Takara RT-PCR Kit
从培养细胞中制备品质良好的RNA模板-Takara试剂盒
Code No. 3732 研究用CellAmp™Direct RNA Prep Kitfor RT-PCR (Real Time)说明书目录内容页码●制品说明 1 ●制品内容 1 ●保存 1 ●试剂盒外必备主要试剂 1 ●使用注意 1 ●操作方法 2 ●附录 3 ●实验例9 ● Troubleshooting 10 ●关联产品10●制品说明本制品是从96孔板或其他各种培养板中培养的动物细胞中提取One Step或Two Step Real Time RT-PCR （又称qRT-PCR或RT-qPCR）反应用的RNA模板的试剂盒。
本试剂盒由三种溶液组成，快捷方便，操作简单，可在10分钟内完成从培养细胞中制备品质良好的RNA模板。
使用本试剂盒制备的RNA模板可与One Step TB Green® PrimeScript™RT-PCR Kit (Code No. RR066A/B) 等One Step Real Time RT-PCR试剂组合使用，2小时内便可完成基因表达分析。
本试剂盒与反转录试剂PrimeScript RT reagent Kit（Perfect Real Time）组合使用，可在30分钟内制备出用于Real Time PCR (qPCR) 的cDNA模板。
本试剂盒可以从微量的细胞中提取RNA模板，并用于基因解析和Real Time RT-PCR的高灵敏度检出。
在对无法设计跨内含子引物的基因或低表达量的基因进行分析时，基因组DNA的混入对实验结果影响很大。
本试剂盒可以有效去除基因组DNA，大大提高了实验结果的准确性。
●制品内容（200次量）*CellAmp Washing Buffer 12.5 ml×2CellAmp Processing Buffer 10 mlDNase I for Direct RNA Prep 200 μl*使用96孔板时，200孔培养细胞的反应次数。
TaKaRa一步法RT-PCR提取法
0.5 μl
PrimeScript RT Enzyme Mix Ⅱ
0.5 μl
PCR Forward Primer（10 μM）
0.5 μl 0.2 μM*1
PCR Reverse Primer（10 μM）
0.5 μl 0.2 μM*1
TaqMan® Probe
1 μl*2
Total RNA
2 μl*3
独自开发的 Buffer 系统相结合，具有高扩增效率，高扩增灵敏度之特点。 3. One Step RT-PCR Buffer III 是一种 2×浓度的 Premix Type 试剂，操作简单，能有效避免污染。
● 使用注意
以下为使用本试剂盒时的注意事项，使用前请一定认真阅读。 1） 当同时需要进行数次 Real Time One Step RT-PCR 反应时，应先配制各种试剂的混合液（Master
Takara RT-PCR Kit
Code No.：DRR019ARNA PCR Kit (AMV) Ver.3.0（100次量）目录内 容 页 码 ●制品说明 1●制品内容 1●保存 2●RNA PCR原理 2●试剂盒特点 3●RNA样品制备 4●使用注意 4●引物选择 5 ●实验操作 5●Q&A9●参考文献 9●制品说明PCR（Polymerase Chain Reaction；聚合酶链式反应）是一种体外扩增DNA的简单而有效的方法。
虽然原理上PCR法是扩增DNA，RNA不能直接被扩增，但是经过反转录酶的作用把RNA反转录成cDNA 后，PCR法便可应用于RNA的解析了。
迄今为止，此方法已广泛应用于RNA的构造解析、cDNA的克隆及RNA水平上的表达解析等多种领域。
TaKaRa RNA PCR Kit Ver.3.0是使用AMV（Avian Myeloblastosis Virus）由来的反转录酶将RNA合成cDNA，然后在同一反应管中使用Hot Start PCR用TaKaRa Ex Taq HS DNA聚合酶扩增此cDNA的RT-PCR试剂盒。
本试剂盒含有从RNA到cDNA，然后使用PCR法扩增此cDNA所需的全部试剂。
