迫切。
而枯草杆菌蛋白酶作为一种新型的食品原料，具有其独特的优势和开发潜力。
首先，枯草杆菌蛋白酶具有较高的蛋白质降解效率。
它能够分解多种蛋白质，包括动物蛋白、植物蛋白等，从而使得蛋白质得到更好地利用。
这使得枯草杆菌蛋白酶成为一种理想的原料用于提取和改进传统食品中的蛋白质组分。
其次，枯草杆菌蛋白酶具有较好的稳定性和耐高温特性。
这一特点使得枯草杆菌蛋白酶可以在高温条件下进行工艺加工，不易被破坏和失活。
这意味着枯草杆菌蛋白酶可以应用于热加工食品，如肉类制品、面包等，为其提供更好的蛋白质增值效果。
另外，枯草杆菌蛋白酶还具有一定的生物活性和功能性。
它可以改善食品的口感和风味，增加其营养价值，并具有较好的保健功能。
这使得枯草杆菌蛋白酶成为一种具有较好市场前景和应用价值的新型食品原料。
综上所述，枯草杆菌蛋白酶作为一种新食品原料，具有其独特的优势和潜力。
它的应用可以改善传统食品的质量，提高蛋白质的利用率，并且具有一定的生物活性和保健功能。
因此，研究和开发枯草杆菌蛋白酶作为新食品原料的前景非常广阔，并值得进一步探索和发展。
1.2 文章结构文章结构部分主要是介绍本篇文章的整体结构和各个章节的内容概述。
本文主要分为引言、正文和结论三个部分。
在引言部分，首先会对枯草杆菌蛋白酶新食品原料进行概述，介绍其定义和特性。
接着会说明本文的目的，即探讨枯草杆菌蛋白酶作为新食品原料的潜在价值和前景。
正文部分将进一步展开讨论。
首先会详细介绍枯草杆菌蛋白酶的定义与特性，包括其结构、功能和生物学特性等方面的内容。
其次会探讨枯草杆菌蛋白酶在不同领域的应用，如医药、食品、环境等方面，并列举相关的研究成果和应用案例。
蛋白酶K酶活力及杂质检测方法
蛋白酶K酶活力及杂质检测方法编制说明（征求意见稿）一、任务来源本国家标准的制定任务列入国家标准化管理委员会《二О一五年国家标准制修订项目》，项目编号“20154061-T—424”.本项任务由中国标准化研究院提出并归口，定于2016年完成。
本标准起草工作组由中国标准化研究院、河北农业大学、浙江工商大学等单位共同组成。
二、目的及意义丝氨酸蛋白酶是一类裂解肽键的蛋白酶，其活性中心的亲和氨基酸为丝氨酸，它们在生物有机体中起着重要而广泛的生理作用。
丝氨酸蛋白酶超家族被分为胰蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶两个大家族，蛋白酶K（EC 3。
4.21。
14）属于枯草杆菌蛋白酶家族，是由林伯氏白色念球菌（Tritirachium album Limber）产生的一类主要蛋白酶。
因其能消化角蛋白（keratin)，故将其称作蛋白酶K。
蛋白酶K拥有典型的丝氨酸活性位点：Asp39-His69-Ser224。
蛋白酶K具有稳定的结构、极高的酶活力和广泛的底物特异性，但偏好于带有脂肪族及芳香烃的肽链，能优先分解与疏水性氨基酸、含硫氨基酸、芳香族氨基酸羧基端连接的肽键，因而被广泛应用于工业、农业和科学研究领域，也因此吸引了来自学术界、工业和农业团体的研究兴趣.基因工程技术的发展依赖于生物技术用的一些酶类，这些酶对与基因工程技术的作用,就如同CPU对与电脑的重要性一样，它们是现代生物技术产业中用于研究和开发基因工程产品和分子生物学研究的最基础物质。
如果我国没有独立的生物技术用酶的生产体系，就不会有独立的现代化生物技术产业.作为一个大国，我国应该建立自主的蛋白酶K生产体系,以适应生物产业的快速发展.在政府监管中,标准的重要价值在于它架起了法律与科学之间的桥梁，提高了行政决定过程的公开性与结果的准确性,为规范和控制行政裁量权提供了工具。
目前我国在诚信制度没有健全、存在巨大经济利益诱惑的情况下，对于生物产业的监督，政府主管部门才是最有公信力和最能承担责任的。
实验七 枯草杆菌蛋白酶活力的测定
实验七枯草杆菌蛋白酶活力的测定1、实验目的1.1、学习枯草杆菌蛋白酶的特性与酶活力的测定方法。
