《分析化学》16经典液相色谱法jdyx
经典液相色谱法 ppt课件
和薄层色谱。
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1.2 吸附色谱法的依据
吸附过程的两个规律： 1）吸附过程是可逆的，存在着吸附 平衡,存在一个吸附平衡常数 解附的动态
K=Cs/Cm
2）吸附剂对不同物质的吸附行为有差异
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吸附机理
流动相通过固定相时，吸附剂表面的活性中心吸附流
动相分子，当组分分子进入柱子时，会赶走流动相分 子而占据吸附剂的活性中心位，即组分被吸附；反之， 溶剂分子也可把溶质分子赶走，即解吸。
SO3H CH CH2 CH
SO 3H CH2 CH
SO3H CH2 CH
SO3H CH2 CH
SO3H
SO3H
SO3H
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SO3H
SO3H
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交换反应： R-SO3-H+ + Na+ + ClR-SO3- Na+ + H+ + Cl-
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1.2 阴离子交换树脂
根据可交换的离子的不同
低交联度树脂－网状结构疏松，网眼大，具有较好的渗 透性，但存在着易变形和耐压差等缺点。
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根据分离对象选择树脂交联度：
分离小分子物质（氨基酸） ——选择8%树脂为宜
分离分子量较大的物质（多肽）
——选择2－4%树脂为宜
保留：极性越小的组分保留越强
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3. 载体
作用：负载固定液 要求：化学惰性，粒度小而均匀，纯净，与固定液间
有较大的分子间作用力。
常用载体：硅胶 、硅藻土 、纤维素
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4. 固定液相与流动液相
第10章经典液相色谱法
二、载体 载体(担体): 惰性物质, 要有较大的表面积(起负载固定 液的作用)。 有硅胶、纤潍素、硅藻土等 三、固定液及其选择 正相分配色谱，其固定相的极性大于流动相，即以强极 性溶剂作为固定液，以弱极性的有机溶剂作为流动相； 反相分配色谱，其固定液具有较小的极性，而流动相则 极性较大。 正相色谱与反相色谱的比较 正相 反相 固定相极性 大 小 流动相极性 小 大 适于分离的物质 极性物质 中等极性至非极性的物质 流出顺序 极性小的组分先流出柱 极性大的组分先流出
（2）凸形吸附等温线 在绝大多数情况下，吸附等温线 都有些弯曲而呈现凸形吸附等温线。其中主要原因之一是 固体吸附剂表面的不均一性。 例如硅胶表面上有几种吸附 能力不同的吸附中心——强的、较强的、弱的、极弱的 同一溶质分子总是先占据强的吸附中心，两者之间作 用力强，溶质分子被吸附得牢，吸附平衡常数K值大，迁 移速率慢；后占据弱的吸附中心，两者之间作用力弱，吸 附平衡常数K值小，迁移速率快，并依此类推。 显然，同一溶质分子具有不同的吸附平衡常数K，即具 有不同的迁移速率。在溶质分子集中的区域，吸附剂的所 有吸附中心达到吸附饱和，K值小，迁移速率快，先流出 色谱柱；在溶质分子稀少的区域，由于仅仅占据了强吸附 中心，K值大，迁移速率慢，后流出色谱柱。从而导致流 出曲线前沿陡峭，后沿拖尾，形成拖尾峰，且保留时间亦 随样品量的增加而减小。如图10-2B所示。
(2) 硅胶: 吸附能力稍弱于氧化铝,用于分离弱酸与中性物(如
有机酸、氨基酸、甾体等)。硅醇基是使硅胶有一 定吸附能力的活性基团。
