真菌检验
真菌的微生物检验
§ 多细胞真菌由菌丝和孢子组成
菌丝分枝交织成团，形成菌丝体（Mycelium）， 并长有各种孢子，这类真菌即一般称为霉菌（Mold）。
§ 由于生活环境（如营养、温度、氧气等）的 改变，有些真菌的孢子与菌丝两种形态可以
互变，这类真菌称为二相性真菌（dimorphic fungus），如球孢子菌、组织胞浆菌及芽生 菌。
多见
无
单纯菌丝
PPT文档演模板
真菌的微生物检验
（二）检验方法：
§ 1．直接镜检：直接采取病变部位的标本，用显微镜检 查有无菌丝及孢子的存在，本法迅速简便，是临床真 菌检查最常用的方法
PPT文档演模板
真菌的微生物检验
2．分离培养：
取毛发、皮屑、甲屑等标本，用70％乙醇 消毒，接种沙保氏琼脂斜面培养基，25℃培养 7～14天，根据菌落形态及颜色、并挑取菌落 镜检菌丝及孢子的特征进行鉴定。
PPT文档演模板
真菌的微生物检验
（二）致病性和免疫性
§白色念珠菌可侵犯人体许多部位，可引起：
1. 皮肤念珠菌病：好发于皮肤皱褶处； 2. 粘膜念珠菌病：鹅口疮、口角炎、阴道炎最多见。 3. 内脏及中枢神经念珠菌病：肺炎、肠胃炎、心内膜
炎、脑膜炎、脑炎等。
§机体可产生一定免疫力。
PPT文档演模板
真菌的微生物检验
§ 深部真菌可用血琼脂或脑心葡萄糖血琼 脂37℃培养；
PPT文档演模板
真菌的微生物检验
（三）免疫学试验
§用于检测深部感染真菌的抗体，作为辅助诊 断组织胞浆菌、念珠菌、曲霉菌。
§检测深部感染真菌的抗原，用于早期、快速、 特异的诊断。
▪ 乳胶凝集法检测新型隐球菌病患者的荚膜多糖抗原 ▪ ELISA法检测白色念珠菌感染者的甘露聚糖抗原 ▪ 免疫荧光法检测孢子丝菌病患者的可溶性抗原
检验科真菌检验流程PIM
深部感染分布于自然界，如土壤、腐败有机物、粮食和饲料等，有时也存在 于正常人体的皮肤和粘膜表面。
（一）分类和命名
其中大多数曲霉只发现了无性阶段，它们归属于半知菌亚门、丝孢菌纲、 丝孢菌目、丛梗孢科，少数种具有性阶段归入子囊菌亚门、不整子囊菌 纲、散囊菌目、散囊菌科。其中对人致病的曲霉主要有烟曲霉
全国临床检验操作规程
真菌病原学检验程序
临床标本
直接检查
分子生物学检测 直接镜检
经固定标本染色 墨汁法 法：亚甲蓝染色 染色法 法、革兰染色法、 P法A。S、荧光染色脑 痰 脓
脊 液汁 液
动
分离培养
物
实
沙氏培养基 验
KOH法
25°C 37°C
毛发 指甲 皮屑 脓汁 痰液
观察菌落 菌丝型 酵母型
镜 小生 检 培化
曲霉可侵犯机体许多部位，尤其是呼吸系统，引起肺曲霉病。曲霉可局限在肺内感 染也可播散到其他器官，甚至引起全身性感染。曲霉还可诱发超敏反应引起过敏性 支气管肺曲霉病。
有些曲霉可产生毒素引起食物中毒，有的毒素如黄曲霉毒素、杂色曲霉素有致癌作 用，特别是黄曲霉毒素与人类原发性肝癌的发生密切有关。
深部感染真菌检验
养反 应
病
检
检
理
测
测
组
抗
抗
织
原
体
标
本
葡聚糖
PAS
HE 甘露聚糖
全国临床检验操作规程（第四版） 783页图4-6-1
2015年3月第一版
真菌鉴定程序
标本的采集、运送和保存
检验真菌的方法
检验真菌的方法
1. 直接镜检法：将短柄棉签蘸取患部分泌物、皮屑、毛发等样本，涂于玻璃片上，用40倍至100倍的显微镜下观察，检测真菌的形态和数量。
2. 细胞学检查法：可采用细胞学方法检查骨髓、淋巴结等组织样本中是否存在真菌，包括涂片法、细胞学初筛法、细胞学制片法等。
3. 培养法：将样本接种于含有丰富营养成分的培养基上，利用真菌的生长特点判定是否存在真菌的培养。
4. 核酸检测法：查找真菌的DNA或RNA序列，并使用PCR 技术的手段拓展浓度，最后用电泳技术侦察出真菌的情况。