本试剂盒中的Oligo dT-Adaptor Primer的独特设计，大大地提高了Poly(A )+ RNA 3′端区域的cDNA合成效率。
Hot Start PCR用DNA聚合酶TaKaRa Ex Taq HS的应用，大大地增加了本试剂盒的扩增性能。
●制品内容（100次量）1. AMV Reverse Transcriptase XL（5 U/µl） 50 µl（Avian Myeloblastosis Virus来源）2. RNase Inhibitor（40 U/µl） 25 µl3. Random 9 mers（50 pmol/µl） 50 µl4. Oligo dT-Adaptor Primer（2.5 pmol/µl） 50 µl5. RNase Free dH2O 1 ml6. TaKaRa Ex Taq®HS（5 U/µl） 40 µl7. M13 Primer M4（20 pmol/µl） 50 µl8. 10×RT Buffer 1 ml[100 mM Tris-HCl（pH8.3），500 mM KCl]9. 5×PCR Buffer 1 ml10. dNTP Mixture（各10 mM） 150 µl11. MgCl2（25 mM） 1 ml12. Control R-1 Primer（20 pmol/µl） 25 µl（Positive Control RNA下游引物）13. Control F-1 Primer（20 pmol/µl） 25 µl（Positive Control RNA上游引物）14. Positive Control RNA（2×105 copies/µl） 25 µl（Transcribed poly(A)+ RNA of pSPTet3 plasmid）【各种引物序列】引物名称 各引物序列Random 9 mers 5′-（P）NNNNNNNNN-3′Oligo dT-Adaptor Primer 包含dT区域及M13 Primer M4序列。
宝生物荧光定量PCR使用说明
Code No.：DRR041ASYBR® Premix Ex TaqTM （Perfect Real Time） (200 次量)目内 容●制品说明 ●制品内容 ●适用的 Real Time PCR 扩增仪 ●保 存录页 码1 1 1 1 1 1 2 2 2 2 3 3 3●TaKaRa Ex TaqTM HS活性定义 ●纯 度●Real Time PCR 性能检测 ●试剂盒原理 ●试剂盒特长 ●操作注意 ●Real Time PCR 操作顺序 ●操作方法 ◆应用 Thermal Cycler Dice Real Time System 扩增仪的操作方法 ◆应用 ABI PRISM 7000/7700/7900 HT， 7300/7500/7500 Fast Real - Time PCR 的操作方法 ◆应用 Light Cycler Real Time PCR 扩增仪的操作方法 ◆应用 Smart Cycler II System Real Time PCR 扩增仪的操作方法 ◆应用 Mx3000P Real Time PCR 扩增仪的操作方法 ●PCR 反应条件说明 ●实验例 ●进行 RT-PCR 反应时的实验方法 ●引物设计说明 ●引物设计服务说明： 本公司提供用于基因表达定量分析的引物设计及合成服务 ●问 答4 5 7 8 9 9 11 1314 14◆特别提示： 本制品请于 4℃避光保存，避免冻结制品！●制品说明本制品是采用SYBR® Green I嵌合荧光法进行Real Time PCR的专用试剂。
制品中已经将DNA聚合酶、反 应用Buffer、dNTP、SYBR® Green I等试剂预混在一起，是一种 2×浓度的Premix Type试剂，进行实验 时，PCR反应液的配制十分方便简单。
制品中的DNA聚合酶使用了改良后的Hot Start法用 DNA聚合酶TaKaRa Ex TaqTM HS，与TaKaRa精心研制的Real Time PCR用Buffer组合使用，可以有效抑制非特异性的PCR扩增，大大提高PCR的扩增效率，进行高灵敏度的Real Time PCR扩增反应。
天根 一步法逆转录PCR试剂盒说明书
通用型一步法RT-PCR试剂盒说明书前言本试剂盒适用于对各种动、植物、病毒RNA进行PCR 检测。