三种存在形式:
O H Si OH Si O Si O H O Si
பைடு நூலகம்
Ⅰ 自由型
Ⅰ 束缚型Ⅰ
Ⅰ Ⅰ 活泼型Ⅰ
液相色谱法简介
液相色谱法简介气相色谱不能由色谱图直接给出未知物的定性结果，而必须由已知标准作对照定性。
当无纯物质对照时，定性鉴定就很困难，这时需借助质谱、红外和化学法等配合。
另外大多数金属盐类和热稳定性差的物质还不能分析。
此缺点可高效液相色谱法来克服。
在经典液相色谱的基础上，引入了气相色谱的理论与技术，在70年代初建立了高效液相色谱分析法（以HPLC表示）。
在常压下操作的液相色谱，分离一个样品往往长达几小时至几十小时，因此工作效率很低。
人们曾对这种经典液相色谱法试用了柱前加压或柱后减压的办法来提高流速，以缩短分离时间，但是结果失败了。
根据液相色谱理论，因为随着载液（流动相）流速的提高，板高则增大，所以柱效会显着降低。
随着生产技术的提高，人们制成了细小（<10?m）而高效的填充物，从而使柱效大大提高。
但是随着填充物粒度的减小，柱压降显着增大，为了得到合理的载液流速，使用了高压；输液泵，使流速达到1~10mL/min。
从而使分析一个多组分样品只需几分钟到几十分钟时间。
随着高效固定相、高压泵和高灵敏度检测器以及电子技术和计算机技术的应用，70年代以业逐步实现了液相色谱分析的高效、高速、高灵敏和自动化操作。
因此人们常称它为高效液相色谱或现代液相色谱，以区别于经典液相色谱。
高效液相色谱法的分类与经典液相色谱法一致。
按固定相的聚集状态不同分为液固色谱法和液液色谱法。
按分离原理不同分为吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱和凝胶色谱法四类。
高效液相色谱所用基本概念：保留值等色谱分析有关术语，以及分配系数、分配比、塔板高度、分离度、选择性等方面均与气相色谱相一致；高效液相色谱所用基本理论：塔板理论与速率理论也与气相色谱一致。
因液相色谱以液体代替气相色谱中的气体作流动相，则速率议程H=A+B/?+C?。
式中：纵向扩散项（分子扩散项）B/?对板高的影响与气相色谱不同，由于液相色谱中组分分子在流动相中的扩散系数Dm仅为气相色谱中的万分之一，因此纵向扩散项对板高的影响可以忽略不计。
液相色谱检测方法
液相色谱检测方法液相色谱检测方法是一种快速、灵敏、准确的分析技术，用于分析多种分子，如蛋白质、糖、脂肪和碱性物质。
液相色谱技术定义了一种将分子分离到各自不同相中的方法，被用于分析和检测各种化学活性物质和有机小分子，其中一般用于分子量分析和结构鉴定、确证药物及其代谢物。
液相色谱技术主要是在液相和柱室里进行分析。
在液相和柱室里，将溶液经由内部管道输入，在离子拉曼分离器的作用下，溶液的相分离产生。
常用的液相色谱方法有高效液相色谱法(HPLC)、近红外分光光度法(NIR)、紫外分光光度法(UV-Vis)、离子色谱法(IC)以及毛细滤纸法等。
高效液相色谱法是一种依靠溶剂逆渗混合的技术，能将溶液中的混合物分离来研究物质的组成和结构。
它的基本原理是将混合物的分子分别压入液相色谱填料的孔隙，即拆分混合物。
使用这种技术可实现对多种药物的鉴别和定量分析。
近红外分光光度法是一种快速、简单、准确的分析方法，比传统的液相色谱法有较大的优势。
由于它具有近红外光谱的高灵敏度和分辨率，可以以很少的试样量快速、准确地完成一次分析。
该方法可以用于测定蛋白质、糖、脂肪、碱性物质或有机物质的含量、性质和组成。
紫外分光光度法是通过利用紫外分光仪，利用化合物吸收紫外光谱中不同波长光下的吸收高度，以及色谱法把混合物分离，以实现对化合物的定量和质量分析。
它比其他常用的分析方法更加灵敏，可以检测比较低浓度的物质，也可以检测有机物的定量和质量分析。
离子色谱法是一种强效的分析技术，它利用离子的化学性质和质谱仪的特殊性能，通过混合物的分子离子化为活性离子，然后根据离子的分离效果，将它们分离出来，以完成有机物质的定量和质量分析。
