分光光度法测定微乳液中脂肪酶的酶活
摘
要
通过对胶束酶学对传统脂肪酶酶活测定的 改进 , 建立了 适合于 油包水 微乳液体 系中脂 肪
酶酶活测定的 分光光度方法。与传统方法相比 , 本 法克服了 底物乳 化液难 配制、 不稳定 等缺点 , 无需 进 行在 pH 缓冲溶液体系中的酸碱滴 定 , 提高了酶活测定的准确性。 关键词 微乳液 分光光度技术 脂肪酶酶活测定 实验教学
酸缓冲液为溶剂配制 0 1mg mL 的脂肪酶酶液; 5( W V) % 的 CuAc2 水溶液 ; 在 CuAc2 水溶液中滴加 吡啶配成 pH= 6. 0( 在 pH 计上调控) 的 CuAc2 吡啶水溶液。 取两只 50mL 带塞锥形瓶, 用刻度移液管分别加入 4 5mL 50mmol L AOT 的异辛烷溶液和 0 5mL 三油酸甘油酯, 然后用微量进样器移取 45 L 1 0mg mL 的酶液于一只瓶中 ( 作样品) , 另一只瓶中加 入 45 L 66 7mmol L 的磷酸缓冲液 ( 作空白 ) , 将两只锥形瓶放入 30 ∀ 的恒温振荡水浴中保温 ( 转速 为 150r min) 。20min 后 , 用微量进样器从锥形瓶中各移出 0 4mL 反应液于两支 10mL 具塞离心管 中, 然后用刻度移液管在每只离心管中再加入 4 6mL 苯和 1 0mL 5% 的 CuAc 2 吡啶溶液 , 快速涡流 混合, 终止酶促反应。手工振摇 2min 后, 放入离心机中离心 5min。各取上清液于 1cm 玻璃比色皿 中, 以空白为参比, 测加酶反应液样品在 715nm 处的吸光度 A 。根据吸光度 A 值 , 在油酸工作曲线 上用内插法计算出油酸含量, 再根据酶活定义算出酶活及比活。
微乳液是由水、 表面活性剂和非极性溶剂 ( 简称油 ) 在适当配比条件下自发形成的热力学稳定、 光学透明、 宏观均一的单分散体系。它既可以作为油溶性物质的溶剂 , 又可作为水溶性酶的分散介 质。微乳液可以分成水包油( O W) 型( 即油分散在水中 ) 和油包水型 ( W O) ( 即水分散在油中 , 低水 含量的微乳液也 叫反胶束 ) 。在油包水 型微乳液中 , 酶分子被包 裹在小水滴 ( 也 叫小水池 ( water [ 1] pool) ) 中 , 其物理图像可参见有关文献 。 脂肪酶催化水解甘油三酯反应是在油 水界面上进行的。其催化效率不但取决于活性( 浓度) , 还取决于反应体系界面积大小。为了获得高的催化效率, 其水不溶性底物如橄榄油、 三油酸甘油酯 等必须分散在水中, 即借助于表面活性剂形成底物的乳状液。过去 脂肪酶酶活测定 这一基础生 [2] 化实验一直是在橄榄油乳化液体系中进行的 。这一乳状液体系有一些缺点 , 如制备麻烦( 需用超 声波装置 ) , 且不稳定易分层。此外 , 由于超声条件的差异 , 常常造成乳液液滴大小不均, 实验重复 性不好。再者, 乳状液体系是不透明的 , 不适合于用光学手段对底物或产物进行测定。如将底物增 溶在油包水微乳液介质中则可避免上述缺点。除此外 , 由于微乳液中水滴的大小远小于乳化液中 的油滴, 因此, 微乳液体系的界面积要比乳化液大得多 , 这有利于界面激活脂肪酶发挥其催化作用。 更重要的一点是脂肪酶活性大小可以通过变更水与表面活性剂的物质的量之比 ( 这是微乳液的特 征参数, 与水滴大小有关 ) 来调控。 关于反胶束体系中各种酶的酶学性质研究, 在过去的 20 年里一直是胶体与界面化学家与分子 [1] 生物学家研究的热点 , 并形成了 胶束酶学 ( micellar enzymology) 这一前沿交叉学科 。该研究不仅 在生物合成与转化领域里有着巨大的应用前景, 而且对加深理解天然磷脂体系中酶蛋白的功能也
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ห้องสมุดไป่ตู้
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2001 年 第 10 期
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实验技术
