细菌分离与鉴定方法嗜水气单胞菌分离鉴定
罗非鱼嗜水气单胞菌的分离鉴定
１ 材料 和方 法
１１ 病 鱼 ．
来 自广西某 江 的 网箱养 鱼 场发 病罗 非鱼， 到实 验 送
室进 行 细 菌 分 离 鉴定 。
另一管不作处理， 置于 ４３备用 。同时取 １管正 常马丁 肉 １
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・
１０ ・ （ ０ 总第 １６期 ） ４
水
利 渔 业
２０ ０ ６年 第 ２ ６卷第 ４期
罗非 鱼嗜水 气单胞 茵的分离鉴定
刘加 波， 芝勋 ， 显文 ， 小飞 ， 耀珊 ， 志 勤 谢 邓 唐 庞 谢
（ 西兽医研 究所， 广 南宁 ５００ ） ３ ０ １
按常 规方 法进 行 葡 萄 糖、 糖 、 糖 、 芽 糖 、 子 乳 蔗 麦 棉
糖、 阿拉伯糖 、 Ｄ一核糖、 木糖 、 叶苷、 七 甘露醇 、 杨 酸、 水 硫 化氢、 化 钾 、 素、 胶 液 化、 酸 盐 还 原 、 ｏ ｅ 氰 尿 明 硝 Ｖ ｇｓ— Ｐｃｋ ｕｒＶ ） Ｍｅｈ ｌ ｅ （ Ｒ） ｒ ａｅ（ Ｐ 、 ｔｙ Ｒ ｄ Ｍ 等生 理生 化 试验及 氧 ￣
中图分类号 ：９１４ ，９５ １５ ￥４ ． ￥６ ． ２ ２
文献标识码 ： 文章编 号 ： ０ — ２８２０ ）４ ００ — ４ Ａ １ ３ １７ ｆ０６０ — １０ ０ ０
２ ℃培养 ２ 。 ８ ４ｈ 取单菌 落接种于 含 １５ ． ％脱脂奶蔗糖胰 蛋
白胨琼脂平板上，８ ２ ℃培养 ２ 判定 ， ４ｈ 以在点种 菌生长 菌 落周 围 出现清晰溶蛋 白圈者判为 阳性 。 １７ 细菌鉴定系统鉴定 ．
腔注射正 常马丁肉汤 ０ １ｍ 。隔 离饲养 ， 察记 录小 白 ． Ｅ 观
草鱼细菌性病原体嗜水气单胞菌分离鉴定和药敏试验
2019.102018年笔者对泗阳县运河北片草鱼养殖进行了疫病监测与流行病学调查，并对具有典型症状的发病草鱼进行了病原菌株分离和鉴定，将鉴定出的嗜水气单胞菌进行了常用抗菌药物敏感性试验，旨在为嗜水气单胞菌病原引起的草鱼细菌性疾病有效检验与防控及相对应的有效治疗提供依据。
一、材料与方法1.试验材料(1)2018年4－10月在草鱼养殖场的不同发病塘口，选取具有典型发病症状草鱼进行分离，分离部位为血液，采样时间、地点、症状、API－20E 生化反应编号、菌株种类详细情况见表1。
(2)营养肉汤、营养琼脂、TCBS 琼脂、脱脂奶蔗糖胰蛋白胨琼脂购于北京陆桥。
肠杆菌和其他非苛养革兰氏阴性杆菌鉴定试剂盒(英文名API 20E)购于梅里埃诊断产品(上海嘉合)有限公司。
动物用药敏分析试剂板购于南京菲恩医疗科技有限公司。
2.试验方法细菌分离鉴定和菌株对药物感受性试验在县水产站病害检测无菌操作室内进行。
试验操作遵循《鱼类细菌病检疫技术规程(SC/T 7201.1－2006、SC/T 7201.1－2006)》和梅里埃API－20E 试剂条鉴定及南京菲恩动物用药敏分析试剂板操作流程。
二、试验结果1.嗜水气单胞菌分离及形态特征观察从病鱼血液分离到的嗜水气单胞菌在普通营养琼脂培养基上生长良好，28℃培养18～24小时，形成圆形光滑、边缘整齐、湿润、微凸、微白色菌落，在脱脂奶蔗糖胰蛋白胨琼脂平板上，菌落呈乳白色、微凸、湿润，周围出现清晰的溶蛋白透明圈，革兰氏染色阴性，油镜视野下短杆状。