5. 基于免疫学的检测：包括诸如ELISA和荧光法等方法，主要检测真菌产生的免疫球蛋白或抗原，以用于检测真菌是否存在。
真菌感染检验
浅部感染真菌检验-皮肤癣菌
❖ （三）真菌检验
❖ 1.标本的采集、运送和保存
❖ 1）甲标本 采集标本前用75%乙醇彻底清洁病甲，以 减少培养时的细菌污染，提高镜检的阳性率。钝刀用 高压或者火焰灭菌，从甲的变色、萎缩或变脆部位、 健甲与病甲的交界处取材，保证一定量与一定深度标 本。甲标本建议取材后立刻进行真菌镜检及培养，甲 标本应尽量剪碎后接种。对于伴有甲沟炎患者的取材 ，应采用棉拭子，75%乙醇清洁局部后沾取损害分泌 物，每位患者至少应取两个拭子，放入无菌试管中以 备镜检和培养。
❖ 侵入表皮后，在皮肤角质层外2/3处生长、繁殖，引起一 种慢性、无症状或轻微症状的皮肤斑疹，呈灰白色、褐 色或淡黄色，上面附着细小糠皮样鳞屑，有时可融合成 片，似汗渍斑点，俗称汗斑即花斑癣（tinea versicolor）。皮损最常见于胸、背、臂的上半部皮脂 腺丰富部位。病程缓慢，多年不愈，对健康无碍，但影 响美观。油性皮肤易感，而且与遗传、免疫缺陷等因素 有关，诱发因素为高温多汗。近年大量研究显示，糠秕 马拉癣菌还可引起毛囊炎，可能为脂溢性皮炎的重要发 病原因之一。
浅部感染真菌检验-皮肤癣菌鉴定
❖ 1.毛癣菌属 在SDA（加CCG）上27+1℃培养，毛癣菌 属菌落生长速度慢到中等；质地光滑到毛状；表面呈 白色、黄色、米黄色或红紫色，背面呈苍白色、黄色 、褐色或红褐色。显微镜下大分生孢子呈多细胞、圆 柱状、棒状或香烟形，壁光滑，常缺乏。小分生孢子 呈单细胞、圆形、梨形或棒形，孤立或像葡萄状群生 。有时存在关节型孢子和厚膜孢子。
浅部感染真菌检验-皮肤癣菌
❖ （三）真菌检验
❖ 1.标本的采集、运送和保存
❖ 2）皮屑标本 采集标本前用75%乙醇清洁取材区域。 用高压或者火焰灭菌钝刀，从损害的边缘向外刮取或 用剪刀剪去疱顶。如果鳞屑量较少或婴幼儿患者，可 采用粘着透明胶带或粘着皮肤采样送检，将透明胶带 粘着面紧压于损害之上，然后剥下，将粘着面向下贴 在透明载玻片上送检。皮屑标本建议取材后立刻进行 真菌镜检及培养。
真菌检验
蒸馏水100 ml配制：用蒸馏水将氯化钠溶解即可。 25、观察菌落形态时应注意什么？ 观察菌落形态时应注意：（1）菌落性质，是酵母菌还是霉菌；（2） 菌落大小，一般病原性真菌菌落小，而条件致病性真菌菌落大；（3） 菌落颜色，一般病原性真菌颜色淡，污染真菌颜色深。（4）致病性 真菌菌落下沉，污染性真菌菌落不下沉；致病性真菌有时使培养基 开列，但污染霉菌很少引起培养基开列。 26、分离皮肤真菌的皮肤真菌实验培养基是什么？ 培养基是：（DTM）含蛋白胨、葡萄糖、酚红、放线菌酮、庆大霉素、 四环素等成分。由于皮肤真菌的代谢产物呈碱性，以致其生长周围 的培养基呈红色。 27、分离新生隐球菌的选择培养基是什么？ 分离新生隐球菌的选择培养基是左旋多巴-枸橼酸铁和咖啡酸培养 基，因新生隐球菌有酚氧化霉（Plrno oxidase）活性，此霉与左旋 多巴和枸橼算铁反映时，能氧化O-联苯酚形成黑素而呈褐色至黑色， 或酚氧化霉和咖啡酸作用而显棕色菌落。 28、真菌培养的方法有几种？各自优缺点是什么？ 培养方法有平皿培养、大试管培养和玻片培养等。平皿培养的优点 是表面较大可使标本散布，便于观察菌落形态，但水分易蒸发，只 能培养生长繁殖较快的真菌，如假丝酵母菌、隐球菌。大试管培养 的优点是水分不易蒸发，主要用于皮肤癣菌的培养和真菌菌种的保 存。玻片培养（为量培养、小培养）是将培养皿的真菌培养切成一 个1cm*1cm的小方块在无菌载玻片中央，然后将真菌点种于小方块培 养基的一侧，再盖上无菌盖玻片后培养，培养后将其盖玻片放入另 一载玻片上于显微镜下观察菌丝和孢子，可用于真菌菌种的鉴定。 