抗体制备
抗体的制备方法与原理
抗体的制备方法与原理抗体是一种能够识别和结合特定抗原的蛋白质，广泛应用于医学诊断、治疗和研究领域。
抗体的制备方法包括动物免疫和体外选择性放大两种主要途径。
以下将详细介绍这两种方法及其原理。
一、动物免疫法制备抗体动物免疫法是制备多种特异性抗体的主要方法，常用的动物包括小鼠、兔子、大鼠等。
制备抗体的主要步骤如下：1.抗原选择：首先需要选择目标抗原，可以是蛋白质、多肽、糖蛋白、核酸等。
抗原应具有免疫原性，能在动物体内引起免疫反应。
2.免疫原免疫：将抗原与适当的佐剂混合后注射到动物体内，佐剂可以增强抗原的免疫原性，如完全弗氏佐剂、佐科克佐剂等。
注射的剂量和时间间隔需根据具体实验目的和动物种类进行优化。
3.收集血清和分离抗体：免疫一定时间后，收集动物的全血或血清，离心分离血清，其中包含了目标抗体。
4.抗体纯化：通常使用亲和层析、凝胶过滤层析等方法将血清或血浆中的抗体纯化出来。
亲和层析是最常用的抗体纯化方法，利用特定配体或抗原结合柱将目标抗体捕获，再洗脱得到纯抗体。
二、体外选择性放大法制备抗体体外选择性放大法是指通过技术手段进行人工放大和筛选特定抗体，主要包括以下步骤：1.生成抗体文库：将来自多个个体免疫系统的B细胞或血浆细胞收集起来，提取RNA或DNA，然后利用逆转录酶合成cDNA或文库，得到抗体基因的cDNA文库。
2.构建抗体显示系统：将抗体基因文库插入适当的表达载体中，如噬菌体、酵母、哺乳动物细胞表达系统等。
3.筛选特异性抗体：利用高通量筛选技术，如细胞表面展示、比对深度测序等，可通过抗原结合的特异性来筛选出具有高亲和力的抗原结合片段或全长抗体。
4.抗体表达和纯化：通过选择后的抗体基因进行表达，再经过蛋白纯化和检验等步骤，最终得到目标抗体。
抗体制备的原理主要是基于免疫系统的免疫应答机制。
当机体受到抗原的刺激后，机体会产生一系列免疫应答，其中包括B细胞的活化和分化。
经过抗原的结合和识别，B细胞会分泌具有高亲和力的抗体。
抗体制备原理
抗体制备原理抗体是一种特异性蛋白质，能够识别并结合到其特定的抗原上。
抗体的制备原理是通过免疫原性物质刺激机体产生特异性抗体，或者通过体外培养细胞（如淋巴细胞、骨髓细胞等）制备。
抗体制备的过程中，需要经历抗原的选择、免疫原的制备、动物免疫、抗体的纯化等步骤。
首先，抗体的制备需要选择合适的抗原。
抗原是能够诱导机体产生抗体的物质，可以是蛋白质、多肽、糖类、核酸等。
在选择抗原时，需要考虑其免疫原性、稳定性和纯度等因素。
通常情况下，选择具有较强免疫原性的抗原能够更好地诱导机体产生高效的抗体。
其次，制备抗体需要进行免疫原的制备。
免疫原的制备是将选择好的抗原溶解在适当的缓冲液中，使其保持稳定性，并且能够有效地诱导机体产生抗体。
制备好的免疫原需要进行一系列的检测，确保其纯度和活性符合要求。
接着，进行动物免疫。
通常情况下，选择小鼠、大鼠、兔子等动物进行免疫。
在免疫前，需要对动物进行适当的准备工作，如体重测量、免疫程序的安排等。
在免疫过程中，需要根据抗原的特性和动物的生理状态，合理地确定免疫剂量和免疫方案，以确保免疫效果的最大化。
随后，进行抗体的纯化。
在动物免疫一定周期后，可以从动物体内获取免疫血清，其中含有特异性抗体。
但免疫血清中还会含有大量的非特异性蛋白质和其他成分，需要进行纯化。
常用的纯化方法包括盐析、凝胶过滤、离子交换、亲和层析等。
通过这些方法，可以将目标抗体从杂质中分离出来，得到纯净的抗体制剂。
最后，对制备好的抗体进行鉴定和检测。
鉴定抗体的纯度、活性、特异性等指标，确保其符合质量标准。