最后，毛细滤纸法也是一种常用的液相色谱技术。
它是将混合溶液和密度液共同通过一块毛细滤纸，根据不同化学物质的溶解度、分子张力、质子交换能力等特性，分离混合物，以准确地检测有机物质。
总之，液相色谱法是一种快速、灵敏、准确的分析技术，它主要作为传统的液相色谱法、近红外分光光度法、紫外分光光度法、离子色谱法和毛细滤纸法，以及细分有机物质等技术，用于研究有机物质的含量、性质及组成，扮演着不可替代的作用。
液相色谱法如何用于药物分析 液相色谱操作规程
液相色谱法如何用于药物分析液相色谱操作规程液相色谱法（High Performance Liquid ChromatographyHPLC）又称“高压液相色谱”“高速液相色谱”“高分别度液相色谱”“近代柱色谱”等。
液相色谱是色谱法的一个紧要分支，以液体为流动相，接受高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分别后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。
如今，该方法已成为化学、医学、工业、农学、商检和法检等学科领域中紧要的分别分析技术应用。
尤其是在药物分析领域，有着广泛的应用。
液相色谱在药物分析中的应用，紧要考虑试样的预处理和分析柱、检测器的选择。
在试样的预处理上，日前兴起的固相（微）萃取使得很多含量低的成分得到精制提纯，从而适于液相色谱的测定。
中药中有些紫外吸取，或无特征紫外吸取的成分，直接用液相色谱测定，其灵敏度和分别度都不尽人意，利用柱前或柱后衍生化法可使这些成分较地测定出来。
对于极性大、脂溶性差物质，在YWGCl8柱上不易保留，用十二烷基磺酸钠作为离子对试剂，降低其极性，延长柱上的保留时间，取得较好的分别较果。
将液相色谱和质谱这两个强有力的分析技术在线连接在一起，经过三十年的进展已成为一项较为成熟的分析手段，但是它从形成伊始就存在着问题：从液相色谱流进质谱时，流动相的变化、溶剂的构成、高温高压离子化的问题制约着这种联用技术进展。
大气压离子化接口具有去除溶剂和离子化的双重功效，它的引入使得该技术在各个领域得到了广泛的应用。
电喷雾离子源是一种软电离技术，一般只生成（M H）和（M—H）—两种分子离子峰，选择性监测（mz）190的负分子离子峰，具有较高的灵敏度、精准度、专一性，充分了低浓度药物讨论的需求。
三维液相色谱法可以同步测定葛根素和阿魏酸两种指标。
通过试验证明：假如选择合适的柱温等色谱条件，乙醇作为反相液相色谱流动相，分析中药及中成药中有效成分，既安全又精准。
液相色谱基本知识
液相色谱基本知识一、液相色谱原理液相色谱是一种基于不同物质在固定相和流动相之间的分配平衡原理的分离技术。
当流动相流经固定相时，不同物质在固定相中的保留时间不同，从而实现分离。
通过选择合适的固定相和流动相，以及调整流动相的速度，可以实现对不同物质的分离和纯化。
二、液相色谱种类根据固定相的不同，液相色谱可以分为硅胶柱色谱、氧化铝柱色谱、活性炭柱色谱等多种类型。
根据流动相的不同，液相色谱可以分为正相色谱和反相色谱。
正相色谱中，固定相的极性大于流动相的极性；反相色谱中，固定相的极性小于流动相的极性。
三、液相色谱操作步骤1. 样品准备：将待分离的样品进行适当处理，以便于后续的分离和纯化。
2. 装柱：将固定相装入色谱柱中，确保固定相填充均匀。
3. 平衡：在流动相中平衡色谱柱，使固定相和流动相充分接触。
4. 进样：将待分离的样品加入色谱柱，开始分离过程。
5. 洗脱：使用流动相洗脱样品中的各组分，并收集洗脱液。
6. 检测：对收集到的洗脱液进行检测，确定各组分的含量和纯度。
四、液相色谱应用领域液相色谱在多个领域有着广泛的应用，如医药、生物、环保、食品等。
在医药领域，液相色谱可用于药物的分离和纯化；在生物领域，液相色谱可用于蛋白质、核酸等生物大分子的分离和纯化；在环保领域，液相色谱可用于污染物的分离和检测；在食品领域，液相色谱可用于食品添加剂、农药残留等的检测。