用户可根据被分析基因，配合一对引物，或同时采用Taqman 荧光探针，先将提取的RNA反转录(reverse transcription).成cDNA，再经过聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)技术对特异性片段进行扩增，进行电泳或实时荧光分析。
一步法RT-PCR可使RT及PCR过程在单管中完成，比分开进行RT及PCR更方便。
由于不需要在RT完成后打开反应管，尽可能地避免了样品间的相互污染。
规格20人份适用仪器适用于各种普通PCR仪器和实时荧光PCR仪器。
试剂盒组成试剂准备根据下表配制反应液：振荡混匀后，按每管 40 μl(可根据需要调整)分装，备用。
PCR扩增将均一化后的RNA提取样本10 μl加入各反应管，混匀、离心后，置普通PCR仪器或实时荧光PCR仪器上进行扩增及实时检测。
结果判断扩增产物可直接进行电泳检测；实时荧光检测可根据相应仪器的配套软件进行结果分析。
保存及有效期-20℃保存，有效期为6个月。
注意事项1. 开始检测前请仔细阅读本说明书全文。
2. 整个检测过程中，反应体系的配制、样本处理及加样、PCR扩增（荧光检测）应分区进行以避免污染。
3. 操作人员应戴口罩，经常更换一次性手套，以避免RNA酶的污染；实验中所用器具均应经过除RNA酶处理。
4. 试剂盒组成中的试剂使用前应充分融化并混匀。
5. 进行实时荧光分析时，应使用透光性能较好的一次性薄壁离心管；.荧光探针应避光保存，加入缓冲液中后，应尽快进行扩增。
6. 注意适当处理检测中遗留的样品、扩增产物及可能被污染的试剂。
生产企业：上海蓝创生物科技发展有限公司。
一步法RT-PCR说明书
TaKaRa PrimeScript TM One Step RT-PCR Kit Ver.2
试剂盒使用说明书
该试剂盒采用一步（One step）RT-PCR法。
RNA→cDNA →PCR反应操作在同一反应体系中连续进行，反应中途不需添加任何试剂。
实验操作
1.配制RT-PCR反应液，以n个反应管为例。
首先，配制如下混合体系，混匀后分加到n个PCR反应管中。
RNase Free dH2O 20μI X (n+1)
2x1 Step Buffer 25μI X (n+1)
PrimeScript 1 Step Enzyme Mix 2μI X (n+1)
其次，向PCR反应管中加入欲检测病原的扩增引物（即上下游引物）和样品抽提RNA。
上游引物1μI
下游引物1μI
样品RNA 1μI
总体系：50 μI
2．进行RT-PCR反应
50℃30 min
94℃ 2 min
94℃30 sec
50～65℃（以相应的引物而定） 30 sec 30 循环 72℃ 1 min
72℃ 10 min
试剂盒自带有确保试剂有效性的阳性对照RNA以及相应的扩增引物（Positive Control RNA, Control F-1 Primer, Control R-1 Primer）,扩增产物为462bp。
扩增后如果试剂盒阳性对照电泳结果为阳性说明试剂盒所有试剂有效，RT-PCR反应液体系没问题。
TaKaRa定量PCR介绍
Gene Specific Primer
Oligo dT Primer
PCR F-Primer
PCR R-Primer
实时荧光定量PCR介绍
February 17, 2019
•
24
RT Primer的选择
Random
5’
5’
F
目的片段 Random 目的片段
R
F
1,500 base
目的片段
R
5’
F
R
目的片段在mRNA任何位 3’ 置都能使用。通常mRNA 表达量分析最适。 适用于mRNA表达量分析， AAA· · · 3’ 提升反应检测的灵敏度。 Oligo dT Primer Oligo dT Primer 目的片段在距Poly(A) Tail AAA· · · 3’ 1.5 kbp 以内适用，RT效率 较高。
exon
cDNA
exon
PCR Primer exon intron
Real Time PCR
PCR Primer exon
Real Time RT-PCR
Small PCR Product
融 解 曲 线 分 析