同时，也需要对抗体进行存储和保存，以确保其长期的稳定性和活性。
抗体制备原理是一个复杂而精细的过程，需要在每一个环节都严格控制，才能获得高质量的抗体制剂。
通过对抗体制备原理的深入了解，可以更好地指导抗体制备工作的实施，为科研和临床应用提供优质的抗体产品。
第03章抗体制备
第三节 多克隆抗体的制备及应用
一、免疫动物的选择
抗原与动物种属之间的关系 动物的个体因素 抗原的性质与动物种类 抗体的用量和要求
IgY有如下几方面的优点
无需采血，只需收集免疫母禽产下的禽蛋即可提取 抗体；
使用少量的抗原免疫禽类既可获得大量的质量均一 的特异性IgY；
噬菌体抗体库主要工作流程
从外周血或其他免疫组织器官克隆出全套抗体基因菌体表达，构建全部Ig cDNA的噬菌体抗体库。
筛选含有目的Ig表达的噬菌体。 建立目的Ig表达的噬菌体抗体库。 扩增制备噬菌体抗体。 纯化抗体。
噬菌体抗体库技术的主要特点
IgY抗体耐酸、耐热，经巴氏消毒后活性依然存在， 因此容易保存和运输；
由于种系发生距离相差很大，禽类IgY与哺乳动物免 疫球蛋白之间不会发生交叉反应；
IgY不激活哺乳动物的补体系统，不与类风湿因子或 Fc受体相结合，避免在免疫检测过程中产生假阴性或假阳 性结果；
IgY对哺乳动物抗原的敏感性高。
二、抗原剂量的选择
四、采血方法
颈动脉放血法 静脉采血法 心脏采血法
五、抗血清鉴定及保存
抗体效价和纯度的测定 抗体特异性的鉴定 抗体亲和力的鉴定 抗血清的保存
六、抗体的纯化
IgG类抗体的纯化：盐析法粗提γ-球蛋白、离子交换 层析提取IgG、亲和层析法。
特异性抗体的纯化：亲和层析法、吸附法
七、多克隆抗体的特性和应用
用于某些疾病的紧急预防，例如破伤风和Rh不合的 新生儿溶血症等。
用于某些感染性疾病和移植排斥反应等的治疗。 应用于某些疾病的临床检验。 在科研中常用于免疫印迹和免疫组化等。
第四节 单克隆抗体的制备及应用
抗体的制备方法与原理
抗体的制备方法与原理一、抗血清的制备有了质量好的抗原，还必须选择适当的免疫途径，才能产生质量好（特异性强和效价高）的抗体。
（一）用于免疫的动物作免疫用的动物有哺乳类和禽类，主要为羊、马、家兔、猴、猪、豚鼠、鸡等，实验室常用者为家兔、山羊和豚鼠等。
动物种类的选择主要根据抗原的生物学特性和所要获得抗血清数量，如一般制备抗r-免疫球蛋白抗血清，多用家兔和山羊，因动物反应良好，而且能够提供足够数量的血清，用于免疫的动物应适龄，健壮，无感染性疾患，最好为///雄性，此外还需十分注意动物的饲养，以消除动物的个体差异以及在免疫过程中死亡的影响。
若用兔，最好用纯种新西兰兔，一组三只，兔的体重以2～3kg为宜。
（二）免疫途径免疫途径有多种多样，如静脉内、腹腔内、肌肉内、皮内、皮下、淋巴结内注射等，一般常用皮下或背部多点皮内注射，每点注射左右。
途径的选择决定于抗原的生物学特性和理化特性，如激素、酶、毒素等生物学活性抗原，一般不宜采用静脉注射。
（三）佐剂由于不同个体对同一抗原的反应性不同，而且不同抗原产生免疫反应的能力也有强有弱，因此常常在注射抗原的同时，加入能增强抗原的抗原性物质，以刺激机体产生较强的免疫反应，这种物质称为免疫佐剂。
佐剂除了延长抗原在体内的存留时间，增加抗原刺激作用外，更主要的是，它能刺激网状内皮系统，使参与免疫反应的免疫活性细胞增多，促进T细胞与B细胞的相互作用，从而增强机体对抗原的细胞免疫和抗体的产生。
常用的佐剂是福氏佐剂（Freundadjuvant）,其成分通常是羊毛脂1份、石腊油5份，羊毛脂与石腊油的比例，视需要可调整为1：2～9（V/V），这是不完全福氏佐剂，在每毫升不完全佐剂加入1～20mg卡介苗就成为完全佐剂。
