RNA探针制备 - 360文档中心

rna原位杂交的主要实验过程及应用

rna原位杂交的主要实验过程及应用RNA原位杂交（in situ hybridization）是一种用于检测细胞或组织中特定RNA序列的方法。

它主要包括以下实验过程：1. RNA样本固定：细胞或组织样本通常需要被固定在载玻片上，常用的固定剂包括乙醛、乙酰丙酮、PFA等。

2. 去除脂质：在固定的样本中，脂质会干扰RNA与探针的结合，因此需要用脱脂剂去除脂质。

3. 探针制备：选择目标RNA序列的互补序列作为探针，并进行标记，通常标记方式有放射性同位素标记（例如32P、35S）和非放射性标记（例如荧光标记、酶标记）。

4. 杂交：将探针与样本进行杂交，杂交通常在高温下进行，以促进RNA与探针的结合。

5. 洗脱：为了去除非特异性结合的探针，通常进行一系列的洗脱步骤，洗脱条件可以根据具体的实验目的进行调整。

6. 可视化与检测：如果探针采用放射性标记，可以将载玻片放置于感光胶片上，在放射性衰变的辐射下使胶片曝光，然后显影胶片以检测探针的信号；如果探针采用非放射性标记，可以直接通过荧光显微镜观察探针的发光信号。

RNA原位杂交主要应用于以下领域：1. 研究基因表达：可以确定细胞或组织中特定基因的表达模式，帮助揭示基因的功能和调控机制。

2. 分析细胞类型和结构：可以确定细胞或组织中特定RNA序列的分布情况，帮助研究细胞类型和组织结构。

3. 病理学研究：可以检测病理变化相关基因的表达水平，帮助了解疾病的发生机制和进展过程。

4. 发育生物学研究：可以追踪特定RNA序列在发育过程中的表达变化，帮助研究胚胎发育和器官形成的分子机制。

综上所述，RNA原位杂交是一种重要的实验技术，可以用于研究细胞和组织中特定RNA序列的表达模式及其在生物学和医学领域的应用。

RNA原位杂交是一种研究基因表达的常用技术，通过将标记有特定探针的RNA与细胞内目标RNA进行杂交反应，用于确定RNA在组织或细胞中的位置和表达水平。

其主要实验过程如下：1. 制备RNA探针：根据研究对象的RNA序列设计合适的探针，可以使用放射性标记，如32P或35S，或非放射性标记，如荧光标记（如FITC，Cy3等）。

RNA探针的制备

RNA探针的合成质粒提取准备：1、试剂①LB培养基配方：bacto-tryptone 1g，Bacto-yeast extract 0.5g，NaCl1g，1M NaOH 100μl，dddH2O 配2瓶，各50ml ，100ml。

②质粒提取试剂盒。

2、器皿：10ml离心管若干，Ependorf tube,大小枪头（高温高压灭菌）3、灭菌：LB培养基，大、中、小枪头各一盒，中枪头一瓶，10ml离心管，1.5ml离心管。

4、接菌5、摇菌130rpm,37℃,过夜提质粒：按试剂盒说明书。

质粒线形化小量酶切：器皿：0.5 ml小离心管，1.5 ml离心管，小枪头，中枪头试剂：灭菌ddH2O，10×EcolRⅠ限制酶buffer,BSA(牛血清蛋白)，质粒DNA，EcolRⅠ器械：电泳槽，水浴锅，灭菌ddH2O 13.3μl10×buffer 2μlBSA 0.2μl质粒DNA 4μl混匀后加入EcolRⅠ 0.5μl。

离心收集至管底，37℃水浴3.5小时。

电泳检测，用宽梳子，小电泳槽，90V，20分钟（应该用每个质粒和酶切结果作对照）拍照大量酶切灭菌ddH2O 110μl10×buffer 20μlBSA 2μl质粒DNA 60μl混匀后加入EcolRⅠ 8μl200μl混匀后37℃水浴3.5小时拍照模板的纯化回收1、清洗电泳槽和胶板，用干净的新配制的TAE制胶，填充电泳槽，将梳子（两齿之间）用标签纸封住，交制得应尽稍厚些。

