CHIP全解析

ChIP实验步骤第一天：（一）、细胞的甲醛交联与超声破碎。

1、取出1平皿细胞（10cm平皿），加入243ul 37％甲醛，使得甲醛的终浓度为1％。

（培养基共有9ml）2、37摄氏度孵育10min。

3、终止交联：加甘氨酸至终浓度为0.125M。

450ul 2.5M甘氨酸于平皿中。

混匀后，在室温下放置5min即可。

4、吸尽培养基，用冰冷的PBS清洗细胞2次。

5、细胞刮刀收集细胞于15ml离心管中（PBS依次为5ml，3ml和3ml）。

预冷后2000rpm 5min 收集细胞。

6、倒去上清。

按照细胞量，加入SDS Lysis Buffer。

使得细胞终浓度为每200ul含2×106个细胞。

这样每100ul溶液含1×106个细胞。

再加入蛋白酶抑制剂复合物。

假设MCF7长满板为5×106个细胞。

本次细胞长得约为80％。

即为4×106个细胞。

因此每管加入400ul SDS Lysis Buffer。

将2管混在一起，共800ul。

7、超声破碎：VCX750，25％功率，4.5S冲击，9S间隙。

共14次。

（二）、除杂及抗体哺育。

8、超声破碎结束后，10，000g 4度离心10min。

去除不溶物质。

留取300ul做实验，其余保存于－80度。

300ul中，100ul加抗体做为实验组；100ul不加抗体做为对照组；100ul加入4ul 5M NaCl （NaCl 终浓度为0.2M），65度处理3h解交联，跑电泳，检测超声破碎的效果。

9、在100ul的超声破碎产物中，加入900ul ChIP Dilution Buffer和20ul的50×PIC。

再各加入60ul Protein A Agarose/Salmon Sperm DNA。

4度颠转混匀1h。

10、1h后，在4度静置10min沉淀，700rpm离心1min。

11、取上清。

各留取20ul做为input。

一管中加入1ul 抗体，另一管中则不加抗体。

4度颠转过夜。

（三）、检验超声破碎的效果。

取100ul超声破碎后产物，加入4ul 5M NaCl，65度处理2h解交联。

分出一半用酚/氯仿抽提。

电泳检测超声效果。

第二天：（一）、免疫复合物的沉淀及清洗。

12、孵育过夜后，每管中加入60ul Protein A Agarose/Salmon Sperm DNA。

4度颠转2h。

13、4度静置10min后，700rpm离心1min。

除去上清。

14、依次用下列溶液清洗沉淀复合物。

清洗的步骤：加入溶液，在4度颠转10min，4度静置10min沉淀，700rpm离心1min，除去上清。

洗涤溶液：a. low salt wash buffer----one washb. high salt wash buffer-----one washc. LiCl wash buffer------one washd. TE buffer------two wash15、清洗完毕后，开始洗脱。