配制方法：按比例将羊毛脂与石蜡油置容器内，用超声波使之混匀，高压灭菌，置4℃下保存备用。
免疫前取等容积完全或不完全佐剂与免疫原溶液混合，用振荡器混匀成乳状，也可以在免疫前取需要量佐剂置乳钵中研磨，均匀后再边磨边滴加入等容积抗原液（其中加卡介苗3～4mg/ml或不加），加完后再继续研磨成乳剂，滴于冰水上5～10min内完全不扩散为止。
抗体制备
二、免疫动物
为获取高质量的抗体，除了需制备高纯度 的抗原外，还需选择适宜的动物和设计有 效可行的免疫方案，如抗原的剂量、剂型、 注射途径、注射次数、注射间隔和接种动 物的年龄均与免疫效果密切的关系。
1.免疫动物的选择
选择动物时应考虑以下因素： ①抗原来源与动物种属的关系。抗原的来源与免疫动物 种属差异越远，其免疫源性越强，免疫效果越好，而 同种系或亲缘关系越近，免疫效果越差。 ②动物个体的选择。适龄、健康、体重符合要求的正常 动物（以雄性为佳）；抗体需要量少时，选用家兔、 豚鼠和鸡等小动物；抗体需要量大时，可选用绵羊、 山羊、马、驴等大动物。 ③抗原性质与动物种类。
第十一章 抗体制备
抗体的制备技术经历了三代： 第一代抗体是传统的抗体制备方法即利用抗原免 疫动物后获得抗体，称为多克隆抗体（polyclonal antibody）； 第二代抗体是通过杂交瘤技术制备出针对抗原中 某一抗原决定簇的抗体称为单克隆抗体 (monoclonal antibody, McAb)； 第三代抗体是利用基因工程技术制备而来，称为 基因工程抗体(genetic engineering antibody)。本 章主要介绍三种类型抗体的制备方法。
一、杂交瘤技术的基本原理
一、杂交瘤技术的原理及流程
二、单克隆抗体制备技术
1. 主要材料
2. 细胞融合前准备
3. 细胞融合
4. 抗体的初筛和克隆化
5. 杂交瘤细胞冻存与复苏
6. 单克隆抗体的批量生产
7. 单克隆抗体的纯化与鉴定
（一）主要材料：
RPMI1640培养液 FCS 10% 谷氨酰胺 2mmol/L 青霉素 100IU/ml 链霉素 100Ug/ml
单克隆抗体制备实验过程
单克隆抗体制备实验过程
抗体制备实验一般分为抗体克隆、筛选、纯化和表征四个步骤，其中
抗体克隆是抗体制备实验的前提步骤，克隆抗体是从雌配子小鼠体内得到
其对抗原的单克隆抗体，是抗体制备的关键步骤。
1. 合成抗原或者从天然资源中获取抗原：合成抗原包括多肽抗原
（如biotin-GSH等）和糖蛋白抗原（如活性细胞皮质激素等）；从天然
资源中获取抗原则包括病毒样本和免疫原，比如结核分枝杆菌的血清浆及
其他微生物。
2.接种抗原：根据抗原的不同，采用不同的接种方法，比如多肽抗原，可以采用皮下或肌肉注射的方法将抗原接种于雌配子小鼠身上，以致于小
鼠体内产生对抗原的抗体。
3.分离抗体：通过血液和胸腺组织中抗体的分离筛选，获取单克隆抗体。
4. 抗体克隆：从抗体分离所获得的抗体，经过细胞学的方法进行抗
体克隆。
克隆过程中，可以利用多肽抗原，利用细胞杂交的方法进行对单
克隆抗体的从cloned。
5.筛选单克隆抗体：利用免疫染色的方法进行抗体筛选和确认，以确
定抗体株。
6.抗体纯化：经过单克隆抗体筛选和确认后，可以利用离子交换柱等
方法进行抗体纯化，从而获得高纯度的抗体制剂。
抗体的制备原理及其应用实验
抗体的制备原理及其应用实验1. 引言抗体是一类由人体或动物体内产生的免疫分子，具有识别并结合特定抗原的能力。
抗体的制备原理包括免疫原制备、免疫动物的选择、免疫方法、抗体纯化和鉴定等。