Small PCR Product
此种情况必须采用DNase I 处理，去除基因组DNA。
PCR Primer exon exon
Real Time RT-PCR
Real Time PCR
No Product
融 解 曲 线 分 析
Small PCR Product
实时荧光定量PCR介绍
February 17, 2019
•
28
Real Time PCR引物设计
takara反转录试剂盒说明书
takara反转录试剂盒说明书说明书一、产品简介takara反转录试剂盒是一种高效、可靠的反转录试剂盒，适用于转录RNA为cDNA的实验操作。
本试剂盒由takara公司制造，经过严格的质量控制，确保产品的稳定性和可靠性。
二、试剂盒组成本试剂盒包含以下组分：1. 反转录酶：高效反转录酶，能在广泛的实验条件下进行反转录反应。
2. 基质：提供反应所需的核酸和其他辅助物质。
3. 标记物：用于标记反转录产物的荧光染料或放射性同位素。
4. 缓冲液：维持试剂盒中酶的活性，调节反应条件的缓冲体系。
5. 控制样品：用于检验试剂盒的反应效果和稳定性。
三、实验操作1. 准备工作在进行实验前，请准备所需的实验仪器和试剂，确保实验环境的清洁和无菌，避免污染对实验结果的影响。
2. RNA提取使用适当的方法提取目标RNA样本，并在提取过程中避免RNA的降解。
3. 反转录反应将提取的RNA样本与反转录试剂盒中的反转录酶、基质和缓冲液按推荐比例混合，并在适当的温度下进行反应。
反应时间根据样本的RNA含量和实验要求确定。
4. 停止反应通过停止反应来终止反转录反应，一般使用热敏感性酶来达到这个目的。
5. 产物处理反转录产物可以直接用于下游实验，如实时定量PCR、聚合酶链式反应等，也可以进行储存和后续处理。
四、实验结果解读根据试剂盒的使用目的和实验设计，对反转录产物进行相应的分析和解读。
常见的分析方法有凝胶电泳、实时定量PCR和测序等。
根据实验结果，可以得到RNA的表达情况、差异表达基因等相关信息。
五、注意事项1. 试剂保存：请按照试剂盒上的说明保存试剂，避免暴露在高温、冻融循环和光照等不利条件下。
2. 操作规范：请按照本说明书中提供的实验操作步骤进行操作，避免实验误差对结果的影响。
3. 质量控制：在每次实验中，请使用合适的阳性和阴性对照样品，以确保实验结果的准确性和可靠性。
4. 废弃物处理：请将使用过的试剂和实验废弃物按照相关规定进行处理，避免对环境造成污染。
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Code No.：DRR019ARNA PCR Kit (AMV) Ver.3.0（100次量）目录内 容 页 码 ●制品说明 1●制品内容 1●保存 2●RNA PCR原理 2●试剂盒特点 3●RNA样品制备 4●使用注意 4●引物选择 5 ●实验操作 5●Q&A9●参考文献 9●制品说明PCR（Polymerase Chain Reaction；聚合酶链式反应）是一种体外扩增DNA的简单而有效的方法。
虽然原理上PCR法是扩增DNA，RNA不能直接被扩增，但是经过反转录酶的作用把RNA反转录成cDNA 后，PCR法便可应用于RNA的解析了。
迄今为止，此方法已广泛应用于RNA的构造解析、cDNA的克隆及RNA水平上的表达解析等多种领域。
TaKaRa RNA PCR Kit Ver.3.0是使用AMV（Avian Myeloblastosis Virus）由来的反转录酶将RNA合成cDNA，然后在同一反应管中使用Hot Start PCR用TaKaRa Ex Taq HS DNA聚合酶扩增此cDNA的RT-PCR试剂盒。
本试剂盒含有从RNA到cDNA，然后使用PCR法扩增此cDNA所需的全部试剂。
本试剂盒中的Oligo dT-Adaptor Primer的独特设计，大大地提高了Poly(A )+ RNA 3′端区域的cDNA合成效率。
Hot Start PCR用DNA聚合酶TaKaRa Ex Taq HS的应用，大大地增加了本试剂盒的扩增性能。