2、200μl酶切样品中加入10μl上样缓冲液，混匀，点样。

(加样时应徐徐加入，避免产生气泡样品飘上来，造成样品交叉污染。

)3．、．9．0．∨电压下电泳．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．2．-．3．小时，由于样品量较大，电泳时间较长。

为了使条带进两分开，不能用太高电压。

4、切胶在紫外灯下看到所需的条带，尽可能少带多余胶，切下该条带。

Northern Blot

Northern Blot实验方案一.探针准备—体外转录1.RNA探针的制备基本要求：不被RNase污染。

（1）制备线性DNA模板a.引物设计采用Array Designer 4设计引物，在下游引物的5'端加上T7启动子序列（蓝色部分标示）。

如下例：AGTAATTGGAATTACAGCT AGGCAGCAAGCGAATGAATCCCGATA AGCTGACTCACGTCAGTGATTCGGGTGAGTGAGTGCCGCTAACAA CGCTGCAATTTCAAGTAAGAAGAGTGTTACCCAAAGTAATTGGAA TTACAGCTAGGCAGCAAGCGAATGAATCCCGATAAGCTGACTCAC GTCAGTGATTCGGGTGAGTGAGTGCCGCTAACAACGC TGCAATTT CAAGTAAGAAGGGTGTTACCCAAAGTAATTGGAATTACAGCTAGG CAGCAAGCGAATGAATCCCGATGAGCTGACTCACGTCAGTGATTC GGGTGAGTGAGTGCCGCTAACAACGCTGCAATTTCAAGTAAGAAG Probe-F: 5'AGGCAGCAAGCGAATGAATC3'probe-R:5'AATTGTAATACGACTCACTATAGGGCG GCGTTGTTAGCGGCACTC3' 预期产物大小：198bp引物设计原则同一般引物设计原则。

Array Designer 4可自行评价引物质量，选取引物时选best即可。

b.探针模板的的制备。

以91001染色体为模板，PCR扩增获得探针模板。

普通琼脂糖凝胶电泳检测模板大小是否正确。

扩增产物的纯化：产物用QIAquick PCR purification Kit(QIAGEN）纯化。

纯化后用DEPC水溶解，测浓度。

—20℃冻存。

（2）体外转录反应制备探针（20 µl）两种方法方法一：a.NTPs 的配置：10×NTPs：ATP/GTP/CTP 各5µl（100mM）UTP 3.25µl（100mM）DMPC处理水31.75µl充分混匀，-20℃保存。

一种检测2019-nCOV的RNA探针及其制备方法与应用[发明专利]

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010358187.8(22)申请日 2020.04.29(71)申请人湖南师范大学地址 410081 湖南省长沙市岳麓区麓山路36号申请人中南大学湘雅二医院(72)发明人谢华平　谢鼎华　付贵芳　王飞英　曾婷　谢缤灵　(74)专利代理机构北京慕达星云知识产权代理事务所(特殊普通合伙)11465代理人赵徐平(51)Int.Cl.C12Q 1/70(2006.01)C12Q 1/6841(2018.01)C12Q 1/6806(2018.01)C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称一种检测2019-nCOV的RNA探针及其制备方法与应用(57)摘要本发明公开了一种检测2019-nCOV的RNA探针，该探针的序列如SEQ ID NO.1所示；制备过程包括：设计引物、合成新的引物、构建重组质粒、PCR扩增、产物纯化、体外转录的过程；将制备得到的探针应用于检测2019-nCOV中，能够在单细胞水平检测2019-nCOV病毒核酸，提高了检测的灵敏度。