分光光度法测定微乳液中脂肪酶的酶活
黄锡荣
1
张文娟
1
宋少芳
1
李越中
2
曲音波
2 济南 250100)
( 1 山东大学胶体与界面化学教育部重点实验室 ; 2 山东大学微生物技术国家重点实验室
[ 2]
1
1 1
实验
试剂 琥珀酸二辛酯磺酸钠 ( AOT , 纯度 > 99% , Sigma 公司 ) ; 异 辛烷 ( 含 大约 0 02% 的水 , 色谱纯 , Sigma 公司 ) ; 脂肪 酶 ( L 1754, Sigma 公 司 ) ; 三 油酸甘 油酯 ( Sigma 公司 ) ; 油酸、 吡啶、 苯、 醋 酸铜、 Na2HPO4 及 KH 2 PO4 均为分析纯。 1 2 实验步骤 配制 50mmol L AOT 的异辛烷溶液; pH= 7 2 的 66 7mmol L 的 Na2 HPO4 KH 2 PO4 缓冲溶液; 以磷
Abstract
Based on micellar enzymology, a modified experiment on lipase assay is described in this report,
which is intended for these students who major or minor in experimental biochemistry. The present method has some merits over the conventional one in the medium and technique used. Key words Microemulsion, Spectrophotometric technique, Assay of lipase activity, Laboratory instruction
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标准品油酸的体积成线性关 系。若密度 按 0 894 计 , 分子量按 282 5 计, 此范围 内油酸重 2 2~ 13 4mg, 相当于 7 9~ 47 5 mol 油酸。
3
结语
本文建立了适合于微乳液体系中脂肪酶酶活测定的分光光度方法。微乳液体系的引入和分光 光度技术的采用克服了传统脂肪酶酶活测定中底物乳化液难配置、 不稳定等缺点, 避免了在 pH 缓 冲溶液体系中进行酸碱滴定这一常令学生困惑的问题。此外, 光分析技术的采用, 也大大提高了酶 活测定的准确性。
黄锡荣 男 , 37 岁 , 副教授 , 主要从事分析化学教学与胶束酶学研究工作。
高等学校重点实验室访问学者基金资助 2000 08 28 收稿 , 2000 12 30 修回
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有重要帮助。因此, 微乳液体系中脂肪酶酶活测定具有很大教学意义。 在给定时间内, 脂肪酶酶活大小与其催化水解生成的脂肪酸的物质的量成正比。在基础生化 实验教材中 , 生成的脂肪酸含量几乎都是用酸碱滴定方法来定量的 。由于该体系中含有 pH 缓 冲液 , 这种定量分析方法常常令学生们困惑。此外 , 耗碱体积小及指示剂终点变色不明显也造成该 滴定方法不准确、 不灵敏。分光光度方法可以弥补酸碱滴定方法的不足。 [ 3] 用分光光度法来测定脂肪酸的含量已有文献报道 。它是基于脂肪酸与铜离子形成铜皂 , 经 苯萃取后进行比色测定( 铜皂在 715nm 附近有一宽的吸收峰) 。在此基础上经条件摸索优化 , 笔者 开发出了适合于微乳液体系中脂肪酶酶活测定的分光光度技术。
参
[ 1] [ 2] [ 3]
考
文
献
Mart inek K , K lyachko N L, Kabanov A V et al. Biochim. Biophys. A ct a, 1989, 981: 161. 李建武 , 萧能赓 , 余瑞元 等 生物化学实验原理和方法 . 北京 : 北京大学出版社 , 1994. Lowry R R, Tinsley I J. J. Am. Oil Chem. Soc. , 1976, 53: 470.