五、液相色谱优缺点1. 优点：液相色谱具有分离效果好、分离速度快、适用范围广等优点。
同时，液相色谱还可以与质谱等检测手段联用，提高检测灵敏度和准确性。
2. 缺点：液相色谱需要使用有机溶剂作为流动相，可能对环境和人体健康造成一定影响。
此外，液相色谱的设备成本较高，操作复杂度也相对较高。
六、液相色谱仪器设备液相色谱常用的仪器设备包括高效液相色谱仪、紫外可见分光光度计、质谱仪等。
其中，高效液相色谱仪是实现液相色谱分离的核心设备，它包括泵、进样器、色谱柱、检测器等部分。
分析化学 液相色谱法PPT课件
RN(CH3 )3+ OH- + X- == RN(CH3)3+X-+ OH-
2021年5月
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树脂的再生
• 阳离子交换树脂用HCl溶液处理 •
• R阴离子-交S换O树3-脂M用N+aO+HH溶液+处C理l- == R - SO3-H + + M+Cl-
RN(CH
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（六）操作方法
• 1.装柱 • 2.加样 • 3.洗脱
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二、 液－液分配柱色谱法
• （一）分离机理 • 利用混合物中不同组分在两相溶剂中溶解性不同(分配系数不同)，当流动相携 带样品流经固定相时，各组分在两相间不断进行溶解、萃取，再溶解、再萃取。 样品在色谱柱内经过无数次分配之后，而使分配系数稍有差异的组分得到分离。 • 正相色谱：流动相的极性比固定相的极性弱 • 反相色谱：流动相的极性比固定相的极性强
第十二章 液相色谱法
• 第一节 概述 • 第二节 柱色谱法 • 第三节 平面色谱法 • 思考与练习
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第一节 概述
色谱法(chromatography)又称层析法，是一种依据物质的物理化学性质的不同(如溶解性、极性、离子 交换能力、分子大小等)而进行的分离分析方法。
• 一、 色谱法的产生和发展
•
原理:硅醇基(吸附中心)与极性基团形成氢键(吸附性),组分与硅醇基形成氢键(被吸附)的能力不同而
分离。
•
应用:酸性和中性物质的分离，如有机酸、酚类、醛类.
经典液相色谱法
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酰胺基中的羰基与酚类、黄酮类、酚类中 的羟基或羧基形成氢键；酰胺基中的氨基与醌 类、硝基类中的醌基、硝基形成氢键而产生吸 附作用。 （4）大孔吸附树脂 一种不含交换基团，具有大孔 网状结构的高分子吸附剂。理化 性质稳定，不溶于酸、碱及有机 溶剂。大孔树脂可分为非极性和 中等极性两类，在水溶液中吸附 力较强且有良好的吸附选择性， 而在有机溶剂中吸附能力较弱。
一、基本原理 1．分子筛效应
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体积大的组分完全不能进入凝胶 颗粒内的孔隙中，只能经过凝胶 颗粒之间的间隙随流动相最先流 出色谱柱；而体积小的组分，可 渗入凝胶颗粒内的孔隙中，因此 在流经凝胶颗粒之间的间隙和全 部凝胶颗粒的孔隙之后，最后流 出；介于大小分子中间的组分， 只能进入一部分颗粒内较大的孔 隙，在中间时间段流出。
n
n
因为流动相的量很大，Y m Y a 近似于常数，而 且吸附只发生于吸附剂表面，所以，吸附平衡常 数可写成
n
4
K
X a X m
X X
a
/S
a
Cs Cm
m
/V m
[ X a ]为溶质分子在吸附剂表 面的浓度 [ X m ]为溶质分子在流动相中 的浓度
Sa 为吸附剂表面面积 Vm为流动相的体积