2、实验原理枯草杆菌蛋白酶是一种广泛存在于自然界中的蛋白水解酶，可水解多肽链中的相邻两个氨基酸之间的肽键，产生较短的肽段或氨基酸。
其它一些蛋白酶也能具有相同的作用。
但是，枯草杆菌蛋白酶具有易纯化的特点，常常被作为分子生物学的工具酶。
在酶的结构上，它是一种分子量较小（约28kD）、在非酸性条件下稳定的蛋白水解酶。
由于枯草杆菌蛋白酶活性高，反应速度快，且易于检测，成为重要的酶类试剂。
2.2.1、测定方法（1）取适量枯草杆菌蛋白酶试剂（BOC-L-Lysine-Suubstrate）4mg，用0.2ml水溶解后放入1个涡轮管中。
（2）加入GBS缓冲液（1M），调至最终体积1ml，并混匀。
（3）在25℃下孵育30分钟。
（4）加入0.25ml的5%TCA沉淀10分钟，离心收集上清。
（5）加入0.5ml的Ninhydrin溶液，在90℃水浴中加热10分钟，观察溶液是否变紫色。
在此条件下，Ninhydrin会选择性地反应羧基，生成紫色产物。
若产物变紫，则为阳性，代表有生成的穿孔宰和组合。
2.2.2、单位定义在Oliver和Abeles的标准下，1个单位（U）的枯草杆菌蛋白酶活力指酶水解1摩尔的Boc-L-Lysine-Suubstrate，并且产生1摩尔L-lysine-amines的反应物（1个摩尔的缀氨酸）的速率。
2.2.3、酶活力计算（1）计算单位活力单位活力（U/ml）=（吸光度测定值/光程）×试剂体积/过程时间×稀释倍数酶活力（Unit/mg）=单位活力（Unit/ml）/酶试剂的蛋白质含量（mg/ml）3、实验操作3.1、实验材料3.3、数据处理4、实验结果4.1、测定数据记录表假设吸光度值为0.2，光程为1cm，试剂体积为1ml，过程时间为30分钟，稀释倍数为10，则单位活力（U/ml）=（0.2/1）×1/（30×60）×10=5.5×10^-5U/ml假设酶试剂的蛋白质含量为2mg/ml，则酶活力（Unit/mg）=5.5×10^-5U/ml ÷ 2mg/ml = 2.75×10^-5Unit/mg5、实验注意事项（1）枯草杆菌蛋白酶试剂为强酸性试剂，使用时应注意安全，防止灼伤或损伤。
实验六 枯草杆菌蛋白酶活力的测定
实验六枯草杆菌蛋白酶活力的测定【实验目的】1. 观察并理解酶催化反应的基本规律。
2. 掌握枯草杆菌蛋白酶的基本性质及其测定方法。
3. 加深对酶底物浓度、酶浓度、温度、pH值等因素对酶活力影响的认识。
枯草杆菌蛋白酶是一种胃蛋白酶（pepsin）类酶，广泛存在于动物消化系统中。
它能水解蛋白质，对胃中蛋白质进行初步消化。
在实验中，我们可以通过枯草杆菌蛋白酶对蛋白质分子的水解作用来研究酶活力。
当枯草杆菌蛋白酶与底物蛋白质缓慢接触时，底物分子与酶分子结合，形成酶底物复合物。
酶通过水解底物的化学反应将底物分子分解成较小的肽链分子，最终生成氨基酸。
酶在每一次反应中保持不变，只有底物分子在反应过程中逐渐减少。
酶活力的测定基于酶对底物的水解能力。
实验中通过测定酶对底物的水解速度，进而推算出酶活力。
1. 枯草杆菌蛋白酶（Pepstatin；Sigma-Aldrich公司）2. BSA3. pH 2.0、pH4.0及 pH 6.0 缓冲液（各 100 mM）4. 显色剂 1%酸性比色液5. 离心管、酒精灯、1.5 mL离心管、定量移液器6. 紫外分光光度计1. 准备酶底物混合液将100 mg的BSA加入到10 mL的pH 2.0缓冲液中，经过充分溶解得到BSA 10 mg/mL 的底物混合液。
2. 准备不同浓度的酶测定溶液从枯草杆菌蛋白酶购买的酶粉中取出适量加入pH 2.0缓冲液中，加入一定比例的甘油制成10mg/mL 的酶浓度溶液。
通过逐步稀释酶液，制成0.01、0.03、0.05、0.07和0.1 mg/mL约 5 个不同浓度的酶测定溶液。
3. 测定酶活力将pH 6.0缓冲液从20 mL的烧杯中吸取3 mL加入每个1.5 mL离心管中标记成A、B、C、D、E。