2.嗜水气单胞菌的氧化酶试验和生理生化鉴定对分离的细菌进行生理生化检测，结果判定为嗜水气单胞菌的具体生理生化特征见表2。
依据《伯杰氏鉴定细菌学手册》(1994)“气单胞菌属细表1菌株分离清单汇总442019.10表312株细菌对8种抗菌药物的最小抑菌浓度(MIC)对照毫克/升菌种间特征鉴别表”对分离到的嗜水气单胞菌进行Ⅰ和Ⅱ分类，并分别命名为Ⅰ－1、Ⅰ－2、Ⅰ－3和Ⅱ－1、Ⅱ－2、Ⅱ－3、Ⅱ－4、Ⅱ－5、Ⅱ－6、Ⅱ－7、Ⅱ－8、Ⅱ－9。
鳖源致病性嗜水气单胞菌的分离与鉴定
鳖源致病性嗜水气单胞菌的分离与鉴定作者：林锋，刘莉，曹铮，等来源：《湖北农业科学》 2014年第22期林锋，刘莉，曹铮，叶雪平，郝贵杰，盛鹏程（浙江省淡水水产研究所／农业部淡水健康养殖重点实验室，浙江湖州３１３００１）摘要：从患病中华鳖（Ｐｅｌｏｄｉｓｃｕｓｓｉｎｅｎｓｉｓ）肺组织中分离到优势菌１株，进行了表型特征分析和１６ＳｒＤＮＡ序列测定。
结果表明，该菌为气单胞菌属的嗜水气单胞菌（Ａｅｒｏｍｏｎａｓｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ），通过对健康中华鳖进行人工感染，发现该菌具有致病性；选取２０种常规药敏试纸进行药敏试验，结果表明，该嗜水气单胞菌对庆大霉素、头孢他啶、头孢西丁、链霉素、呋喃妥因敏感，对诺氟沙星、红霉素、阿米卡星、环丙沙星中敏，对其他１１种抗生素具有耐药性。
关键词：鳖（Ｐｅｌｏｄｉｓｃｕｓｓｉｎｅｎｓｉｓ）；嗜水气单胞菌（Ａｅｒｏｍｏｎａｓｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ）；１６ＳｒＤＮＡ；药敏试验中图分类号：Ｓ９４３文献标识码：A文章编号：0439－８114（２０14）22－5487-03ＤＯＩ：１０．１４０８８／ｊ．ｃｎｋｉ．ｉｓｓｎ０４３９－８１１４．２０１４．２２．０40收稿日期：２０１４－０５－２９基金项目：浙江省科技厅项目（２００９Ｃ１２０５６）；浙江省淡水养殖科技创新团队项目（２０１２Ｒ１００２６－１１）作者简介：林锋（１９８０－），男，安徽宁国人，助理研究员，硕士，主要从事水产病原微生物研究，（电话）０５７２－２０４１４０３（电子信箱）ｗｗｌｉｎｆｅｎｇ＠１６３．ｃｏｍ；通讯作者，刘莉，副研究员，主要从事水产动物病害防治研究，（电子信箱）ｌｉｕｌｉ６６５５＠ｈｏｔｍａｉｌ．ｃｏｍ。
嗜水气单胞菌（Ａｅｒｏｍｏｎａｓｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ）属于弧菌科气单胞菌属，是一种条件性致病菌，广泛存在于淡水、污水、淤泥、土壤和人类粪便中，对水产动物、畜禽和人类均有致病性［１］。
嗜水气单胞菌作为淡水养殖动物重要的病原菌之一，目前已确定淡水鱼类细菌性败血症、鳖“红底板”病等多种病害是由其所导致的［２，３］，给水产养殖业造成极大的经济损失。
嗜水气单胞菌的分离鉴定及其Hfq功能的研究
