经典液相

（二）、分离原理 1、吸附与解吸附 、
吸附
物理吸附：范德华力， 物理吸附：范德华力，无选择性 化学吸附：形成氢键，选择性 化学吸附：形成氢键，
解吸附 溶质从吸附剂表面溶解到
流动相中的现象
2、吸附平衡： 、吸附平衡： K = Cs/Cm （K又称为吸附系数）
讨论： 讨论： 值越大，越容易被吸附， 1、K 值越大，越容易被吸附， 保留时间越长。 保留时间越长。 2、K 值取决于 吸附剂的活性 组分的性质 流动相的极性
三、学习要点
• 固定相、流动相的性质 固定相、 • 固定相、流动相的选择原则 固定相、 • 具体操作 • 用途
第二节 经典柱色谱法
一、液-固吸附柱色谱 固吸附柱色谱 二、液-液分配柱色谱 液分配柱色谱 三、离子交换柱色谱 四、空间排阻柱色谱
一、 液-固吸附色谱法 、 固吸附色谱法
（一）、概述 ）、概述 固定相： 固定相：固体吸附剂 如硅胶、三氧化二铝 如硅胶、 流动相：各种有机试剂、 流动相：各种有机试剂、水 分离原理：吸附， 分离原理：吸附，解吸附
（二）固定相
极性（水溶性） 极性（水溶性）水、稀酸碱、甲醇 稀酸碱、
固定液
非极性（脂溶性）正庚烷、 非极性（脂溶性）正庚烷、碳氢聚合物 液体石蜡、环几烷等） （液体石蜡、环几烷等）
选择少、应用少 选择少、 载体 • 要求：化学惰性；大小适宜；表面积 要求：化学惰性；大小适宜； 多孔、孔径均匀）； ）；对固定液吸 大（多孔、孔径均匀）；对固定液吸 附强 • 常用载体：硅胶、硅藻土、纤维素等 常用载体：硅胶、硅藻土、纤维素等
3、 性能指标 、
交联度
交联度 大 小 树脂孔径 选择性 大离子进入
小 大 理论 实际
高 低
慢 快
交换容量 粒度
4、树脂的处理与保存 、
再生
游离型 例：
保存
盐型
R-SO3-H+ + Na+ = R-SO3-Na+ + H+ 氢型 钠型 R-NR3+OH-+Cl-= R-NR3+Cl- + OH氢氧型 氯型
硅胶含水量和活性关系
硅胶含水量％ 硅胶含水量％ 0 5 15 25 38 活性级别 Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ Ⅴ
改变活性的方法 提高活性（活化） 提高活性（活化） 105～110℃加热适当的时间 ～ ℃ 加热温度不可超过500℃ ℃ 加热温度不可超过 降低活性（去活化） 降低活性（去活化） 根据需要加入适量的水
3.流动相 流动相
单一溶液： 单一溶液：水 缓冲液 有机溶剂 选择：能溶解样品，浸润凝胶， 选择：能溶解样品，浸润凝胶，粘 度低， 度低，不干扰检测
极性越大，洗脱能力？
3、流动相的组成（液相色谱皆然） 、 液相色谱皆然）
单一溶剂： 单一溶剂： 混合溶剂： 混合溶剂： 基础溶剂—溶解作用 基础溶剂 溶解作用 洗脱溶剂—调整极性 洗脱溶剂 调整极性
（五）样品的保留和 溶剂、 溶剂、吸附剂的选择
1. 样品的保留值取决于 化合物的极性（ 化合物的极性（p216） ） 吸附剂的活性 流动相的极性
经典液相色谱法
第一节 经典柱色谱法 第二节 平面色谱法
第一节 概述
一
液 相 色 谱 法 板色谱法
液相色谱法
柱色谱法 经典液相柱色谱法* 经典液相柱色谱法 高效液相色谱法 色谱法* 色谱法 色谱法* 色谱法 色谱法
* 本章讲述的内容
二、经典液相柱色谱法和平板色谱法
的主要用途
经典液相柱色谱法： 经典液相柱色谱法：分离混合物 平板色谱法： 平板色谱法：定性分析 定量分析 为柱色谱的条件选择提供依据
2、溶剂极性 、
极性大小（ 极性大小（p216） ） 石油醚<苯 氯仿 乙酸乙酯<丙酮 氯仿<乙酸乙酯 丙酮< 石油醚 苯<氯仿 乙酸乙酯 丙酮 乙腈<正丁醇 乙醇<甲醇 水 乙腈 正丁醇<乙醇 甲醇<水 正丁醇 乙醇 甲醇
注：决定极性的结构因素 母核相同：取代基极性、 母核相同：取代基极性、取代基数量 不饱和键数 空间结构。如分子内/间氢键 空间结构。如分子内 间氢键
影响分配系数的因素
• 溶质离子的电荷和水合半径 • 离子交换树脂的交联度和交换容量 • 流动相的离子强度和 值 流动相的离子强度和PH值
四、树脂的选择
被分离物电荷
无机阳离子、生物碱 阳离子交换树脂 无机阳离子、生物碱-阳离子交换树脂 无机阴离子、有机酸 阴离子交换树脂 无机阴离子、有机酸-阴离子交换树脂
颗粒直径
(2) 适宜的吸附能力 (3) 结构、粒度均匀 结构、 (4) 化学惰性 (5) 有一定机械强度
2、常用吸附剂的种类 、
无机吸附剂 硅胶 氧化铝 活性炭
酸性pH4～5 ～ 酸性 中性 5～7 ～ 碱性 7～13 ～
有机吸附剂
聚酰胺 大孔吸附树脂 淀粉 纤维素... 纤维素...