2
结果与讨论
在检测条件下, 1min 内产生 1 mol 油酸所需的脂肪酶量定义为一个活性单位( u) 。对同一商品
脂肪酶 , 用本法测得的比活性为 26 0 # 0 8 u mg, 用传统方法 ( 于 100mL 碘量瓶中加入 5 0mL 磷酸 缓冲液 ( pH= 7 2) 和 5 0mL 25% 油酸三甘油酯( 聚乙烯醇为乳化剂) , 放入 30 ∀ 的恒温振荡水浴中 , 5min 后加 入 2 5mg 酶 粉, 保温 20min 后, 取出 碘量 瓶, 加 10mL 95% 乙 醇, 以酚 酞 作指 示剂 , 用 0 05mol L NaOH 滴至粉红色为止。 ) 测得的比活性为 8 9 # 0 1 u mg 。 由于微量的酶粉很难称准并重复, 故事先将酶粉配成酶液更易操作。室温条件下, 酶液可稳定 12h。微乳液中脂肪酶底物对酶有一定的稳定作用 , 因此三油酸甘油酯最好在酶液加入前加入。实 验发现, 形成微乳液的水来自酶液 , 而水含量对酶活又有较大影响, 因此, 酶液的体积应加得比较准 确些。实验中为降低 AOT 对后续萃取步骤的影响, 当苯的体积与取样体积之和控制在 5 0mL 时取 样体积不应超过 0 5mL。为此, 可以通过调整酶浓度使水解产生的脂肪酸量落在油酸工作曲线的 线性范围内。油酸工作曲线的绘制方法类似于上述实验步骤 , 只是样品为 4 5mL AOT 的异辛烷溶 液+ 0 5mL 三油酸甘油酯+ 45 L 磷酸缓冲液+ 一定体积的油酸标准品, 而空白为 4 5mL AOT 的异 辛烷溶液+ 0 5mL 三油酸甘油酯+ 45 L 磷酸缓冲液。在 2 5~ 15 L 油酸范围内 , 吸光度 A 与所加
( 上接第 666 页 )
与磷相邻基团的电负性增加时 , 31 P NMR 化学位移向低场位移 , 如 : 杂原子硫、 氧、 氮 , 与磷直接相连将 使磷谱向 低场 位移。环数目增加 , 31 P NMR 向低场位移。糖环上羟基的构型差异以及双 键的构型不同也会对31 P NMR 的化学位移 值有所影响。 The relationship of chemical shift and structures of phosphorous compounds in 31 P NMR, including the coordination number, the type of the atom attaching to phosphorus, cyclic ring number and type, functional group, was reviewed. When the coordination number increases from 2 to 6,
脂肪酶活检测原理及方法
脂肪酶活检测原理及实际方法：一、原理以及标准曲线做法1. 对硝基苯酚酯( 4-Nitrophenyl ester )是脂肪酶水解活力测定中运用最为广泛的一种底物，脂肪酶水解其产生pNP(对硝基苯酚)在碱性条件下显黄色，在410nm 下有吸光值，且灵敏度很高。
2. 所需试剂有：CAS 碳链长度出货号价格名称830-03-5C2N8130-1G ￥462 对硝基苯乙酸酯2635-54-9 C4 N9876-1G￥570 对硝基苯丁酸酯1956-10-1 C821742-1G-F ￥487 对硝基苯辛酸酯1956-11-2 C12 61716-1G ￥435 对硝基苯月桂酸酯1492-30-4 C16 N2752-1G ￥379 对硝基苯棕榈酸酯14617-86-8C18 N3627-1G￥对硝基苯硬酸脂全部为色谱纯试剂，购于sigma 公司3. 标准曲线绘制：a. 标准对硝基苯酚母液(2mM ，2mmol / L): 称取的对硝基苯酚(p-NP)溶于100ml 的溶液B(即不同pH 的缓冲液) ，置于棕色试剂瓶内，4℃冰箱保存。