向其中的 A 离心管中加入 0.4 mL 的酶浓度溶液, 加入X μL底物混合液赋为0.2，摇晃并放置于37℃浸泡水浴中，在不同时间点取出 0.2mL混合物分别放入另一组题号相同但无加酶的 1.5 mL 离心管中：底物控制酶底物反应液加等体积 pH6.0缓冲液停反应相同时间混合混合20minA0B0B1B2B3B4将反应液在 30度下水浴，10min 后放入 UV–3600 UV-VIS spectrophotometer测定比色后液体的吸光度。
蛋白酶活力测定方法
蛋白酶活力测定方法酸性蛋白酶产品概述:蛋白质由氨基酸组成，是自然界中发现的最复杂的有机化合物之一。
由盐酸和蛋白酶分解成易被高等动物的肠道和微生物有机体的细胞膜吸收的氨基酸。
包括人类在内的每种动物，必须要有足够的蛋白质来维持自身生长，来生成每个细胞所必需的氨基酸，一些特种蛋白质还是某些特殊细胞、腺体分泌物、酶和激素的功能性组成元素。
蛋白酶是指一些有催化功能的酶，能够水解（断裂）蛋白质，因此也被称为蛋白水解酶。
蛋白水解酶在许多的生理和病理过程中发挥着重要作用，在食品和乳品加工业也有着广泛应用。
工作机理蛋白水解酶制剂本产品能在酸性条件下水解蛋白质食品中的缩氨酸键，释放氨基酸或者多肽。
在酒精、葡萄酒、果汁、啤酒、黄油和酱油生产中，添加酸性蛋白酶可澄清发酵液中的雾气。
酵母在发酵阶段的生长可以通过悬浮蛋白质转化的氨基酸来加以促进，从而加速发酵并提高产量。
本产品是一种酸性蛋白酶制剂，在酸性条件下具有较高活性，由酸性蛋白酶高产菌株——曲霉菌深层发酵而成。
它广泛应用于饲料、纺织、废水处理和果汁提纯方面。
酸性蛋白酶（Acid protease ）是指蛋白酶具有较低的最适pH，而不是指酸性基团存在于酶的活性部位，酸性蛋白酶的最适PH从2左右（胃蛋白酶）到4左右。
从酶的活力-PH曲线分析，在酶的活性部位中含有一个或更多的羟基。
这一类蛋白酶中研究最彻底的是胃蛋白酶。
（酸性蛋白酶537容易失活）简介：酸性蛋白酶是由隆科特黑曲霉优良菌种经发酵精制提炼而成，它能在低PH条件下，有效水解蛋白质，广泛应用于酒精、白酒、啤酒、酿造、食品加工、饲料添加、皮革加工等行业。
1、产品规格：，规格有5万u/g～10万u/g液体型为黑褐色液体，规格有50000u/ml～10000u/ml.2、酶活力定义：一个酶活力单位是1g酶粉或1ml酶液在40℃，PH3.0条件下，1分钟水解酪素产生1ug酪氨酸为一个酶活力单位（u/g或u/ml）特性1、温度范围为：最适温度范围为40℃-50℃2、PH为：最适PH范围为2.5～3.5使用方法1、白酒工业：本品用以淀粉为原料的生产酒精及白酒行业，提高出酒率0.25%个酒分，提高发酵速度。
实验六 枯草杆菌蛋白酶活力的测定
(先打开水浴锅,温度设置成40摄氏度) 一、实验目的 二、实验原理 三、器材仪器和主要试剂 四、实验操作 五、思考题
一、实验目的
掌握定量测定蛋白酶活性的方法，了解本实验 的酶、底物和生成物的相关性质，以及本反应 的环境条件。
进一步理解酶活力和比活力的概念 巩固比色法测定物质含量的基础,掌握721型分
因。 如何保证本实验测定数据的准确性？ 值日第六组
A 样 ：样品液光吸收值； A 对 ：对照液光吸收值； K ：标准曲线上光吸收为 1 时的酪氨酸微克数； t ：酶促反应的时间（分），本实验 t =10 ； V ：酶促反应管的总体积（毫升数），本实验 V =6 ； N ：本次实验酶液的稀释倍数:2000
五、思考题
酶的试验为何设对照又要设空白 稀释的酶溶液是否可长期使用？说明原
光光度计的原理和使用方法,学习绘制标准曲线 的方法
二、实验原理
1．酶活力概念: 指专一性催化某种底物反应的能力，酶活力通常用一定条 件下酶催化某种反应的反应速度来表示. 活力单位(国际单位IU,katal)
2.枯草杆菌蛋白酶是一种水解酶，它将酪蛋白水解成酪氨酸 等物质。