在实验室中，抗体的制备得以广泛应用于生物学、医学以及其他领域的研究和实验中。
2. 抗体制备的基本原理抗体制备的基本原理是通过免疫动物对抗原的免疫反应，使其体内产生特异性抗体。
具体步骤如下：•第一步：免疫原制备–收集目标抗原，如蛋白质或多肽片段。
–对抗原进行纯化和浓缩，确保纯度和活性。
•第二步：免疫动物的选择–选择合适的免疫动物，如小鼠、兔子或大鼠等。
–考虑动物的抗原相似性和体积适宜性。
•第三步：免疫方法–给免疫动物注射抗原，刺激其免疫系统产生抗体。
–定期采集免疫动物的血样，分离抗体。
•第四步：抗体纯化和鉴定–使用技术如亲和层析、离子交换层析等纯化抗体。
–使用免疫学方法验证抗体的特异性和活性。
3. 抗体应用实验抗体的制备在实验中具有广泛的应用价值，以下列举了一些常见的抗体应用实验：•酶联免疫吸附（ELISA）–抗体可用于ELISA实验，通过与特定抗原结合来检测其存在和浓度。
–ELISA广泛应用于血清学、药物检测、疾病诊断等方面。
•免疫组织化学（IHC）–抗体可用于IHC实验中，通过与组织中的抗原结合来检测其在组织中的位置和表达水平。
–IHC可用于病理学研究、癌症诊断等领域。
•免疫印迹（Western Blot）–抗体可用于Western Blot实验，通过与目标蛋白结合来检测其在细胞或组织中的表达水平。
–Western Blot广泛应用于蛋白质研究和疾病诊断等方面。
•流式细胞术–抗体可用于流式细胞术实验，通过与细胞表面或内部特定抗原结合来分析细胞的类型和数量。
–流式细胞术在免疫学、细胞生物学研究中得到广泛应用。
•免疫疗法–抗体可用于免疫疗法中，通过结合肿瘤细胞表面的抗原，识别和杀伤肿瘤细胞。
–免疫疗法是目前肿瘤治疗的重要方法之一。
抗体制备流程
抗体制备流程一、背景介绍抗体是免疫系统产生的一种蛋白质，具有高度的特异性和亲和力，广泛应用于生命科学领域。
抗体制备是指从动物血清或单克隆细胞中提取纯化抗体的过程。
本文将介绍抗体制备的详细流程。
二、材料准备1. 动物：常用小鼠、大鼠、兔子等；2. 抗原：根据实验需要选择适当的抗原；3. 组织破碎液：可以使用高渗盐溶液、甘油等；4. 纯化柱：可以使用蛋白A/G，蛋白L等；5. 色谱柱：可以使用离子交换柱、大小分离柱等。
三、抗原制备1. 合成或提取目标分子作为抗原；2. 重组表达目标分子作为抗原；3. 从组织或细胞中提取目标分子作为抗原。
四、动物免疫1. 免疫前处理：（1）对动物进行基础检查，确保健康状态良好；（2）按照实验需要确定免疫计划，如免疫次数、免疫间隔等；（3）根据实验需要选择适当的免疫方式，如皮下注射、腹腔注射等。
2. 免疫过程：（1）将抗原与佐剂混合后注射到动物体内；（2）在免疫后的一定时间内采集血清；（3）根据实验需要重复进行免疫。
五、抗体检测1. 间接ELISA法：将抗原固定于微孔板上，加入动物血清进行反应，然后加入辣根过氧化物酶标记的二抗进行检测。
2. Western blotting法：将蛋白质分离并转移至膜上，然后加入动物血清进行反应，最后加入辣根过氧化物酶标记的二抗进行检测。
3. 免疫组化法：将组织切片或细胞涂片固定并处理后，加入动物血清进行反应，最后加入辣根过氧化物酶标记的二抗进行检测。
六、抗体纯化1. 亲和层析法：利用特异性结合亲和剂纯化目标抗体，如蛋白A/G、蛋白L等；2. 离子交换层析法：利用抗体表面带电性质与离子交换树脂上的离子进行吸附和洗脱；3. 大小分离层析法：利用抗体的分子量差异与分子筛或凝胶过滤树脂进行分离。