29、真菌的生化反映有哪些？ 检验真菌常用的生化反映有糖（酵）类发酵试验、同化碳源试验、 同化氮源试验或利用硝酸钾试验、牛乳分解试验、酚氧化酶试验、 明胶液化试验和脲酶试验等。主要用于检验深部感染的真菌。 30、配置培养基的一般步骤是什么？ （1）按要求称取脱水培养基，倒入所要求量的蒸馏水中，反复搅拌 使各成分混合成均匀混悬液。（2）各成分混合均匀后以文火缓慢加 热并不断搅拌，煮沸1 min，不能过热，以免破坏有效成分。（3） 分装试管应在高压灭菌前，而分装平皿应在高压灭菌后，均待培养 基冷却至45-50度时分装。（4）高压灭菌一般为118-121度，6.81kg
真菌临床检验技术
真菌临床检验技术真菌临床检验在诊断和治疗真菌疾病中扮演着至关重要的角色。
由于真菌感染菌种构成的变化，新的条件致病真菌的出现，以及真菌感染率的提高，我们需要更为精细和深入的检测工作，以便确定真菌种类和其对抗真菌药物的耐药性。
对真菌进行精确的识别和耐药性分析，可以为临床治疗提供重要依据，从而有助于患者的快速恢复。
这里就带大家一起来了解常见的真菌临床检验技术。
1.标本采集标本采集是检验的基础，需根据病人的具体情况和疾病种类，选择合适的采集方法。
如果疑似浅表真菌感染，例如体癣，可刮取病变部位的边缘痂皮。
对于疑似深部真菌感染，需要采集的标本包括脓液、痰液、脑脊液、血液等。
无论何种情况，标本的采集都需要在尚未使用药物治疗前完成。
如果已经用药，需要停药一周后才能再次采集标本。
另外，标本的采集必须足量，一般情况下，活体组织需要两份（一份用于显微检查和培养，一份送给病理科进行检查），皮屑需要两块，胸腔液为20毫升，脑脊液和血液为5毫升。
在操作过程中，需要保证无菌，避免二次感染。
采集完成后的标本要尽快送检，保存时间不超过两小时，特别是对于深部真菌标本。
2.直接检查法真菌直接检验主要在显微镜下进行。
首先，取一部分患者的标本，放置在玻璃载片上，加入适量的载液。
在平均分布标本后，用另一块玻片覆盖。
待片刻，利用火焰迅速烘烤载玻片，但不可持续加热以避免结晶。
随后，轻压盖玻片，除去气泡的同时使标本尽可能压薄。
清理周围的溢液后，可以用显微镜观察。
初步选择低倍镜，观察是否存在孢子或菌丝。
确定存在后，使用高倍镜进行细致观察，描绘出孢子和菌丝的排列、大小、位置、特征和形态等。
真菌直接检查是一种较为快速和直接的检测方法，其结果可以明确患者是否被真菌感染。
如果结果为阳性，可以确诊患者的真菌感染；如果结果为阴性，仍不能排除真菌感染的可能性。
通过显微镜，我们可以明确部分病原菌种，如花斑癣菌、新型隐球菌等，也能够确定某些特定的菌属，如念珠菌属。
真菌检验操作生物安全要求
真菌检验操作生物安全要求真菌检验是一项涉及到生命科学和生物安全的重要实验。
在进行真菌检验操作时，实验人员需要遵守一定的生物安全要求，以保障自身安全并避免对环境造成负面影响。
实验人员生物安全要求1. 培训在进行真菌检验操作之前，实验人员应接受培训，掌握真菌实验操作、生物安全基本知识以及应急处理措施。
2. 个人防护实验人员在进行真菌检验操作时，应穿戴适当的个人防护装备，包括实验服、手套、口罩等。
更换实验服、洗手、戴好手套等操作时都应注意生物安全。
3. 安全操作实验人员在进行真菌检验操作时，应遵循规范的实验操作流程，如操作要求仔细阅读实验手册，操作前应先确认所需试剂和设备齐全。
4. 废弃物处理实验人员在进行真菌检验操作后，应妥善处置废弃物，并避免将实验室中的废弃物外带，避免对环境造成污染。
实验室生物安全要求1. 实验室设置真菌检验的实验室应配备通风设备、安全柜等设备，保证室内循环空气。