嗜水气单胞菌的分离鉴定及其Hfq功能的研究嗜水气单胞菌的分离鉴定及其Hfq功能的研究引言：嗜水气单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）是一种广泛存在于自然环境中的革兰阴性细菌，也是常见的致病菌之一。
它可以导致多种感染，如肺部感染、尿路感染和伤口感染等。
针对嗜水气单胞菌的研究主要集中在其分离鉴定以及Hfq蛋白在其感染过程中的重要作用。
一、嗜水气单胞菌的分离方法嗜水气单胞菌的分离通常采用无菌手套和标准的微生物培养技术。
首先，选择符合条件的分离来源，如环境纯化水、病人的分泌物或其他可能存在细菌的样品。
然后，取一部分样品加入到含有适宜培养基的培养皿中，通过温度、气氛和pH等条件对其进行适宜的控制。
最后，在菌落出现后，进行形态特征分析和进一步的鉴定实验，如生化试验、抗生素敏感性试验和16S rRNA基因测序等。
二、嗜水气单胞菌的鉴定嗜水气单胞菌的鉴定主要基于其形态特征以及生化试验。
在形态特征方面，嗜水气单胞菌呈革兰阴性的短杆菌形态，染色后可见细胞呈浅紫色，集群生长时形成灰色或蓝色的绿色草状菌落。
在生化试验方面，嗜水气单胞菌可氧化葡萄糖并产生酸，同时产生黄色或琥珀色色素。
此外，嗜水气单胞菌对氧化鹅脂酸和利用麦芽糖的能力也是其鉴定的重要指标。
三、Hfq蛋白在嗜水气单胞菌感染过程中的作用Hfq蛋白是一种高度保守的小RNA结合蛋白，在细菌中起到了重要的作用。
研究发现，嗜水气单胞菌中Hfq蛋白对其感染过程具有重要的调节作用。
首先，Hfq蛋白能够调控外膜蛋白的表达，从而影响细菌对抗宿主免疫的能力。
其次，Hfq蛋白还参与调节嗜水气单胞菌中多种生物膜的形成，如生物膜的黏附、生长和分离等。
此外，研究还发现Hfq蛋白在嗜水气单胞菌中调控了一系列的代谢途径和毒力因子的表达。
四、Hfq功能的研究方法及展望研究Hfq蛋白在嗜水气单胞菌中的功能通常采用基因敲除和过表达等方法。
通过敲除Hfq基因，研究人员可以观察到Hfq蛋白缺失对嗜水气单胞菌生长和毒力因子表达的影响。
嗜水气单胞菌相关基因的筛选及鉴定实验报告
嗜水气单胞菌相关基因的筛选及鉴定实验报告1. 引言1.1 概述：本文旨在介绍针对嗜水气单胞菌相关基因的筛选和鉴定实验的研究报告。
嗜水气单胞菌是一种常见于水环境中并具有重要生态功能的微生物。
通过对其相关基因的筛选和鉴定，可深入了解该菌株的遗传特性、代谢途径以及与周围环境的相互作用等方面。
1.2 文章结构：本文主要包括引言、嗜水气单胞菌简介、基因筛选实验设计与方法、基因鉴定结果及分析以及结论与展望等部分。
在引言部分，我们将简要介绍研究背景和目的，并概述后续章节内容。
随后，嗜水气单胞菌简介将详细描述其特点、研究意义以及当前相关研究现状。
基因筛选实验设计与方法将对实验方案、PCR扩增和文库构建步骤以及筛选条件和策略进行说明。
在基因鉴定结果及分析部分，我们将介绍获得的鉴定结果并进行序列比对和功能预测。
最后，我们将在结论与展望部分对实验结果进行总结并展望未来的研究方向。
1.3 目的：本文的目的在于通过筛选和鉴定嗜水气单胞菌相关基因，探究该菌株的遗传特性和代谢途径，并对其在环境中的作用进行深入了解。