七、抗体保存1. 冷冻保存：将纯化后的抗体溶液加入甘油后冷冻保存在-20℃或-80℃；2. 溶液保存：将纯化后的抗体溶液加入保护剂后在4℃下保存。
八、总结以上就是抗体制备的详细流程，其中包括了材料准备、抗原制备、动物免疫、抗体检测、抗体纯化和抗体保存等步骤。
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实验室实验：1.蛋白表达纯化过程见具体protocol，2.蛋白纯化好后，跑胶鉴定，估计大概迁移量3.将纯化好的蛋白跑一到两块胶，（大概需要1-2g蛋白，需要估计蛋白量）4.跑完胶后，用100mM KCl浸泡，几分钟后会出现发白条带，5.把该条带割下来，（原则：割带尽量小，减少等量蛋白中对应的胶块的含量，胶块含量过高会导致兔子死亡）6.在-80度冷冻1h以上，然后到三楼冷冻干燥仪冻干，7.将冻干的胶块捣碎（方便注射），可以在割胶时先切成碎小块，在楼上用玻璃棒之类的东西捣碎8.分成四份，107路或317路送去中医药大学动物实验中心进行注射9.抗体样品取回后，用纯化过的蛋白进行效价测定，并记录10.抗体溶液用硫酸铵沉淀，11.溶解后加50%甘油混匀，分管保存12.管子上标记蛋白号，记录上详细记录抗体效价，质量，杂信号状况附抗体制备实验九 多克隆抗体的制备，纯化及免疫电泳【实验目的】⒈ 加深对抗体基本知识的了解。
⒉ 了解多克隆抗体的制备及纯化的基本方法。
⒊ 了解免疫电泳的基本过程和实验依据。
一、多克隆抗体的制备【实验原理】当将抗原注射入实验动物体内时，一系列抗体生成细胞会不同程度的与抗原结合，受抗原刺激后在血液中产生不同类型的抗体，这种由一种抗原刺激产生的抗体称为多克隆抗体。
多克隆抗体中不同的抗体分子可以以不同的亲和能力与抗原分子表面不同的部分—抗原决定簇相结合。
将抗原导入敏感动物体内后，可刺激网状内皮细胞系统，尤其是淋巴结和脾脏中的淋巴细胞大量增殖。
如图所示，实验动物对初次免疫和二次免疫的应答有明显的不同。
通常初次免疫应答往往比较弱，尤其是针对于易代谢，可溶性的抗原。
首次注射后大约7天，在血清中可以观察到抗体但抗体的浓度维持在一个较低的水平，在大约10天左右抗体的滴度会达到最大值。
但同种抗原注射而产生的二次免疫应答的结果明显不同，和初次免疫应答相比抗体的合成速度明显增加并且保留时间也长。
免疫应答的动力学结果取决于抗原和免疫动物的种类，但初次和二次免疫应答之间的关系是免疫应答的一个重要特点。
三次或以后的抗原注射所产生的应答和二次应答结果相似：抗体的滴度明显增加并且血清中抗体的种类和性质发生了改变，这种改变被称为免疫应答的成熟，具有重要的实际意义。
通常在抗原注射4-6周后会产生具有高亲和力的抗体。
【实验材料】⒈ 实验动物初次抗原注射后的周次0 1 2 3 4 5 6 7初次免疫 二次免疫血清中抗体的水平成年兔。
⒉实验器材特制兔盒；刀片；25G针头；1ml注射器；20 ml 血液收集管；药铲；离心机以及塑料离心管；加样器及加样管；烧杯。
⒊实验试剂⑴抗原；乙醇；20mM 磷酸缓冲溶液pH7.2。
⑵福氏完全佐剂和福氏不完全佐剂：【实验方法】⒈抗原的制备抗原制备的主要目的在于在免疫动物体内产生最强、最适当的抗体。
由于纯化的抗原适合产生抗体，因此在注射前通常采用一些经典的方法，比如柱层析、分级萃取、亚细胞分离等进行抗原的分离和纯化。
如果多肽抗原在SDS/PAGE中为可见的单一带，抗原从凝胶中的抽提可作为纯化的最后一个步骤。
⒉预放血轻轻的将兔子放在特制兔盒中，处于放松状态的兔子采血会较容易。