权利要求书3页说明书9页序列表3页附图4页CN 111647684 A 2020.09.11C N 111647684A1.一种检测2019-nCOV的RNA探针，其特征在于，所述RNA探针的序列为：UGUGCUUGUGAAAUUGUCGGUGGACAAAUUGUCACCUGUGCAAAGGAAAUUAAGGAGAGUGUUCAGACAUUC UUUAAGCUUGUAAAUAAAUUUUUGGCUUUGUGUGCUGACUCUAUCAUUAUUGGUGGAGCUAAACUUAAAGCCUUGA AUUUAGGUGAAACAUUUGUCACGCACUCAAAGGGAUUGUACAGAAAGUGUGUUAAAUCCAGAGAAGAAACUGGCCU ACUCAUGCCUCUAAAAGCCCCAAAAGAAAUUAUCUUCUUAGAGGGAGAAACACUUCCCACAGAAGUGUUAACAGAG GAAGUUGUCUUGAAAACUGGUGAUUUACAACCAUUAGAACAACCUACUAGUGAAGCUGUUGAAGCUCCAUUGGUUG GUACACCAGUUUGUAUUAACGGGCUUAUGUUGCUCGAAAUCAAAGACACAGAAAAGUACUGUGCCCUUGCACCUAA UAUGAUGGUAACAAACAAUACCUUCACACUCAAAGGCGGUGCACCAACAAAGGUUACUUUUGGUGAUGACACUGUG AUAGAAGUGCAAGGUUACAAGAGUGUGAAUAUCACUUUUGAACUUGAUGAAAGGAUUGAUAAAGUACUUAAUGAGA AGUGCUCUGCCUAUACAGUUGAACUCGGUACAGAAGUAAAUGAGUUCGCCUGUGUUGUGGCAGAUGCUGUCAUAAA AACUUUGCAACCAGUAUCUGAAUUACUUACACCACUGGGCAUUGAUUUAGAUGAGUGGAGUAUGGCUACAUACUAC UUAUUUGAUGAGUCUGGUGAGUUUAAAUUGGCUUCACAUAUGUAUUGUUCUUUCUACCCUCCAGAUGAGGAUGAAG AAGAAGGUGAUUGUGAAGAAGAAGAGUUUGAGCCAUCAACUCAAUAUGAGUAUGGUACUGAAGAUGAUUACCAAGG UAAACCUUUGGAAUUUGGUGCCACUUCUGCCCUAUAGUGAGUCGUAUUACGC，如SEQ ID NO.1所示。