这不仅有助于加深对嗜水气单胞菌生物学特性的认识，还为相关领域的研究提供理论支持和实验依据。
希望通过本研究可以拓宽我们对嗜水气单胞菌及其相关基因聚焦研究领域所知的范围，并为今后进一步挖掘和应用这些基因提供新思路和方法。
2. 嗜水气单胞菌简介：2.1 嗜水气单胞菌特点：嗜水气单胞菌（Acinetobacter hydrophila）属于革兰氏阴性杆菌，是一种广泛存在于自然环境中的细菌。
它具有以下主要特点：- 形态特征：嗜水气单胞菌呈革兰氏阴性杆状，并且通常以单胞或成对形式存在。
- 环境适应能力：这种细菌能够在多种环境条件下存活和繁殖，包括土壤、水体和动植物体内等。
它们对温度、盐度和酸碱度等因素具有一定的耐受性。
- 能量代谢：嗜水气单胞菌可以利用各种有机物作为碳源，并通过无机化合物进行能量代谢。
此外，它们还可以产生多种酶类来分解复杂的营养物质。
一例引起欧洲鳗鲡死亡的嗜水气单胞菌分离与鉴定
Ｇｒ ｍ－ ｅ ａ ｉｅ ｂ ｃ ｌ ｎ ｈ ｅ ｕ ｔ ｈ ｗｅ ｈ ｔｉ ｗａ ｒ ｍｏ ａ ｙ ｒ ｐ ｉ ． ｅ ｔ ｆｔ ｅ ｐ ｔ ｏ ｅ ｓ ｓ ｓ ｅ ｔ ｉｔ ｏ ａ ｎ ｇ ｔ ａｉｉ ｖ ｌ ，ａ ｄ ｔ ｅ ｒｓ ｌｓｓ ｏ ｄ ｔ ａ ｔ ｓＡｅ ｏ ｎ ｓ ｄ ｏ ｈ ｌ Ｔ ｓ ｓ ｏ ｈ ａ ｈ ｇ ｎ ｕ ｃ ｐ ｉ ｌ ｙ ｔ ｈ ａ ｂｉ
关 键 词 ：嗜水 气 单 胞 菌 ；分 离 鉴 定 ；欧 洲 鳗 鲡 中图 分 类 号 ：Ｓ ９ ３ ４ 文 献 标 识 码 ：Ａ
Ｉｏｌ ｉ ｎ ａ ｄ ｎ ｉｉａ ｉｎ ｏ ｔ ｏ ｅ ｒ ｍ ｌ Ｉ ｅ ｔ ｄ Ｅｕｒ ｐ ａ ｌ （ ｎｇ ｌａＡ ｎ ｉｌ ｓ ａｔｏ ｎｄ Ｉ ｅ ｔｆｃ ｔｏ ｆａ Ｐａ ｈ ｇ ｎ ｆ ｏ ａｌ ｎｆ ｃｅ ｏ ｅ ｎ Ｅｅ Ａ ｕｉｌ ｇｕ ｌａ）
福 建农 业 学报 ２ （ ） ５ ５ ４ ，０ １ ６ ４ ：４ ～５ ８ ２ １
Ｆ ｊａ ｏ ｒ ａ ｆ Ａｇ ｉ ｌ ｒ ｌＳ ｉ ｃｓ ｕ ｆｎＪ ｕ ｎ ｌ ｒｃ ｔ ａ ｃ ｎ ｅ ｏ ｕ ｕ ｅ
文章 编 号 ：１ ０ —０ ８ （ ０ １ ４ ５ ５ ４ ０ ８ ３ ４ ２ １ ）０ — ４ —０
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泗阳县草鱼养殖细菌性病原嗜水气单胞菌分离、鉴定和药敏试验
泗阳县草鱼养殖细菌性病原嗜水气单胞菌分离、鉴定和药敏试验作者：暂无来源：《渔业致富指南》 2019年第18期李晓丽冯龙陈瑜李勇草鱼作为泗阳县传统的优良淡水养殖品种，一直深受广大渔农的欢迎。
但是近年来随着水产集约化养殖的发展，草鱼的养殖放养密度越来越大，人工配合饲料投喂量也越来越多，导致养殖水体的水质日益恶化。
加上渔农防病治病的意识落后，受价格影响的存塘量和环境因素的变化，导致草鱼多种细菌性疾病如烂鳃病、赤皮病和肠炎病等愈加严重，甚至极少数养殖户草鱼养殖全军覆没，损失惨重，严重打击了养殖户的积极性。
经过近三年对泗阳县水产养殖细菌性疾病的研究发现，由嗜水气单胞菌引起的草鱼疾病将近占细菌性疾病的50%。