方法一：b. 标准曲线绘制：分别取，，，，，的对硝基苯酚母液(2mM) ，用溶液B(即不同pH 的缓冲液)稀释至4ml ，分别测定在410nm 处的吸收值。
以对硝基苯酚浓度x(对应浓度分别是，，，，，，单位：mM ) 为横坐标，吸光值y 为纵坐标，绘制标准曲线。
方法二：全部对硝基苯酚经过与测酶活相同的处理，获得吸光度。
b.标准曲线的绘制：分别取0、、、、15、、30、45μL的对硝基苯酚分别加入、、、55、、40、、μL的异丙醇和(全部都是)的溶液B，40℃15min，95%乙醇，10000r / min ，3min ，测出标准曲线。
上表是方法一测得标准曲线脂肪酶酶活定义：在410nm 下测定吸光值, 以 1 min 内催化水解底物对硝基苯棕榈酸酯(p-NPP)产生1μmol 对硝基苯酸(p-NP) 所需的酶量为 1 个酶活单位(U)。
脂肪酶活力测定方法及其比较
万方数据苯萃取后进行比色测定．酶的活力单位定义同平板法．酶活计算同铜皂法．１．３．３对硝基苯酚法对硝基苯酚法是以对硝基苯酚酯作为底物，脂肪酶水解底物产生具有颜色的对硝基苯酚，在４２０ｎｍ波长下测出其吸光光度值，再对照对硝基苯酚吸光度工作曲线得出脂肪酶活力．这样可以使操作更加简单同时可以避免金属离子的干扰［２．１８｜．酶的活力单位定义为检测条件下每分钟产生１ｂｔｍｏｌ对硝基苯酚所需的脂肪酶量，其计算公式为：脂肪酶活力一ＶＮ（Ｃ（样）一Ｃ（空白））／丁／Ｖ（稀释酶液）．式中。
Ｖ反应总体积，Ｎ稀释倍数，Ｃ根据吸光度Ａ求出的对硝基苯酚的浓度，ｔ反应时间，ｙ（稀释酶液）稀释酶液的体积．２３种方法的比较２．１实验仪器和操作难易程度的比较平板法所使用的主要仪器是超净工作台，微量注射器。
培养皿，恒温培养箱，价格便宜，操作简单Ｌ２·１３］；滴定法仅需要酸碱滴定管、试管、恒温水浴锅、酸度计、高速组织捣碎机等一些比较常见，操作简单［”］；比色法包括铜皂法、微乳液法和对硝基苯酚法．铜皂法使用的主要仪器是分光光度计。
超声波装置，仪器较常见，但操作繁琐［１５］；微乳液法使用的仪器主要是分光光度计，操作简单。
精确度高Ｌ１６—１７］；对硝基苯酚法所使用的仪器主要是分光光度计。
操作简单［２·１８］（表１）．２．２实验试剂及精确度的比较平板法使用的试剂主要有维多利亚蓝、三丁酸甘油脂、罗丹明Ｂ等，该实验反应时间长且精确度差［１１］．滴定法所使用的主要试剂有氢氧化钠、酸碱指示剂、聚乙烯醇、橄榄油等［１３｜．滴定中酸碱指示剂不能很好地指示反应终点，即使用酸度计代替酸碱指示剂控制反应终点，产物中丙酮酸的干扰使实验的结果偏大［１ｌ’１９］．铜皂法中的底物有３种：榄橄油，三油酸甘油脂和三丁酸甘油脂［１５］．其中榄橄油作为底物，精确度不高，当用三油酸甘油脂和三丁酸甘油脂作为底物检测脂肪酶的活性。
精确度较高．微乳液法使用的试剂有三油酸甘油脂，吐温一８０和正己烷，实验重复性好，精确度高Ｌ１６。
三种脂肪酶活力测定方法的比较及改进_江慧芳
计算出酶活力。
11 31 3 改进后的脂肪酶活力测定方法
取一系列 p- N P 标准溶液稀释到 5 mL , 呈适当的