加热除水，活性提高，吸附力加强（活化） 吸水，活性下降，吸附力减弱。 三、色谱条件的选择 选择色谱分离条件时，必须从吸附剂、被分离物 质、流动相(洗脱剂)三方面进行综合考虑。
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1. 被分离物质的极性 被分离物质的极性越大,被吸附剂吸附得越牢! 常见的化合物极性大小顺序: 烷烃 < 烯烃 < 醚类 < 硝基化合物 < 二甲胺 < 脂 类 < 酮类< 醛类 < 硫醇 < 胺类 < 酰胺 < 醇类 < 酚类 < 羧酸类 被分离物质的极性与结构的关系 (1) 基本母核相同 , 基团极性愈大 , 分子极性愈大。 基本母核相同 , 极性基团数目愈多 , 分子极性愈大。 (2) 分子双键多, 吸附力 ↑。 (3) 空间排列 , 影响极性。
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续前
4. 三者关系图示: 三者关系图示: 组分 吸附剂 极性 活性小 非(弱)极性 活性大
流动相 极性 非极性或弱极性
二,薄层色谱法
(一)概述 (二)定性参数 (三)吸附剂的选择 (四)展开剂的选择 (五)薄层板的制备 (六)定性与定量分析
(一)概述
1.定义:将固定相均匀涂布在表面光滑的平板上, 定义:将固定相均匀涂布在表面光滑的平板上, 形成薄层而进行色谱分离和分析的方法 2.操作过程:见图示 操作过程:见图示 铺板 →活化 →点样 → 展开 →定位(定性)/洗脱(定量) 定位(定性)/洗脱(定量) 3 . 分离机制: 吸附 ( 分配 , 离子交换, 空间排阻 ) 分离机制:吸附 分配, 离子交换 , 空间排阻) 吸附( 4.特点:分析快速,灵敏,显色方便 特点:分析快速,灵敏, 5.应用:药物杂质检查,纯度测定 next 应用:药物杂质检查,
�
VS 1 又Q =1+ K R' Vm
L0 L 1 K VS Vm = L 1
续前
Vm 1 Rf = R' = = 1+ K VS Vm Vm + K Vs
K ↑ Rf ↓
讨论 Rf与K有关,即与组分性质(溶解度)以及薄层板 有关,即与组分性质(溶解度) 和展开剂的性质有关 色谱条件一定, 只与组分性质有关, 色谱条件一定,Rf只与组分性质有关,是薄层色谱 基本定性参数, 基本定性参数,说明组分的色谱保留行为
2. 氧化铝
碱性氧化铝 pH 9～10 适于分析碱性,中性物质 适于分析碱性, 中性氧化铝 pH>7.5 适于分析酸性碱性和中性物质 pH> 酸性氧化铝 pH 4～5 适于分析酸性,中性物质 适于分析酸性,
3. 聚酰胺
氢键作用 氢键能力↑ 氢键能力↑强,组分越后出柱
(三)吸附剂和流动相的选择: 吸附剂和流动相的选择:
续前
2. 相对比移值Rs 相对比移值R
原点到组分斑点质量中 心的距离 L1 Rs = = = Rf(参) 原点到参考物斑点质量 中心的距离 L2
讨论RfBiblioteka 组)参考物与被测组分在完全相同条件下展开 可以消除系统误差, 可以消除系统误差,大大提高重现性和可靠性; 参考物可以是后加入纯物质, 参考物可以是后加入纯物质,也可是样品中已知组分 相对比移值R 与组分,参考物性质及色谱条件有关, 相对比移值Rs与组分,参考物性质及色谱条件有关, 范围可以大于或小于1 范围可以大于或小于1
续前
1)K↑大,Rf↓小 K↑大 2)薄层板一定,对于极性组分 薄层板一定, 展开剂极性↑ 展开剂极性↑大,Rf↑大(容易洗脱) 容易洗脱) 展开剂极性↓ 展开剂极性↓小,Rf↓小 (不容易洗脱) 不容易洗脱) 范围:0 3)Rf范围:0< Rf <1 (组分迁移速度和距离小于展开剂迁移速度和距离) 组分迁移速度和距离小于展开剂迁移速度和距离) Rf = 0.2——0.8(常用) ——0 常用) 0.3——0.5(最佳) ——0 最佳)
第四节
经典液相色谱法