按压兔子耳根部直至血管突出,然后将针头插入耳部血管的中上部，观察到进针后小心推出活塞收集血液1ml -5ml。
结束收集后，退出针头并按压伤处以制止血流，再用乙醇消毒。
取收集的血液在37°C 恒温箱中放置30分钟以防止激活补体系统，再将试管在4°C放置过夜使血液凝固。
用药铲将血凝块从管壁上拨落，将血液转移至塑料离心管中，4°C，10,000g离心10分钟，收集上清液在4°C保存。
⒊注射抗原⑴准备两只成年兔，将100µg抗原/兔溶入1ml磷酸缓冲溶液中待用。
在1ml福氏不完全佐剂中加入分枝杆菌制成完全佐剂，并加入1ml抗原溶液，剧烈震荡使之充分乳化，用3ml注射器抽取该乳化液，接上25G针头，排除注射器中的气泡。
从笼中取出兔子放在平坦处，在4个不同的部位进行皮下注射，两处在后背，两处在大腿处。
抚去注射处的兔毛并用乙醇消毒暴露的皮肤。
捏出皮肤，将针头以相对皮肤15度的角度进针，进针深度为1cm-2cm，小心不要刺入肌肉中，在4个不同部位分别各注射约500µl抗原溶液。
注射结束后，将针在注射处放置几秒钟后再轻轻拔出，并用乙醇在注射处消毒。
在4个部位重复上述操作。
用相同方法免疫另一只家兔。
⑵每4-6周注射抗原，并在注射后的7天-10天按照步骤2收集血液。
将收集的血液与注射前收集的血液进行比较，检查是否有抗体产生。
待确定产生抗体后可大量收集血液，但每只兔子收集血液不能多于40ml以防止休克。
⒋收集血液⑴将家兔轻轻放入固定架上,二甲苯涂于耳部血管的上中部，用刀片倾斜45°在该处切出0.23cm-0.3cm的切口使血液能自由的流出。
用消毒后的管收集滴出的血液，若在结束之前出现凝固可用温水轻擦切口处，再继续收集。
收集适量血液后可用消毒后的纱布轻擦患处，轻按患处10秒-20秒确定血流停止后方可结束。
⑵将血液在37°C恒温箱中放置30分钟，再在4°C放置过夜。
用药铲将血凝块从管壁上拨落，将血液转移至塑料离心管中，4°C，10,000g离心10分钟，收集上清液即为抗血清，可在-20°C保存数年。
【实验结果】利用蛋白质免疫印迹法或免疫电泳方法检查抗体产生情况。
二、亲和层析法纯化抗体【实验原理】如图所示，亲和层析的高度选择性使得从某一初始材料中纯化，富集某一含量较低的目的蛋白成为可能，因此亲和层析是蛋白质分离纯化过程中最有效的方法之一。
另外，如果配基与蛋白质的亲和能力很强，也可同时进行样品的浓缩。
虽然多数情况下不需要将抗体与其他血清蛋白分开，但如果一旦需要，蛋白A亲和层析是一种非常有效的分离方法。
蛋白A是从Staphylococcus aureus中获得，可与抗体重链的Fc片段相结合。
现在已知蛋白A可与多种哺乳动物的IgG相结合也可与某些IgM和IgA相结合。
如果将蛋白A与固相载体相连，例如sepharose CL-4B，这种填料可以成为分离和纯化不同类型，不同亚类抗体或抗体片断的重要工具。
【实验材料】⒈.实验仪器蛋白A柱（含10ml或5ml填料）；泵；离心管；离心机；pH试纸；过滤器；玻璃柱。
⒉.实验试剂⑴TBS缓冲溶液：6.06g Tris (50 mM), 8.78g NaCl (150 mM)以及0.5g叠氮化钠(0.05%)溶于1L蒸馏水中，并用HCl调节pH 7.4。
⑵中和缓冲溶液：121.2g Tris (1 M), 87.8g NaCl (1.5 M), 0.37g EDTA (1mM)及5g叠氮化钠(0.5%)溶于1L蒸馏水中，并用HCl调节pH8.0。
⑶洗脱缓冲溶液(pH2.7)：将3.75g甘氨酸(50 mM)溶解于1L蒸馏水中，用HCl调节pH2.7。