因此，2018年泗阳县水生动物疫病防控中心对县域内草鱼养殖进行了疫病监测，并对具有代表性特征的病草鱼进行了病菌株分离和鉴定，将鉴定出的嗜水气单胞菌进行了常用抗生素药物敏感性实验，旨在为嗜水气单胞菌病原引起的草鱼细菌性疾病有效检验与防控及相对应的有效治疗提供依据，防止药物的滥用和误用，避免病情的耽误而带来不必要的经济损失。
一、材料与方法1.实验材料（1）2018年5-10月在全县的主要草鱼养殖场的不同发病塘口，选取具有典型特征的病草鱼进行分离，分离部位为血液，具体的采样时间、地点、症状、菌株种类详细情况见表1。
（2）营养肉汤、营养琼脂、TCBS琼脂、脱脂奶蔗糖胰蛋白胨琼脂购于北京路桥。
氧化酶试剂盒购于杭州微生物试剂有限公司，肠杆菌和其他非苛养革兰氏阴性杆菌鉴定试剂盒（比色法）（英文名API 20E）购于梅里埃诊断产品（上海）有限公司，动物用药敏分析试剂板购于南京菲恩医疗科技有限公司。
2.实验方法（1）细菌的分离纯化。
样品先用酒精棉擦拭，用灭菌的注射器抽取血液放于营养汤，置于28℃恒温培养箱中培养18~24小时。
在无菌条件下，用灭菌的接种环取培养液划线接种于普通营养琼脂培养基上，置于28℃恒温培养箱中培养18~24小时。
水产动物致病性嗜水气单胞菌的分离鉴定
１ ２ ２ 生理生 化 特性 测 定 采 用 微量 发酵 管 法 系 ．．
１ １ １ 细 菌来 源 ． ．
７株 试 验 菌 株 分离 于 不 同 的养
统测 定各 分离 菌 株生 理生 化特 性 ，８℃恒 温 箱 中观 ２ 察 ７ｄ 测 定包 括糖 的发 酵试验 、 基酸 代谢 试验 、 ， 氨 细 菌酶 试 验 、 试 验 及 血琼 脂 平 板 溶 血试 验 等 生场 （ １ ， 表 ） 嗜水 气单胞 菌 标 准株 Ｊ一１ 株
由南 京 农 业 大 学 兽 医 微 生 物 教 研 组 陆 承 平 教 授
惠赠 。
１ １ ２ 实验动 物 和 细菌 微 量 生 化发 酵 ．．
小 鼠体 重
１ ２ ３ 玻片凝 集试 验 ．．
取 １滴 全 菌 血 清置 于 载 玻
实验动 物 中心 。鲫 鱼购 自合 肥 市 某鱼 场 ， 择 平均 选 个体 重约 １０ｇ 外伤 健壮活 泼 的鲫鱼 ， ５ ｍ × ０ 无 于 ０ｃ ２ ｍ× ０ｃ 的玻璃 水 族 箱 中放 养 ７ｄ以上 ， 温 ０ｃ ５ ｍ 水
控制 在 ２ ２ ． ℃之 间 ， 认 健 康 无 病 后 用 于试 ８～ ９ ５ 确
１ ２ 方 法 ．
１ ２ １ 细 菌 的分 离 纯 化 ．．
无 菌 操 作 采 取 鱼 、 的 鳖
肝、 ‘ 脏器 ， 肾等 划线 接种 于营养 琼 脂平 板上 ， ２ 置 ８℃
恒温 培养 １ ２ ， 离单 个 菌落 。细 菌经 反 复传 ８～ ４ｈ 分 代 ２～ ３次纯化后 ， 种 于普通琼 脂 斜面 培养 基上保 转
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一
１２一 ７
江苏农业 科学
２０ ０ ８年第 ２期
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色素等情况）。
细菌的生长状况观察
原理