浓度梯度, 加入 5 mL 01 5 m ol # L- 1 的三氯乙酸混合,
再加入 51 15 mL 01 5 mol # L - 1N aO H 调 pH 值, 直至
pH 值与加酸前一致, 分别测定吸光度, 绘制吸光度-
5 OD 值 变 化 快, 效果不好
10 OD 值 仍 变 化, 较慢, 效果不好
笔者在此就碱滴定法[ 3, 4] 、对硝基苯酚法[ 5, 6] 和铜 皂法[ 7~ 9] 三种常用的脂肪酶活力测定方法进行了比较 实验, 以期寻找简单快捷、准确有效的活力测定方法。
1 实验
11 1 碱滴定法 11 11 1 药品、试剂及仪器
脂肪酶 ( No vezymes 公 司) , 2% 聚 乙烯 醇 ( 简 称 PV A , 聚合 度 1750) , 01 0667 mol # L - 1 的 K H 2 P O4N a2H P O4 缓冲溶液( pH 值为 51 91, 61 47, 61 98, 71 38, 81 04) , 01 05 mo l # L - 1 N aO H 标准溶液, 橄榄油, 95% 乙醇, 10 g # L - 1 酚酞指示剂。
液的用量, m L; t 为作用时间, min。
11 3 对硝基苯酚法
11 31 1 药品、试剂及仪器 脂肪酶( No vezymes 公司) , 对硝基苯酚( p- NP ) ,
对硝基苯酚棕榈酸酯( p- N PP ) , 50 m mol # L - 1 T ris-
H Cl 缓冲液( pH 值 81 0) , 异丙醇, 阿拉伯胶, T rit on X-
脂肪酶活检测原理及方法
脂肪酶活检测原理及方法脂肪酶活检测原理及实际方法：一、原理以及标准曲线做法1.对硝基苯酚酯（4-Nitrophenyl ester）是脂肪酶水解活力测定中运用最为广泛的一种底物，脂肪酶水解其产生pNP（对硝基苯酚）在碱性条件下显黄色，在410nm下有吸光值，且灵敏度很高。
2.所需试剂有：CAS 碳链长度出货号价格名称830-03-5 C2 N8130-1G ￥462 对硝基苯乙酸酯2635-54-9 C4 N9876-1G ￥570 对硝基苯丁酸酯1956-10-1 C8 21742-1G-F ￥487 对硝基苯辛酸酯1956-11-2 C12 61716-1G ￥435 对硝基苯月桂酸酯1492-30-4 C16 N2752-1G ￥379 对硝基苯棕榈酸酯14617-86-8 C18 N3627-1G ￥2621.97 对硝基苯硬酸脂全部为色谱纯试剂，购于sigma公司3.标准曲线绘制：a.标准对硝基苯酚母液(2mM，2mmol / L):称取0.02789g的对硝基苯酚(p-NP)溶于100ml 的溶液B（即不同pH的缓冲液），置于棕色试剂瓶内，4℃冰箱保存。
方法一：b.标准曲线绘制：分别取0.02，0.04，0.06，0.08，0.12，0.16ml的对硝基苯酚母液(2mM)，用溶液B（即不同pH 的缓冲液）稀释至4ml，分别测定在410nm处的吸收值。
以对硝基苯酚浓度x（对应浓度分别是0.01，0.02，0.03，0.04，0.06，0.08，单位：mM）为横坐标，吸光值y为纵坐标，绘制标准曲线。
方法二：全部对硝基苯酚经过与测酶活相同的处理，获得吸光度。
b.标准曲线的绘制：分别取0、1.875、3.75、7.5、15、22.5、30、45μL的对硝基苯酚分别加入62.5、60.625、58.75、55、47.5、40、32.5、17.5μL的异丙醇和（全部都是）562.5的溶液B，40℃15min，95%乙醇，10000r / min，3min，测出标准曲线。