rna探针制备原理

rna探针制备原理小伙伴们！今天咱们来唠唠RNA探针制备的原理，这可是个超有趣的事儿呢！RNA探针啊，就像是一个小小的侦探，专门去寻找和识别它的目标分子。

那它是怎么被制造出来的呢？这得从它的原材料说起啦。

我们知道，RNA是由核糖核苷酸组成的。

要制备RNA探针，首先得有个模板。

这个模板可以是我们已经知道序列的DNA片段哦。

就像是照着菜谱做菜一样，DNA模板就像是菜谱，告诉我们该怎么合成RNA探针。

那怎么根据这个“菜谱”来做呢？这就用到了一种神奇的酶，叫RNA聚合酶。

这种酶可厉害了，它能识别DNA模板上特定的启动子区域，然后就开始工作啦。

它会一个一个地把核糖核苷酸连接起来，按照DNA模板的序列信息，就像小朋友搭积木一样，一块一块地把RNA探针构建起来。

在这个过程中，我们还得给它提供合适的“建筑材料”，也就是各种核糖核苷酸。

这些核糖核苷酸就像是不同颜色的积木，在RNA聚合酶的作用下，按照特定的顺序组合在一起。

不过呢，这里面还有个小讲究。

我们要确保合成的RNA探针是纯净的，没有其他乱七八糟的东西混在里面。

所以在反应体系里，我们要控制好各种条件，比如温度、酸碱度之类的。

就像我们烤蛋糕一样，温度不合适，蛋糕就烤不好，RNA探针的合成也是这个道理。

如果温度太高或者太低，RNA聚合酶可能就会罢工，或者合成出来的RNA探针就会有缺陷。

而且呀，我们还得防止RNA被降解。

RNA可是个比较脆弱的家伙，很容易被一些酶给分解掉。

所以在制备过程中，我们要加入一些保护剂，就像是给RNA穿上一层铠甲，让那些会分解它的酶无从下手。

当RNA聚合酶按照模板合成完RNA探针之后，我们就得到了我们想要的东西啦。

这个RNA探针就可以去执行它的任务了，比如说去检测细胞里面有没有特定的RNA分子存在。

你看，RNA探针制备就像是一场精心策划的小工程。

从选择合适的DNA模板，到让RNA聚合酶大展身手，再到保护好合成的RNA探针，每一个环节都很重要呢。

RNA探针的制备

RNA探针的合成质粒提取准备：1、试剂①LB培养基配方：bacto-tryptone 1g，Bacto-yeast extract 0.5g，NaCl1g，1M NaOH 100μl，dddH2O 配2瓶，各50ml ，100ml。

②质粒提取试剂盒。

2、器皿：10ml离心管若干，Ependorf tube,大小枪头（高温高压灭菌）3、灭菌：LB培养基，大、中、小枪头各一盒，中枪头一瓶，10ml离心管，1.5ml离心管。

4、接菌5、摇菌130rpm,37℃,过夜提质粒：按试剂盒说明书。

质粒线形化小量酶切：器皿：0.5 ml小离心管，1.5 ml离心管，小枪头，中枪头试剂：灭菌ddH2O，10×EcolRⅠ限制酶buffer,BSA(牛血清蛋白)，质粒DNA，EcolRⅠ器械：电泳槽，水浴锅，灭菌ddH2O 13.3μl10×buffer 2μlBSA 0.2μl质粒DNA 4μl混匀后加入EcolRⅠ 0.5μl。

离心收集至管底，37℃水浴3.5小时。

电泳检测，用宽梳子，小电泳槽，90V，20分钟（应该用每个质粒和酶切结果作对照）拍照大量酶切灭菌ddH2O 110μl10×buffer 20μlBSA 2μl质粒DNA 60μl混匀后加入EcolRⅠ 8μl200μl混匀后37℃水浴3.5小时拍照模板的纯化回收1、清洗电泳槽和胶板，用干净的新配制的TAE制胶，填充电泳槽，将梳子（两齿之间）用标签纸封住，交制得应尽稍厚些。

2、200μl酶切样品中加入10μl上样缓冲液，混匀，点样。

(加样时应徐徐加入，避免产生气泡样品飘上来，造成样品交叉污染。

)3．、．9．0．∨电压下电泳．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．2．-．3．小时，由于样品量较大，电泳时间较长。

为了使条带进两分开，不能用太高电压。

4、切胶在紫外灯下看到所需的条带，尽可能少带多余胶，切下该条带。

体外转录制备5sRNA探针方案

体外转录制备5s rRNA探针【材料】1. DIG RNA Labeling MIX(10×,Roche)2. T7 RNA Polymerase (20 U/µl ,Fermentas)3. RiboLock Ribonuclease Inhibitor (40 U/µl ,Fermentas)4. 0.5 M EDTA(Ambion,American)5. DNaseI（2U/µl，Fermentas)【方法】(一) 体外转录制备RNA探针1.PCR扩增5s rRNA模板总共扩增25个体系，95ºC 40s, 56 ºC 30s, 72ºC 30s 共30个循环2.胶回收试剂盒回收PCR产物，2%琼脂糖电泳观察扩增产物的特异性。

3.体外转录反应制备地高辛标记RNA的探针1)室温下洁净通风橱中，于0.2ml RNase-free EP管中加入：DMPC水10.5 µl线性模板DNA 1.5µl (0.2 µg）DIG RNA Labeling MIX(10×) 2 µl5X Transcription buffer 4 µlT7 RNA Polymerase (20u/μl) 2µl总体积20µl2)混匀，短暂离心后，37°C 2 hr。