●制品内容（100次量）1. AMV Reverse Transcriptase XL（5 U/µl） 50 µl（Avian Myeloblastosis Virus来源）2. RNase Inhibitor（40 U/µl） 25 µl3. Random 9 mers（50 pmol/µl） 50 µl4. Oligo dT-Adaptor Primer（2.5 pmol/µl） 50 µl5. RNase Free dH2O 1 ml6. TaKaRa Ex Taq®HS（5 U/µl） 40 µl7. M13 Primer M4（20 pmol/µl） 50 µl8. 10×RT Buffer 1 ml[100 mM Tris-HCl（pH8.3），500 mM KCl]9. 5×PCR Buffer 1 ml10. dNTP Mixture（各10 mM） 150 µl11. MgCl2（25 mM） 1 ml12. Control R-1 Primer（20 pmol/µl） 25 µl（Positive Control RNA下游引物）13. Control F-1 Primer（20 pmol/µl） 25 µl（Positive Control RNA上游引物）14. Positive Control RNA（2×105 copies/µl） 25 µl（Transcribed poly(A)+ RNA of pSPTet3 plasmid）【各种引物序列】引物名称 各引物序列Random 9 mers 5′-（P）NNNNNNNNN-3′Oligo dT-Adaptor Primer 包含dT区域及M13 Primer M4序列。
Control F-1 Primer 5′-CTGCTCGCTTCGCTACTTGGA-3′Control R-1 Primer 5′-CGGCACCTGTCCTACGAGTTG-3′M13 Primer M4 5′-GTTTTCCCAGTCACGAC-3′-1-本试剂盒中的Control RNA是以pSPTet3质粒（质粒中的SP6启动子下游插入长约1.4 kbp的pBR322来源的DNA片段，其DNA片段上含有抗四环素基因）为模板由SP6 RNA聚合酶经体外转录而得到的。
Control RNA（约1.4 kb）是带有30个A碱基的具有Poly(A)+ 尾的RNA。
当把Control RNA经RT-PCR合成的双链cDNA插入质粒时，该质粒便可获得四环素抗性。
Control RNA简图见图1。
图1. Positive Control RNA：使用各种引物所能扩增的DNA片段●保 存： -20℃●RNA PCR原理本试剂盒使用AMV由来的反转录酶由RNA合成cDNA，并可在同一反应管中使用TaKaRa Ex Taq HS 扩增此cDNA。
Random 9 mers、Oligo dT-Adaptor Primer或特异性下游引物等均可作为反转录引物用于cDNA合成。
Oligo dT-Adaptor Primer同时适用于3′-RACE实验。
图2. RNA PCR原理-2--3-●RNA样品制备本试剂盒是把RNA合成cDNA，然后再对此cDNA进行扩增的试剂盒。
RNA的纯度会影响cDNA的合成量，而制备RNA的关键是要抑制细胞中的RNA分解酶和防止所用器具及试剂中的RNA分解酶的污染。
因此，在实验中必须采取以下措施：戴一次性干净手套；使用RNA操作专用实验台；在操作过程中避免讲话等等。
通过以上办法可以防止实验者的汗液、唾液中的RNA分解酶的污染。
【使用器具】尽量使用一次性塑料器皿，若用玻璃器皿，应在使用前按下列方法进行处理。
（1） 用0.1% DEPC（焦碳酸二乙酯）水溶液在37℃下处理12小时。
（2） 然后在120℃下高压灭菌30分钟以除去残留的DEPC。
RNA实验用的器具和仪器建议专门使用，不要用于其它实验。
【试剂配制】用于RNA实验的试剂，须使用干热灭菌（180℃，60 min.）或用上述方法进行DEPC水处理灭菌后的玻璃容器盛装（也可使用RNA实验用的一次性塑料容器），使用的无菌水须用0.1%的DEPC处理后进行高温高压灭菌。
RNA实验用的试剂和无菌水都应专用，避免混用后交叉污染。
【制备方法】使用简单的RNA纯化方法即可获得满足于RT-PCR反应的RNA（只需少量的RNA便可进行RT-PCR 反应）。