脂肪酶活力检测方法分析
▲制备乳化液
第一次制作乳化液选择高速捣碎机。
将４％ＰＶＡ溶液１００ ｍＬ和底物混合，可以在冰箱中静置５￣１０℃保持１￣２ ｈ，随后向捣碎机转移，这样操作９ ｍｉｎ ３次，乳化液可以保存在冰箱中，在之后的每一次使用时重新实施乳化。
第二可以选择乳化液初步选择超定的功率下严格实施超声乳化处理，在对底物乳化温度控制时可以考虑使用水浴，在冰箱中储存乳化液，再一次应用时需要重新实施乳化。
检测脂肪酶活力的方法
▲抽提正己烷方法
在甘氨酸缓冲液中放置１ ｍＬ橄榄油，添加规定数量的酶液在３７℃的情况。
最新脂肪酶酶活测定方法
脂肪酶是一种特殊的水解酶，广泛地存在于动物组织、植物种子和微生物体中，是能水解甘油三酯或脂肪酸酯产生单或双甘油酯和游离脂肪酸，将天然油脂水解为脂肪酸及甘油，同时也能催化酯合成和酯交换的酶。
其在轻工、化工、医药、食品等行业有广泛的用途。
近年来，随着非水酶学和界面酶学的不断深入，脂肪酶应用也不断地扩展，被广泛应用于酯合成、手性化合物的拆分、化工合成中间体的选择性基团保护、高聚物的合成、肽合成等方面，应用前景广阔。
脂肪酶在微生物中有广泛的分布。
脂肪酶催化的反应是:甘油三酸酯+水→甘油二酸酯+游离脂肪酸→甘油酸酯+游离脂肪酸→甘油+游离脂肪酸。
脂肪酶只能在异相系统，即在油-水界面上作用，对水溶性底物无作用，这一点在有机合成中合成手性中间体方面具有很多的优越性。
1 滴定法（参照国家标准，适用于脂肪酶制剂）1.1 脂肪酶活力定义为1g固体酶粉（或1mL液体酶），在一定温度的pH条件下，1min水解底物产生1μmol的可滴定的脂肪酸，即为一个酶活力单位，以u/g（u/mL）表示。
1.2 测定原理脂肪酶在一定条件下，能使甘油三酯水解成脂肪酸、甘油二酯、甘油单酯和甘油，所释放的脂肪酸可用标准碱溶液进行中和滴定，用pH计或酚酞指示反应终点，根据消耗的减量，计算其酶活力。
反应式为：RCOOH+NaOH→RCOONa+H2O。
1.3 仪器设备恒温水浴箱，移液枪，高速匀浆机，pH计，电磁搅拌器1.4 试剂溶液95％酒精4%聚乙烯醇（PVA，聚合度1750±50）：称取4g PVA，加蒸馏水80mL，沸水中加热，并不断搅拌，使其完全溶解，慢速搅拌，以免产生过多气泡，冷却后定容至100mL，用双层纱布过滤后备用。
橄榄油(分析纯)底物溶液：按4%聚乙烯醇：橄榄油=3:1比例混合，用高速匀浆机处理6min（分两次处理，间隔5min，每次处理3min）。
pH7.5磷酸缓冲液：称取十二水磷酸氢二钠39.62g，磷酸二氢钾1.96g，用水溶解并定容至500mL，调节溶液的pH 到7.5±0.05。
分光光度法测定脂肪酶活性的优化研究
１ 概 述
一
该方法在对不 同来 源的脂肪酶活力测定较为常见 ， 但 由于没有统 的国家或地方性 的标 准 ， 该 研究对各个条件进行 了优化 ， 在 该体系 条件下所测酶活 力达 到最大 ，说明此时为最适条件 。从 而建 立一套准 确性高、重现性好的脂肪酶活的测定方法 。
２ 试剂和溶液
５ 天
７天
０ ． ０ ２ ５
０ ． ０ ２ ２
３ ． ７ ０
３ ． ６ ６
高我们实际分析工作中对总氮测定的精密度及准确度 。
５ 消解后 的样 品加入盐酸溶液后比色时间的确定