洗脱液的配方：100ul 10％SDS， 100ul 1M NaHCO3， 800ul ddH2O，共1ml。

每管加入250ul洗脱buffer，室温下颠转15min，静置离心后，收集上清。

重复洗涤一次。

最终的洗脱液为每管500ul。

16、解交联：每管中加入20ul 5M NaCl（NaCl终浓度为0.2M）。

混匀，65度解交联过夜。

第三天：（一）、DNA样品的回收17、解交联结束后，每管加入1ul RNaseA（MBI），37度孵育1h。

18、每管加入10ul 0.5M EDTA， 20ul 1M Tris.HCl（PH 6.5），2ul 10mg/ml 蛋白酶K。

45度处理2h。

19、DNA片段的回收―――omega胶回收试剂盒。

最终的样品溶于100ul ddH2O。

（二）、PCR分析二、技术总结（一）、关于细胞细胞的生长状态要好。

因为细胞的生长状态直接影响细胞内部的基因表达调控网络，也很有可能影响你所研究的TF与其靶Promoter的结合。

一般细胞长到75％－80％比较好。

（二）、关于抗体！抗体是实验成败的致命因素之一！必须是IP级别的抗体，另外如果经济条件许可的话，尽量买大厂的抗体。

不推荐国产抗体和santa cruz的抗体，即使是IP级别的。

单抗与多抗的选择也需要仔细考虑。

两种抗体各有利弊。

单抗特异性强，背景低。

但是单抗有一个致命的弱点，就是识别位点单一，而在ChIP甲醛交联的过程中，很有可能该位点被其它蛋白或核酸结合而被封闭，导致单抗不能识别靶蛋白。

多抗虽然没有这个问题，但是多抗特异性较差，背景可能会偏高。

一般而言，如果没有十足把握（单抗的识别位点远离靶蛋白与核酸结合的区域），选择多抗比较稳妥一些。

（三）、关于交联与超声破碎！这一块的确是ChIP实验中比较难把握的部分。

交联的程度会影响到超声破碎的效果，交联的程度越高，超声破碎就越不易把基因组打碎成小片段。

交联不充分，只有一部分靶蛋白与其Promoter相结合，富集得到的Promoter的量不高，实验假阴性。

交联过充分，基因组上结合了太多的蛋白，对超声破碎造成障碍。

另外也会增加背景。

一般来讲，按照我的经验，交联条件取决于细胞类型。

不同的细胞系，交联的条件也不一样。

例如：NIH－3T3的交联条件是室温（25摄氏度）下15min，1％的甲醛浓度，而别的细胞系则可能完全不一样。

而超声破碎的条件，机器不一样，条件也不一样。

当然如果你有bioruptor这样的神器，那么超声破碎对你而言就是小菜一碟了。

一般，理想的超声破碎得到的片段大小是200bp－1000bp。

但是200bp－2000bp的范围也是可以接受的。

（四）、关于操作希望尽可能的保持低温（4度）。

沉淀的时候可以先在4度放置一会，等它自然沉降一些，再超低转速（500rpm等）离心使其完全沉降。

虽然说明书上说ChIP实验的过程中有几个可以停顿的地方，我还是希望你能够连续把它做完，直到PCR结果出来为止。

尽量避免实验中不可预知的影响因素。

（五）、关于解交联虽然说明书上说4小时已经足够，但是我还是希望你可以解交联过夜。

因为在那样的环境里，DNA不会降解，过夜解交联更充分些。

只是不要忘记在EP管口封上封口膜。

（六）、关于DNA片段的回收需要注意的是：样品中SDS样品较高，普通的PCR产物回收试剂盒回收，很有可能会在最终的样品中混入SDS，影响PCR实验结果。

小Tip：过柱前，在样品中加入一定量的异丙醇，能有效的消除SDS沉淀一、ChIP是一项比较流行的研究转录因子（transcription factor, TF）与启动子（promoter）相互结合的实验技术。

由于ChIP采用甲醛固定活细胞或者组织的方法，所以能比较真实的反映细胞内TF与Promoter的结合情况。

这个优势是EMSA这个体外研究核酸与蛋白相互结合的实验方法所不能比拟的。

当用甲醛处理时，相互靠近的蛋白与蛋白，蛋白与核酸（DNA或RNA）之间会产生共价键。

细胞内，当TF与Promoter相互结合（生物意义上的结合）时，它们必然靠的比较近，或者契合在一起，这个时候用甲醛处理，能使它们之间产生共价键。

一般ChIP的流程是：甲醛处理细胞——收集细胞，超声破碎——加入目的蛋白的抗体，与靶蛋白-DNA复合物相互结合——加入Protein A，结合抗体-靶蛋白-DNA复合物，并沉淀——对沉淀下来的复合物进行清洗，除去一些非特异性结合——洗脱，得到富集的靶蛋白-DNA复合物——解交联，纯化富集的DNA片断——PCR分析。

在PCR分析这一块，比较传统的做法是半定量－PCR。

但是现在随着荧光定量PCR的普及，大家也越来越倾向于Q－PCR了。

此外还有一些由ChIP衍生出来的方法。

例如RIP（其实就是用ChIP 的方法研究细胞内蛋白与RNA的相互结合，具体方法和ChIP差不多，只是实验过程中要注意防止RNase，最后分析的时候需要先将RNA逆转录成为cDNA）；还有ChIP-chip（其实就是ChIP富集得到的DNA片段，拿去做芯片分析，做法在ChIP的基础上有所改变，不同的公司有不同的做法，要根据公司的要求来准备样品）。