实验室的温度、湿度等也需要严格控制，符合实验要求。
2. 实验室管理实验室管理人员需要对实验人员进行生物安全及实验操作规范知识培训，监督实验人员的操作，保证实验室安全、卫生环境良好。
3. 实验室清洁实验室应每日定期清洁，特别是实验室表面、设备表面、实验台等需要定期清洁、消毒，遵循规范的操作流程。
4. 实验室设备维护实验室里的设备应在定期进行维护，保证设备的完好性，避免操作中出现设备失效等问题，影响实验过程。
总结实验人员在进行真菌检验操作时，应注意生物安全要求，遵循规范的实验操作流程，保障自身安全并避免对环境造成负面影响。
实验室管理人员需要对实验室进行管理，定期进行清洁、维护、培训等，确保实验室环境安全、卫生、稳定。
真菌感染的常规检验方法
真菌感染的常规检验方法真菌的临床实验室检查一般包括标本采集、直接镜检、染色镜检、分离培养、生化反应及免疫学试验等。
以直接镜检和分离培养最重要。
1标本采集不同真菌感染应采用不同的临床标本。
浅部真菌感染可以采集毛发、皮屑、指(趾)甲、痂等，标本在分离前常先用75％的乙醇消毒。
深部真菌感染的检查可取痰、尿液、口腔或阴道分泌物、脑脊液、各种穿刺液和活检组织等。
采集标本时应注意无菌操作。
采集标本后应及时转运至实验室进行检查，一般不超过1～2h，以免标本变质污染。
标本须在用药前采集，对已用药者则需停药一段时间后再采集标本。
2检查方法2.1 直接检查法直接镜检是最简单也是很有价值的实验室诊断方法。
其优点在于简便、快速，无菌部位的阳性结果可直接确定真菌感染。
但是，除了少数真菌外，多数不能确定其种类。
由于阳性率较低，阴性结果亦不能排除诊断，有时需反复检查或做其他方法检查以进一步确定。
直接镜检对于浅表和皮下真菌感染最有帮助。
2.1.1 不染色标本检查取皮屑、毛发、指(趾)甲屑等标本置于载玻片中央，滴加100～200g／L KOH溶液1～2滴，以盖玻片覆盖后在火焰上微微加热，使组织或角质溶解、透明后，先于低倍镜检查有无真菌菌丝或孢子，再以高倍镜检查其特征，可初步诊断真菌感染。
2.1.2 染色标本检查有些真菌如深部真菌需要染色后才能更清楚地观察，常用的染色方法如下。
(1)革兰染色法：多用于白假丝酵母菌、孢子丝菌和新近感染的组织胞浆菌等。
所有真菌均为革兰阳性。
(2)乳酸酚棉蓝染色法：取标本于载玻片上，滴加染液，加上盖玻片后于镜下观察，真菌被染成蓝色。
该法适用于各种真菌的直接检查，培养物涂片检查及小培养标本保存等。
(3)荧光染色法：用0.1％吖啶橙对标本涂片和组织切片进行染色，在荧光显微镜下观察，白假丝酵母菌、皮炎芽生菌、球孢子菌为黄绿色，新型隐球菌、鼻孢子菌为红色，组织胞浆菌为红黄色，曲霉菌为绿色。
2.2 分离培养法真菌培养是目前鉴定真菌的唯一方法。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
• 掌握白假丝酵母菌的鉴定
二、实验器材和试剂
• • • • 菌种：白假丝酵母菌 培养基：沙氏培养基，血琼脂 试剂：革兰染液， 其他：载玻片、小试管、 温箱等。
1.分离培养、菌落检查：将白假丝酵母菌和接种于 沙氏平板和血平板上，室温（ 25 ℃ 左右）培养后 观察其菌落特征。白假丝酵母菌的菌落均为酵母 型，表面光滑湿润．边缘整齐，灰白色或奶酪色。
2.显微镜检查：取白假丝酵母菌培养物制片， 经革兰染色，镜下观察其芽生孢子及是否有 假菌丝
3.芽管形成试验：将假丝酵母菌接种于0.5ml人或动 物血清中，37℃孵育1.5-4h，显微镜观察有无芽管形 成。白假丝酵母菌可由孢子长出短小的芽管。
五、实验结果
• 记录所观察到的菌落形态、染色情况 及相关试验结果。 • 完成实验报告
请确保油镜头擦拭干净！ 请安排同学留下值日