液相色谱法:以液体为流动相的色谱法称～. 液相色谱法:以液体为流动相的色谱法称～. 经典液相色谱:固定相颗粒较大且不均匀 常压下输送流动相 柱效较低 分析周期长 现代液相色谱:固定相颗粒小且均匀 高压下输送流动相 柱效较高 分析周期短
一,液-固吸附色谱
(一)分离原理 (二)常用吸附剂 (三)吸附剂和流动相的选择
(三)吸附剂的选择 根据被测物极性和吸附剂的吸附能力 被测物极性强——弱极性吸附剂 被测物极性弱——强极性吸附剂 (四)展开剂的选择(同液固吸附色谱流动相的选择) 同液固吸附色谱流动相的选择) 根据被测组分,吸附剂和展开剂本身的极性
(五)薄层板的制备
定性分析——窄条 定性分析——窄条 定量分析——10×20cm 定量分析——10×20cm 硅胶G——自含粘和剂 硅胶G——自含粘和剂 硅胶H——不含粘和剂,铺板时另加入CMC 硅胶H——不含粘和剂,铺板时另加入CMC 硅胶FH254——含荧光剂,254nm紫外光照发绿光 硅胶FH254——含荧光剂,254nm紫外光照发绿光 硅胶FH365——含荧光剂,365nm紫外光照发光 硅胶FH365——含荧光剂,365nm紫外光照发光
特性: 特性:
1)与极性物质或不饱和化合物形成氢键 物质极性↑,吸附能力↑→强极性吸附中心,不易洗脱 吸附活性次序:活泼型>束缚型>游离型 2)吸水→失活 →105～110OC烘干30分钟(可逆失水)→吸附力最大 →500OC烘干(不可逆失水)→活性丧失,无吸附力
适用: 适用:分析酸性或中性物质
续前
(一)分离原理
各组分与流动相分子争夺吸附剂表面活性中心 利用吸附剂表面的活性吸附中心对不同组分的 吸附能力差异而实现分离
(二)常用吸附剂:多孔,微粒状物质 常用吸附剂:多孔,
1. 硅胶 2. 氧化铝 3. 聚酰胺
1. 硅胶(SiO2H2O) 硅胶(
结构: 结构:内部——硅氧交联结构→多孔结构
表面——有硅醇基→氢键作用→吸附活性中心
(六)定性与定量分析
定性分析——日光,紫外光, 定性分析——日光,紫外光,显色 定量分析——洗脱法, 定量分析——洗脱法,薄层扫描法
四,纸色谱法
将固定相放在纸上,以纸做载体进行点样,展开, 将固定相放在纸上,以纸做载体进行点样,展开, 定性,和定量的液定性,和定量的液-液分配色谱法 固定相:纸纤维吸附的水 流动相:与水不互溶的有机溶剂(饱和正丁醇) 流动相:与水不互溶的有机溶剂(饱和正丁醇) 分离机制:同液分离机制:同液-液分配色谱 1 定性参数: R = f 1+ K VS Vm 讨论: 与组分性质, 讨论:Rf与组分性质,流动相及溶解度有关 极性组分→易保留, 极性组分→易保留,Rf 小(流动相极性↑, Rf ↑) 流动相极性↑ 非极性组分→易流出, 非极性组分→易流出,Rf大(流动相极性↑,Rf ↓) 流动相极性↑
依据被测组分,吸附剂和流动相的性质 1. 被测组分性质(极性大小): 被测组分性质(极性大小) 烃< - - - - - - - - <羧酸,醇 羧酸, 2. 吸附剂的活性: 吸附剂的活性: 吸附剂的活性↑ 吸附剂的活性↑大,对被测组分的吸附能力↑强 对被测组分的吸附能力↑ 强极性物质—— ——选择弱吸附剂 强极性物质——选择弱吸附剂 弱极性物质——选择强吸附剂 弱极性物质——选择强吸附剂 3. 流动相的极性: 流动相的极性: 流动相极性↑ 流动相极性↑大,对被测组分的洗脱能力↑大 对被测组分的洗脱能力↑ 相似相溶" 根据组分性质, "相似相溶"原则 :根据组分性质,吸附剂的活 性, 选择适当极性的流动相
图示
图示
L0 L2 L1
(二)定性参数
1. 比移值Rf 比移值R
设R' 为单位时间内一个分子在展开剂中出现的几率 设 R' 1 为单位时间内一个分子在固定相中出现的几率
定 展 保 比 时 开 留
uR L1 t L1 R' = = = u0 L0 t L0
(R' ≤ 1)
原点到组分斑点质量中 心的距离 L Rf = = 1 原点到溶剂前沿的距离 L0