酪氨酸能与酚试剂反应成蓝色物质. 酚试剂又名Folin试剂，是磷钨酸和磷钼酸的混合物，它在碱性条件
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40℃水 浴准确 保温10 分钟
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3
三氯 酪蛋白 40℃水浴保
醋酸 （ml） 温10分钟，
（ml）
过滤得滤液
3
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------
2
胰酶活力单位定义：
规定在 40 ℃ ， pH7.5 的条件下，水解酪蛋白每分钟 产生酪氨酸 1 微克为一个酶活力单位。1g 蛋白酶在 37 ℃ ， pH7.5 的条件下所具备的总活力单位为： （ A 样 — A 对 ）× K × V/t × N
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教学目的、要求（例如识记、理解、简单应用、综合应用等层次）：
在了解酶反应的基本条件、比色法测定物质含量的基础上，将这些知识运用到本实验中。
掌握定量测定蛋白酶的活性的方法，了解本实验的酶、底物和生成物的相关性质，以及本反应的环境条件。
教学内容（包括基本内容、重点、难点）：
一原理
1，枯草杆菌蛋白酶是一种水解酶，它能将酪蛋白水解成酪氨酸等物质。
2，所生成的酪氨酸能与酚试剂反应成蓝色物质，此物质蓝色的深浅与酪氨酸的含量成比
3，用分光光度计可以定量的比较颜色的深浅，从而推导出酪氨酸的量，根据生成物的含量可以计算枯草杆菌蛋白酶的活力。
二，操作：
标准曲线的制作。
设定不同标准浓度的酪氨酸，与酚试剂反应，来衡量生成颜色的深浅与酪氨酸浓度的关系。
标准酪氨酸的浓度为0μg/ml，10μg/ml,20μg/ml,30μg/ml,40μg/ml,50μg/ml,60μg/ml等，反应温度是30℃，反应时间为15分钟，然后测定OD680nm
根据浓度和OD680做出浓度曲线
酶活力测定
样品管，按照酶的反应条件配制反应试剂，让蛋白酶充分的作用，然后取生成物的滤液与酚试剂反应，测定OD680
样品对照管，操作和样品管的操作大致一样，仅仅是在酶反应前将酶用三氯乙酸处理
空白对照管，将以上两种的滤液用蒸馏水代替，让它与酚试剂反应
酶的活力的计算
酶活力单位：在30℃、pH7.5条件下，水解酪蛋白每分钟产生酪氨酸1μg为一个酶的活力单位。
样品管含量，要减去样品对照管和空白管，然后再利用标准曲线，查出相应的酪氨酸的量根据酪氨酸的量，即可以计算出枯草杆菌蛋白酶活力
重点：1，测定酶的活力
2，不同类型对照的设置
难点：1，蓝色物质与酶活力的关系
2，几个类型的对照实验
教学过程设计（要求阐明对教学基本内容的展开及教学方法与手段的应用、讨论、作业布置）：
从酶的性质、底物的性质以及反应条件出发，引出生成物——酪氨酸，然后酪氨酸与酚试剂反应可以生成蓝色物质，而蓝物质的深浅与酪氨酸含量成正比，所以可以用比色法测定酪氨酸的含量。
再一次讲述比色法测定物质含量的原理以及注意事项。
讲述不同类型的对照管的设置要求。
引导学生谈论为什么要设置对照管以及它们对实验的影响。
参考资料（含参考书、文献等）：
王镜岩等，生物化学，高等教育出版社，2001
李建武等，生物化学实验原理和方法，北京大学出版社，2002
赵赣等，生物化学实验指导，江西和学技术出版社，2000
（参考：）生物秀：
一、实验目的
1.加深了解酶活力的概念。
2.学习掌握测定蛋白酶活力的方法。
二、实验原理
酶活力指酶催化某一特定反应的能力。
其大小可用在一定条件下酶催化反应进行一定时间后，反应体系中底物的减少量或产物的生成量来表示。
酶活力单位是表示酶活力大小的重要指标。
本实验规定酶活力单位(U)为一定条件下每分钟分解1μg 酪氨酸所需的酶量。
实验选用枯草杆菌蛋白酶水解酪蛋白产生酪氨酸的反应体系。