⑷洗脱缓冲溶液(pH1.9)：将3.75g甘氨酸(50 mM)溶解于1L蒸馏水中，用HCl调节pH1.9。
【实验方法】 ⒈ 准备蛋白A sepharose CL-4B 亲和柱通常准备5ml 或10 ml 蛋白A sepharose CL-4B 填料，在真空瓶中将等体积的填料和TBS 缓冲溶液混合，搅拌。
抽真空约15分钟以除去填料中的气泡，否侧在柱中形成的气泡影响柱子的容量和分离效果。
将蛋白A sepharose CL-4B 填料缓慢加入玻璃柱中，利用泵控制填充速度为1 ml/分-2 ml/分，避免柱干，利用10倍于床体积并经过预冷的TBS 缓冲溶液平衡柱子。
⒉ 制备抗血清将抗血清放入冰水或4°C 冰箱中缓慢解冻以避免蛋白质的聚集。
在蛋白质解冻过程中出现的聚集可通过37°C 预热而溶解。
加入固体叠氮化钠至浓度为0.05%，4°C ，15,000xg 离心5分钟，移出澄清的抗血清再经过滤器过滤除去多余的脂。
⒊ 亲和层析将抗体用TBS 缓冲溶液以1：5的比例进行稀释，再用过滤器进行过滤。
以每分钟0.5 ml 的速度将抗血清上到柱上,为保证抗血清与填料的结合，需连续上柱2次并保留上样流出液。
用TBS 缓冲溶液清洗柱子至A λ280nm <0.008后加pH2.7洗脱缓冲溶液，以0.5ml/min 的速度洗脱至所有蛋白均流下来。
用已经加入100ul 中和缓冲溶液的1.5 ml EP 管分管收集洗脱液，混匀后用pH 试纸检查洗脱液的pH ，如果pH 低于7可利用中和缓冲液调至约pH7.4以防止抗体的变性。
在柱中加入10ml,pH1.9洗脱缓冲溶液，按上述方法收集洗脱液至A λ280nm <0.008。
利用分光光度计测定各管中蛋白质的含量。
若蛋白浓度低于0.5mg/ml 可加入10%的甘油以便保存，将纯化的抗体分装后在2°C~8°C 保存。
用含0.05%叠氮化钠的TBS 缓冲溶液清洗柱子后将柱子储存在2°C~8°C 环境。
【实验结果】利用SDS/PAGE 检查洗脱获得的蛋白纯度并利用免疫电泳技术检查纯化后抗体的滴度。
+++2. 特异性结合目标蛋白3. 分离已结合蛋白亲和层析的基本过程 1. 配基与载体相连【注意事项】⒈叠氮化钠有毒，应戴手套并小心操作⒉在纯化过程中，预冷的TBS缓冲溶液可减少蛋白质的非特异性结合和微生物的代谢。
三、免疫电泳【实验原理】免疫电泳又称为γ球蛋白电泳或免疫球蛋白电泳技术，这是一种能够判断血液中三种免疫球蛋白IgM, IgG, IgA含量水平的实验方法。
在这项实验技术中，首先利用蛋白质的分子量和所带电荷的比值运用水平琼脂糖凝胶电泳技术将蛋白质进行分离，然后将特异性的抗体引入到与电泳方向平行的凹槽中，在抗原和抗体的扩散过程中，抗原和抗体适当比例的结合会导致沉淀的产生（如图）。
0.85%盐不仅可以终止扩散过程也可用于洗去未结合的蛋白，抗原和抗体结合所形成的沉淀线即可以肉眼观察也可利用染色方法观察。
免疫电泳技术不仅可用于血清或尿样中单克隆抗体的鉴定，也可用于其它方面，比如免疫复合物的筛选、各种异常丙种球蛋白血症的识别和鉴定等。
免疫电泳技术也是进行蛋白质常规评价的一种可靠，精确的实验方法，可观察蛋白质结构的变化和浓度的改变。
抗体抗原抗原/抗体复合物【实验材料】⒈实验器材水平电泳仪；打孔器；滴管；刀片；电源；水浴(55°C)；蒸馏水；烧杯(400-600ml)；加样枪(5-100ul)。
⒉实验试剂⑴纯化的抗体；蛋白质混合物；1%琼脂。
⑵Tris-巴比妥缓冲溶液：2.24g 巴比妥酸，4.43g Tris，0.053g 乳酸钙及0.065g 叠氮化钠溶于100ml 蒸馏水中。