在Ｈ Ｊ ６ ３ ６ 。 ２ ０ １ ２国标 中并未规 定加入盐 酸后 比色的 时间 ，这就 使 参考文献 ：
其 它条 件如 ３ ，调节水 浴温 度分 别 为 ２ ５ 、３ Ｏ 、３ ５ 、４ ｏ 、４ ５ 、 ５ Ｏ ℃， 考察 反应体 系温度对酶活 力测定 的影 响。
衷 ４ 表 ６
加入盐酸后放置 时间 标样测定浓度值 （ ｍｇ ／ Ｌ ） 相对误 差 （ ％）
ｌ Ｏ ｍｉ ｎ ３ ０ ｍｉ ｎ ３ ． ３ Ｏ ３ ． ４ ８ ８ ３ ３ ． ３
４ ． ３ 反应体 系的 ｐ Ｈ值对测定 结果 的影 响 其它条件如 ３ ，调节缓 冲液 的 ｐ Ｈ值 分别为 ３ 、４ 、５ 、６ 、７ 、８ 、９ 。 考察反应体系 ｐ Ｈ对酶活力测定 的影响 。 ４ ． ４ 反应体系温度对测定结果的影响
３ 仪 器 和 设 备
磁力搅拌器 、高速离心机 、振荡器 、超声仪 、分光光度计等 。
刚 刚接触 总氮分 析 的实验人 员认 为只要加 入盐 酸溶液 后可 以立 即比 色 ，结果会造 成总氮测定结果 偏低。从下表中可 以看 出放置 １ ０ ａ ｒ ｉ ｎ就 比色的标准样 品浓度值 根本不在范围 内，放置 ３ ０ ａ ｒ ｉ ｎ 、１ 小 时、２ 小 时
脂肪酶活力测定方法的改进2
酶是具有生物活性的物质， 其催化性能与酶的质量多少无关， 仅决定于其活性的大 小 & 温 度 过 高 （一 般 超 过 )(@ ） ， 酸碱度 过大， 极少量抑制剂的引入等都会使酶变性、 失活、 降 低 或 失 去 其 催 化 性 能， 这就给酶的活性测定带来了诸多的困难和难度 & 传统的脂肪酶的测定方法中， 需要制备聚乙烯醇橄榄 油 乳 化 液， 产生的脂肪酸用标准碱溶液滴定 & 本实验中没有制备橄榄油 乳化液， 采取将底物橄榄油直接加入到含有脂肪酶的缓冲溶液中， 进行均匀磁力搅拌， 产生脂肪酸用分光光度法检测 &
! &:
脂肪酶活力测定
用胶管将反应器与恒温槽连接， 并调节恒温槽温度至 9> @ & 取 9C%)(C C$% & 0 = * 磷 酸 盐 缓 冲 液 （ ;4 D > & ( ） 和 * C% 橄 榄 油 于
反应器中， 预热 ) 分钟 & 然后用微量进样器注入 ( & *C% 酶溶液， 磁力搅拌 *( 分钟， 立即加 <C% 苯， 继续搅拌 ! 分钟， 终止反应， 同 时萃取生成的脂肪酸 & 将溶液转移至离心试管中， 在 :(((K F CLJ 下离心 *( 分钟， 有机相和水相分层澄清 & 取上层有机相 :C% 于小锥形瓶中， 加 *C% 显色剂在磁力搅拌器上搅拌 9 分钟， 产生的脂肪酸与 6H! I 生成绿色络和物 & 取上 层含有脂肪酸铜的苯溶液， 用分光光度计在 >*( JC 波长下测其 吸 光 度 & 以 同 法 制 备 但 不 含 脂 肪 酶 的 空 白 溶 液 为 参 比， 对照脂 肪酸吸光度工作曲线， 既可求得脂肪酸的浓度 & 由脂肪酶活力定义得活力计算公式
脂肪酶活检测原理及方法
脂肪酶活检测原理及实际方法：一、原理以及标准曲线做法1.对硝基苯酚酯（4-Nitrophenyl ester）是脂肪酶水解活力测定中运用最为广泛的一种底物，脂肪酶水解其产生pNP（对硝基苯酚）在碱性条件下显黄色，在410nm下有吸光值，且灵敏度很高。