ChIP assay: Chromatin immunoprecipitation assay was performed according to the protocol of ChIP assay kit (Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY).1, For cells cultured in 2D, about 1-2X107 S1 cells were growth in 100mm dish, and were cross-linked by adding formaldehyde to final concentration of 1% and incubated in room temperature for 10 minutes. For cells growth in 3D, cells were isolated from EHS using PBS/EDTA, and also cross-linked as cells growth in 2D.2, Wash cells twice using ice cold PBS containing protease inhibitors (1mM phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF), 1microgram/ml aprotinin and 1microgram/ml pepstatin A). Note: Add protease inhibitors to PBS just prior to use. PMSF has a half-life of approximately 30 minutes in aqueous solutions.3, Scrape cells into conical tube, Pellet cells for 4 minutes at 2000 rpm at 4℃.4, Cells were washed with PBS and resuspended in ChIP lysis buffer (1% SDS, 10mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH8.0) add protease inhibitors (inhibitors: 1mM PMSF, 1microgram/ml aprotinin and 1microgram/ml pepstatin A).. After incubated 10 minutes on ice, cells were sonicated to shear DNA to lengths between 200 and 1000 basepairs being sure to keep samples ice cold.5, Centrifuge samples (part A, step 7) for 10 minutes at 13,000 rpm at 4℃, and detected the OD260 of the lysates.6, Sonicated lysates were then diluted to OD260 2 with ChIP dilution buffer (). 60 ul protein A-agarose beads (Upstate Catalog # 16-157) was added to sonicated lysates and rotated at 4 for one hour to reduce the non-specific dinding.7, Pellet agarose by brief centrifugation and collect the supernatant fraction, 20ul of lystates were taken out as input control.9, Add the immunoprecipitating antibody (the amount will vary per antibody) to the 2ml supernatant fraction and incubate 2h at 4℃with rotation. For a negative control, perform a no-antibody immunoprecipitation by incubating the supernatant fraction with 60 microliters of Salmon Sperm DNA/Protein A Agarose Slurry for one hour at 4℃with rotation.10, Pellet agarose by gentle centrifugation (700 to 1000 rpm at 4℃, ~1min). Carefully remove the supernatant that contains unbound, non-specific DNA. Wash the protein A agarose/antibody/histone complex for 3-5 minutes on a rotating platform with 1ml of each of the buffers listed in the order as given below:Low salt wash buffer (0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris-HCl pH8.0, 150 mM NaCl); High salt wash buffer (0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris-HCl pH8.0, 500 mM NaCl); LiCl buffer (0.25 M LiCl, 1% NP-40, 1% SDC, 1 mM EDTA, 10 mM Tris-HCl pH8.0); TE buffer (20 mM Tris-HCl pH8.0, 1 mM EDTA pH8.0).11, Elute the histone complex from the antibody by adding 250 microliter elution buffer (1%SDS, 0.1M NaHCO3) to the pelleted protein A agarose/antibody/histone complex from step 10 above. Vortex briefly to mix and incubate at room temperature for 15 minutes with rotation. Spin down agarose, and carefully transfer the supernatant fraction (eluate) to another tube and repeat elution. Combine eluates (total volume=approximately 500 microliters.)12, Add 20 microliters 5M NaCl to the combined eluates (500 microliters) and reverse histone-DNA crosslinks by heating at 65℃for 4 hours.Note: Include the input DNA from this step.13, Add 10 microliters of 0.5M EDTA, 20 microliters 1M Tris-HCl, pH 6.5 and 2 microliters of 10mg/ml Proteinase K to the combined eluates and incubate for one hour at 45℃.14, Recover DNA by phenol/chloroform extraction and ethanol precipitation. Addition of an inert carrier, such as 20 microgramsglycogen, helps visualize the DNA pellet. Wash pellets with 70% ethanol and air dry.15, Resuspend pellets in an appropriate buffer for PCR or slot-blot reactions. PCR or slot-blot conditions must be determined empirically. （本文来源于爱番茄 , 原文地址：/archives/399.html）染色质免疫沉淀（ChIP）实验中应注意的细节问题仅供参考使用，最好实验条件需要自己摸索：1、cell counting：尽量做到准确，会影响input结果。