3)2U/µl DNaseI 2µl消化15min(对Northern blot 试验可以不消化)，再加1µl0.5M EDTA,（pH 8.0）终止反应。

4)加入30µlDEPC水，使总体积达到50µl。

加入1/10体积的5M乙酸铵（5µl）涡旋混匀和3倍体积冰预冷的无水乙醇（150µl），-60°C至少30 min 或-20°C 至少2hr，12,000rpm 4 °C 离心15-20min，75%乙醇漂洗，空气干燥。

RNA探针杂交步骤以及效价测定

RNA探针杂交步骤以及效价测定RNA探针是一段单链cDNA分子，本文总结了RNA探针的分类、制备方法、探针的纯化、杂交前的注意事项，RAN探针效价的测定以及探针的选择。

RNA原位杂交中的探针(一)探针的种类RNA探针是指带有标记的能与组织内相对应的核苷酸序列互补结合的一段单链cDNA或cRNA分子。

根据在RNA杂交中所使用的探针依其来源可分为三种：即特异性cDNA、cRNA 探针和人工合成寡核苷酸探针。

1. 单链cDNA探针：由于cDNA中不存在内含子及其它高度重复序列，又克服了双链cDNA探针在杂交反应中两条链之间复性的缺点，从而提高了杂交反应的敏感性。

但由于单链cDNA探针的制备比较困难，在RNA原位杂交中已很少见有应用。

2. cRNA探针：是以cDNA为模板，通过体外转录而获得的。

因为它是一种单链探针，因此也避免了应用双链cDNA探针做杂交反应时存在的两条链之间的复性问题。

cRNA与RNA之间形成的杂交体要比cDNA-RNA杂交体稳定。

cRNA-RNA之间形成的杂交体不受RNA酶的影响。

因此杂交反应后可用RNA酶处理，以除去未结合的探针。

由于cRNA探针具有以上这些优点，cRNA探针的杂交饱和水平又比双链DNA探针高出8倍，因此在原位杂交中应用广泛。

cRNA 探针的缺点是：探针的制备过程比较复杂，需要较好的分子生物学实验设备，它对RNA酶敏，易受破坏，操作中要谨防RNA酶污染。

3. 寡核苷酸探针：人工合成的寡核苷探针是以核苷酸为原料，通过DNA合成仪合成，避免了真核细胞中存在的高度重复序列带来的不利影响。

由于大多数寡核苷酸序列较短，不需要纯化，组织穿透性极好。

根椐目的基因的特异性序列设计的探针，特异性较强。

合成的寡核苷酸探针的缺点是：探针长度必须适宜，探针太长可造成内部错误配对杂交，探针太短可形成非特异性结合。

它与mRNA形成的杂交体不如cRNA-RNA杂交体稳定，再则探针较短，所携带的标记物少，敏感性较低。

rna原位杂交探针合成

RNA原位杂交探针合成是一种用于检测细胞内特定RNA序列的方法。

以下是RNA原位杂交探针合成的一般步骤：
1. 设计探针序列：根据目标RNA序列的特异性，设计合适的探针序列。

探针序列通常由20-30个核苷酸组成。

2. 合成探针：使用化学合成方法合成探针序列。

合成的探针可以标记有荧光染料或放射性同位素等标记物，以便于检测。

3. 标记探针：如果探针没有被标记，可以使用化学方法或酶法将标记物连接到探针上。

4. 准备细胞样本：准备需要检测的细胞样本。

可以使用细胞培养物或组织切片。

5. 固定细胞：将细胞固定在载玻片上，通常使用乙醛或甲醛进行固定。

6. 渗透化处理：使用洗涤缓冲液或蛋白酶处理，使细胞膜通透性增加，以便于探针进入细胞。

7. 探针杂交：将标记的探针加入到细胞样本中，使其与目标RNA序列发生互补杂交。

8. 洗涤：用洗涤缓冲液洗去未结合的探针。

9. 检测：使用显微镜观察细胞样本，检测探针的信号。

如果探针被标记有荧光染料，可以使用荧光显微镜观察。

通过RNA原位杂交探针合成，可以在细胞水平上研究特定RNA序列的表达和定位，从而了解RNA在细胞中的功能和调控机制。

1。