3、硅胶 、
*离子交换法 离子交换法 除去离子 全部+/-离子被交换到柱上 全部 离子被交换到柱上 富集离子 离子交换色谱法 用于分离
*四 空间排阻色谱 四
（凝胶色谱法） 凝胶色谱法）
定义： 定义： 流动相 分类 固定相
分离原理不同 GFC 水溶液 凝胶过滤 GPC 有机溶剂 凝胶渗透
葡聚糖 聚丙烯酰胺凝胶 交联聚苯乙烯等 琼脂糖凝胶
2
O
C 2 H C 2 H O
O H
H O C H
外水体积V 外水体积 m=Vouter
O H
内水体积V 内水体积 inner
VR=V0+KVs
K=Cs/Cm
讨论： 讨论：分子大小与保留行为 1) 很大：Cs =0, K =0 很大： VR=V0 2) 很小：Cs=Cm, K=1 很小： VR=V0+Vs 3) 适中： 0<K<1 适中： VR=V0+KVs 与分子大小相反 4) 若 K>1 其它作用机理
减 小 扩 散 /
*梯度洗脱示意 梯度洗脱示意
二 液-液分配色谱法 液分配色谱法
（一）分离原理 K = Cs/Cm 不同的物质K值不同， 不同的物质K值不同， 保留时间不同，从而得到分离。 保留时间不同，从而得到分离。
分离的过程类似 于液液萃取过程 Cs 组分的 K = C =2 m Vm= Vs
分配色谱应用
优点：体系多样； 优点：体系多样；分配等温线线性 范围大； 范围大； 缺点： 缺点：固定液流失 应用：经典—柱色谱 应用：经典 柱色谱 纸色谱 HPLC—键合固定相 键
*示例：异羟基洋地黄毒苷分离 示例： 示例
样品：毛花洋地黄粉末：分离羟基 样品：毛花洋地黄粉末： 洋地黄毒苷和异羟基洋地黄毒苷 固定相： 目硅胶+水 固定相：80—100目硅胶 水（乙酸 目硅胶 乙酯饱和）（ ）（3﹕ ） 乙酯饱和）（ ﹕2） 流动相： 流动相：含0.5%甲醇的乙酸乙酯 甲醇的乙酸乙酯 水饱和） （水饱和） 玻璃管柱， 玻璃管柱，湿法装柱
2.凝胶 凝胶
性能指标： 性能指标： • 粒度：经典柱层析 30 ～100目 粒度： 目 • 交联度：→吸水量、孔径、溶胀 交联度： 吸水量、孔径、
吸水量： 吸水量：每克干凝胶吸水克数 商品型号：吸水量× ， 商品型号：吸水量×10，如G—10
• 排除极限（可分离分子量上限） 排除极限（可分离分子量上限） • 可分离分子量范围等
（四）流动相
1. 对流动相的要求（所有色谱法） 对流动相的要求（所有色谱法） （1）溶解样品，不溶解固定相 ）溶解样品， 尤对分配色谱） （尤对分配色谱） （2）纯度高，化学惰性，不与样品及 ）纯度高，化学惰性， 固定相反应 （3）不干扰检测 ） （4）粘度小、毒性小、不易燃、价格低 ）粘度小、毒性小、不易燃、
• 结构：以SiO2·xH2O表示，为硅氧 结构： 表示， 表示 交联结构， 交联结构，表面有许多硅醇基 表面结构
活泼型
H H O S i O H O O S i O H O S i O O H H O O H O H S i S i S i O O O O S i
游离羟基
束缚型H H
O H
• 活性 表征吸附性能的强弱 活性级别（活度） 活性级别（活度） 分为Ⅰ 分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ级 级数越大， 级数越大，活性越小 活性的影响因素 比表面积：硅胶颗粒小， 比表面积：硅胶颗粒小，活性强 含水量：含水量小， 含水量：含水量小，活性强
吸附色谱 三要素
（三）、吸附剂 ）、吸附剂
1、吸附剂应具备条件 、
(1)较大的吸附表面 较大的吸附表面 • 吸附表面的大小 比表面积： 比表面积：每克吸附剂的总表面积 Al2O3: 100-300 m2/g; 硅胶： 硅胶：300-1000 m2/g 粒度： 粒度：以目数或颗粒直径表示 目数
100目-0.147mm 目 200目-0.074mm 目
流动相pH 流动相
强酸碱型树脂 - 不限 弱酸型树脂 - 碱性 弱碱型树脂 - 酸性
分子
小-交联度高 交联度高 大低
(三）应用 三
无机与生物化学领域:DNA、RNA水解 、 无机与生物化学领域 水解 产物，氨基酸、核苷、 产物，氨基酸、核苷、核苷酸
Moore,Stein:氨基酸自动分析仪，1972年Nobel化 氨基酸自动分析仪， 年 化 氨基酸自动分析仪 学奖
2. 根据样品的极性选择吸附剂和流动相
样品极性 强 弱
低 弱 吸附剂活性 高 强 流动相极性 样品极性 弱
固定相活性 低 高 流动相极性 强 弱
强
（六）经典柱色谱的具体操作 经典柱色谱的具体操作
1.条件的确定 条件的确定 2.装柱：干/湿法装柱 装柱： 湿法装柱 装柱 • 装柱要求：均匀、紧密、 装柱要求：均匀、紧密、 无断层和气泡 3. 4. / （1） ） ： （2） ） 5.