产物酪氨酸在碱性条件下与Folin-酚试剂反应生成蓝色化合物，该蓝色化合物在680nm 处有最大光吸收，其吸光值与酪氨酸含量呈正比。
因此通过测定一定条件下产物酪氨酸的含量变化，可计算出蛋白酶的活力。
三、仪器和试剂
仪器:
恒温水浴锅、分光光度计、试管及试管架、干燥滤纸、玻璃漏斗。
原料
枯草杆菌蛋白酶：称取1g 枯草杆菌蛋白酶粉，用少量0.02mol/L，pH7.5磷酸缓冲液溶解并定容至100mL，震荡15分钟，使充分溶解，干纱布过滤，取滤液冰箱备用。
使用时视酶活力高低用缓冲液适当稀释。
试剂
1. Folin-酚试剂：
在2L 磨口回流瓶中加入钨酸钠(Na2WoO4 . 2H2O)100g，钼酸钠(Na2WoO4 . 2H2O)25g，蒸馏水700mL，85%磷酸50mL 以及浓盐酸100mL，充分混匀后，微火回流加热10小时。
再加入硫酸锂150g，蒸馏水50mL 和液溴数滴，摇匀后开口继续煮沸15min，以驱赶过剩的溴。
冷却后加蒸馏水定容至1000mL，过滤，溶液呈黄绿色，置于棕色试剂瓶中暗处贮藏。
使用前用标准NaOH 溶液、酚酞为指示剂标定酸度(约为2mol/L)，然后加水稀释至1mol/L，即可使用。
2. 0.2mol/L 盐酸溶液
3. 0.04mol/L 氢氧化钠溶液
4. 0.55mol/L 碳酸钠溶液
5. 10%三氯乙酸溶液
6. 0.02mol/LpH
7.5磷酸缓冲液：
称取磷酸氢二钠(Na2HPO4 . 12H2O)7.16g，用水定容至100mL(A 液)；称取磷酸二氢钠(Na2HPO4.12H2O)3.12g，用水定容至100mL(B 液)。
取A 液84mL，B 液16mL 混合后，得到0.2mol/LpH7.5磷酸缓冲液，可长期存放。
临用时稀释10倍即可。
7. 标准酪氨酸溶液(50μg/mL)：称取12.5mg 以烘干至恒重的酪氨酸，用0.2mol/L 盐酸约30mL 溶解后，蒸馏水定容至250mL。
8. 酪蛋白溶液(0.5%)：称取1.25g 酪蛋白，用0.04mol/L 氢氧化钠溶液(20mL)溶解，再用0.02mol/LpH7.5磷酸缓冲液定容到250mL。
四、操作步骤
(一)酪氨酸标准曲线的制作
取6支试管(标号0，1~5)，按顺序分别加入0.00，0.20，0.40，0.60，0.80和1.00mL 标准酪氨酸溶液，再用水补足到1.00mL，摇匀后各加入0.55mol/L 碳酸钠5.0mL，摇匀。
依次加入Folin—酚试剂1.00mL，摇匀并计时，于30℃水浴锅中保温15min。
然后680nm 处测定吸光值(以0号管作对照)。
以酪氨酸含量(μg)作横坐标，吸光值为纵坐标绘制标准曲线。
(二)酶活力测定
1.酶反应：取一支试管，加入
2.0mL0.5%的酪蛋白溶液，于30℃水浴中预热5分钟，再加入1.0mL已预热好的枯草杆菌蛋白酶液，立即计时，水浴中准确保温10min，从水浴中取出后，立即加入2.0mL的10%三氯醋酸溶液，摇匀静置数分钟，干滤纸过滤，收集滤液(样品液)。
另取一试管，先加入1.0mL 已预热好的枯草杆菌蛋白酶液和2.0mL 的10%三氯醋酸溶液，摇匀，放置数分钟，再加入2.0mL0.5%的酪蛋白溶液，然后于30℃水浴保温10min，同样干滤纸过滤，收集滤液(对照液)。
以上两过程，应各做一次平行实验。
2.滤液中酪氨酸含量的测定
取3支试管，分别加入1.0mL 水、A 液、B 液，然后各加入5.0 mL 0.55mol/L 碳酸钠溶液和1.00mLFolin-酚试剂，摇匀按标准曲线制作方法保温并测吸光度值。
根据吸光度值，由标准曲线查出A、B 液中酪氨酸含量差值，即可推算出酶的活力单位。
五、计算
A 样品—样品液的吸光度值
A 对照—对照液的吸光度值
K—标准曲线上A=1时对应的酪氨酸μg 数
V—酶促反应液的体积(本实验为5mL)
T—酶促反应时间(本实验为10min) N—酶溶液稀释倍数。