但为了保证实验的成功率，建议使用GTC法（异硫氰酸胍法）制备的高纯度RNA。
使用Catrimox-14TM RNA Isolation Kit Ver.2.11（TaKaRa Code DWA005）可从血液中快速提取高纯度的Total RNA。
使用本试剂盒进行RT-PCR反应时，每次反应所需的最适Total RNA量约为500ng。
●使用注意以下为使用本试剂盒时的注意事项，使用前一定认真阅读。
1） 当同时需要进行数次反转录反应或PCR反应时，应先配制各种试剂的混合液 (Master Mix；其中包括RNase Free dH2O、Buffer、dNTP Mixture、MgCl2等），然后再分装到每个反应管中。
这样，可使所取的试剂体积更准确，减少试剂损失，避免重复分取同一试剂。
同时也可以减少实验操作或实验之间产生的误差。
2） 使用Reverse Transcriptase（AMV）、RNase Inhibitor、TaKaRa Ex Taq®HS酶等酶类时，应轻轻混匀，避免起泡；分取之前要小心地离心收集到反应管底部；由于酶保存液中含有50%的甘油，粘度高，分取时应慢慢吸取。
3） 酶制品应在实验前才从-20℃中取出，使用后也应立即放回-20℃中保存。
4） 为了防止Positive Control RNA分解，应尽量避免反复冻融。
有条件的实验室最好保存于 -70℃～-80℃。
5） 分装试剂时务必使用新的枪头（Tip），以防止样品间污染。
6） 最佳的PCR条件，因PCR扩增仪的不同而不同，所以在使用您的样品之前最好先试做一下Control 反应，以确定最佳的PCR条件。
-4-●引物选择用于反转录的引物可视实验具体情况选择Random 9 mers、Oligo dT-Adaptor Primer或特异性下游引物。
对于不具有Hairpin构造的短链mRNA，3种引物中的任何一种都可以使用，但一般应按以下方法进行选择。
Random 9 mers适用于长的或具有Hairpin构造的RNA。
包括rRNA、mRNA、tRNA 等在内的所有RNA的反转录反应都可使用本引物。
用Random 9 mers合成的cDNA进行PCR反应时，必须使用特异 性引物。
Oligo dT-Adaptor 适用于具有Poly(A)+ Tail的RNA。
(注意：原核生物的RNA、真核生 Primer 物的rRNA及tRNA以及某些种类的真核生物的mRNA不具有Poly(A)+ Tail）。
本Primer设计巧妙，反转录效率高。
反转录反应后，可用M13 Primer M4进行3′-RACE实验。
特异性下游PCR Primer 因其必须与模板序列互补，所以只适用于Target序列已知的情况。
（PCR时的下游引物）●实验操作1.使用Positive Control RNA时的RT-PCR实验例① 合成cDNA的引物可结合实际情况从Oligo dT-Adaptor Primer、Random 9 mers或ControlR-1 Primer中任选一种。
②① 按下列组成配制PCR反应液。
5×PCR Buffer 10 µl灭菌蒸馏水 28.75 µlTaKaRa Ex Taq®HS 0.25 µlControl F-1 Primer 0.5 µlControl R-1 Primer 0.5 µl或特异性下② 按以下条件进行反转录反应。
的42RNA(＞*5 PCR条件设定■退火温度可根据实际情况适当地提高或降低退火温度(50℃～65℃)。
■延伸时间延伸时间因目的序列长度的不同而不同，通常TaKaRa Ex Taq®HS按1 kbp/min.设定延伸时间。
■循环次数cDNA量较少时，循环次数可增加为40～50次。
④ 反应结束后，取PCR反应液（5～10 µl）进行琼脂糖凝胶电泳，确认PCR反应产物。
如果此PCR产物需用于以后实验，须将PCR产物冷冻保存。
3.3′-RACE法实验例▲Sample RNA： Human HL60 Total RNA▲Target cDNA： Transferrin receptor（TFR）▲扩增DNA片段大小： 522 bp图3. 对HL60全RNA使用3′-RACE法进行RT-PCR反应图解A．反转录反应按下列组成配制反转录反应液。