◆细菌于适宜条件下在不同的培养基上生长，其生长 状态不同。不同细菌在同一种培养基中生长，生长特点 也不相同。这些区别称之为培养特征，是鉴别细菌和细 菌分类的依据之一。
◆ 把细菌接种在固体培养基上，在适宜的条件下经过 一定时间的培养，在培养基表面（或内部）形成肉眼可 见的有一个细菌大量繁殖后而成的集团，称之为菌落。 不同细菌的菌落大小、光浊度、色泽均有其特征。
1区
2区
4区
3区
图3 划线分离的方法 左：分区 右：培养后的结果
分离方法
• 接种完毕，盖好平皿盖，在平皿底玻璃上用记号 笔注明标本名称、接种时间、接种者等。然后将 平皿的底朝上，放置在37℃孵箱内孵育24h。 • 取出后观察琼脂表面的菌落分布情况（见图3），
注意观察最后1～2区内是否分离出单个菌落，并
普通琼脂平板
牛肉膏
蛋白胨 氯化氯化钠（NaCL） 磷酸二氢钾（KH2PO4） 琼脂
3.0g
10.0g 5.0g 1.0g 15.0g
蒸馏水
1000mL
混匀，加热溶解，调PH至7.6分装，112kPa高压灭菌15min， 冷却至45℃倾注灭菌平板。直径90cm平皿每皿倾入15～20ml培
养基，培养基过少，划线分离时细菌的营养较少，菌落生长过小， 菌落形态不易观察，培养基也易于干燥，不易在数天内对菌落形
分离方法
用:
心、肌肉等）中的某种细菌时，须先将待检材料进行 分离培养。常用的分离培养方法是琼脂平皿分区划线
• 在检查含两种或两种以上的待检材料（如肝、脾、肾、
法，是借划线将混杂的细菌在琼脂平皿表面分散开来，
使个别的细菌能固定在某一点，经培养生长繁殖后形
成单个菌落，以达到分离获得纯种细菌的目的。
分离方法
态进行观察。
• 含糖培养基灭菌条件115℃，10～15分钟
• 一般培养基灭菌条件121℃，15～20分钟
细菌的生长状况观察
在无菌平皿中，倒入溶化后50℃普通营养琼脂培 养基，每皿约 20毫升，水平静置待凝固。用接种 环挑去待分离菌株分区划线，37℃培养24h。 菌落形态观察： 大小：以毫米计。 形状：圆形、不规则形、放射状等。 表面：光滑、粗糙、圆环状、乳突状等。 边缘：整齐、波形、锯齿状等。 色素：有颜色，颜色，是否可溶等。 透明度：透明、半透明、不透明。
具体操作方法如下：
• 点燃酒精灯，右手执笔式握持接种环
（见图1），在酒精灯火焰上烧灼接种 环，待冷，取待测菌液一环。
图1 接种环的握持方法
• 左手抓握琼脂培养基平皿，用手掌将平
皿的底固定，用手指将平皿的盖略抬起
一些，进行接种（见图2）。
图2 平皿的握持方法
或者，将平皿的盖留在实验台上，尽量直立平皿靠近酒精灯火焰， 右手持接种环在琼脂表面的一端（即1区，约占整个平皿的1/6～ 1/5）涂布，划线时，接种环与琼脂表面呈 30°～40°的角度轻 轻接触，利用腕力动作，切忌划破琼脂表面。烧灼接种环，待冷 后，将接种环通过1区划线数次，在2区作连续划线，各线条间隔 要小，但不能重叠。划满平皿的1/5～1/4区域，划完2区不需烧灼 接种环，继续通过2区数次，在3区作连续划线，如此反复至划完 整个平皿（如图3）。
1.吲哚试验
2.甲基红试验
3.V-P试验
3.V-P试验
4.柠檬酸试验（枸橼酸盐利用试验）
硫化氢试验 脲酶试验
触酶试验