2.所需试剂有：CAS 碳链长度出货号价格名称830-03-5 C2 N8130-1G ￥462 对硝基苯乙酸酯2635-54-9 C4 N9876-1G ￥570 对硝基苯丁酸酯1956-10-1 C8 21742-1G-F ￥487 对硝基苯辛酸酯1956-11-2 C12 61716-1G ￥435 对硝基苯月桂酸酯1492-30-4 C16 N2752-1G ￥379 对硝基苯棕榈酸酯14617-86-8 C18 N3627-1G ￥2621.97 对硝基苯硬酸脂全部为色谱纯试剂，购于sigma公司3.标准曲线绘制：a.标准对硝基苯酚母液(2mM，2mmol / L):称取0.02789g的对硝基苯酚(p-NP)溶于100ml的溶液B（即不同pH的缓冲液），置于棕色试剂瓶内，4℃冰箱保存。
方法一：b.标准曲线绘制：分别取0.02，0.04，0.06，0.08，0.12，0.16ml的对硝基苯酚母液(2mM)，用溶液B（即不同pH的缓冲液）稀释至4ml，分别测定在410nm处的吸收值。
以对硝基苯酚浓度x（对应浓度分别是0.01，0.02，0.03，0.04，0.06，0.08，单位：mM）为横坐标，吸光值y为纵坐标，绘制标准曲线。
方法二：全部对硝基苯酚经过与测酶活相同的处理，获得吸光度。
b.标准曲线的绘制：分别取0、1.875、3.75、7.5、15、22.5、30、45μL的对硝基苯酚分别加入62.5、60.625、58.75、55、47.5、40、32.5、17.5μL的异丙醇和（全部都是）562.5的溶液B，40℃15min，95%乙醇，10000r / min，3min，测出标准曲线。
脂肪酶酶活测定方法
附录A(规范性附录)脂肪酶酶活测定方法A.1 原理碱性脂肪酶可将甘油酯（油、脂）水解，在不同阶段可释放出脂肪酸、甘油二酯、甘油单酯及甘油。
水解生成的脂肪酸，可以用标准的碱溶液滴定，以滴定值表示酶活力。
反应式为：RCOOH+NaOH RCOONa+H2OA.2 适用范围本规定仅适用于脂肪酶对油脂水解活性测定方法。
A.3 用语定义A.3.1 酶活在一定条件下（温度36℃和pH9.4），水解甘油三酯每分钟生成1μmol脂肪酸的酶量，即为一个国际单位，以u/ml或者u/g表示。
A.3.2 基质被酶水解的物质，又称为底物。
A.4 试剂A.4.1 0.05 mol/LGly-NaOH缓冲液（pH9.4）A液：0.2 mol/L NaOH，称取NaOH（A.R）8.0 g，用蒸馏水定容至1000 ml；B液：0.2 mol/L Gly，称取甘氨酸15.014 g，用蒸馏水定容1000 ml；使用前取A液16.8 ml + B液50 ml，加部分蒸馏水稀释，再用酸度计调节pH至9.4，定容到200 ml。
A.4.2 橄榄油分析纯。
A.4.3 4%聚乙烯醇（PVA）溶液称取聚乙烯醇40 g（聚合度1750+50），加1000 ml 0.05 mol/L pH 9.4Gly - NaOH 缓冲液，沸水浴完全溶解后，冷却，必要时过滤，溶解过程中蒸发的水分要用蒸馏水补充，定容至1000 ml。
A.4.4 乙醇含量在95 %以上，为分析纯。
A.4.5 0.01 mol/L NaOH称取0.40 g A.R的NaOH，溶于新制备的冷却蒸馏水中并定容至1000 ml，置冰箱。
取分析纯邻苯二甲酸氢钾（A.R）少量于称量瓶中，105℃烘干至恒重（约2小时），然后称取4份，每份各0.600 g，分别放入4个100ml容量瓶中，加蒸馏水定容至刻线，溶解后，分别取10ml至4个250ml的三角瓶中，各取加入40 ml蒸馏水，摇允后，加三滴1 ％酚酞，用待标定的NaOH溶液滴定至微红，即为终点。