单克隆抗体和基因工程抗体的制备

加小牛血清至20%, 加几滴10%二甲亚砜。
• 杂交瘤细胞培养可用液体、半固体、
接种动物腹腔。
第二节 单克隆抗体的制备技术
McAb 单一、特异、纯化，利用杂交 瘤技术制备McAb的基本原理是三个原则：
1）一种单克隆产生一种抗体 2）杂交瘤细胞保持双亲细胞特性 3）筛选培养基
一、单克隆抗体的产生
1. 动物体内生长
2. 表达载体的构建
人-鼠嵌合抗体的表达载体基因依可变区 基件及内含子剪接信号，因此载体只需要包括 细胞内增殖所必须的抗生素抗性基因和质粒复 制的起始序列以及在真核细胞进行选择的显性 标记基因。
将载体 DNA 导入真核细胞称为转染。 导入的 DNA 整合至细胞基因组 DNA 中 得到转染子，要得到稳定的转染子需利 用真核细胞的显性选择标记基因，这些 标记基因使细胞获得对某些细胞毒物质 的抗体，在培养液中加入相应的细胞毒 物质可杀死转染不成功的细胞，达到选 择的目的。
二、小分子抗体
具有结合抗原功能的分子片段称为小 分子抗体。其优点：1）可在原核细胞表 达，生产成本低; 2）易于穿透血管或组 织到靶细胞部位，有利于疾病的治疗；3） 不含Fc 段，副作用小；4）半衰期短，有 利于毒素中和及清除。
小分子抗体包括：抗原结合片段 （fragment of antigen binding,Fab）， 可变区片段（fragment of variable region,Fv）,单链抗体（single chain Fv,ScFv），单区抗体。另有VH和VL。
3.表达
用哺乳动物细胞或大肠杆菌表达量较少， 而应用二氢叶酸还原酶（dhfr）扩增系统使抗 体表达增强。dhfr 是正常核酸代谢必须的酶， 缺乏该酶的中华仓鼠卵细胞（ CHO））需在有 次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷条件下利用 DNA 合成， 因此, dhfr 作 CHO 的显性选择标记基因，在 无次黄嘌呤、胸腺嘧啶核苷的情况下，只有导 入 dhfr 基因，细胞才能存活。该糸统可用来 扩增导入的目的基因。
（二）选择培养基的应用
细胞融合是一个随机的物理过程。融合后可 能出现以下情况:
1）脾细胞与瘤细胞 2）瘤细胞与瘤细胞 3）脾细胞与脾细胞 4）未融合的脾细胞 5）未融合的瘤细胞 6）多聚体形式。 3）、4）、6）在体外易死去，不需筛选。
细胞的 DNA 合成一般有两条途径 一是糖和氨基酸及其他小分子化合物 合成核苷酸，进一步合成 DNA，叶酸是 重要辅酶。
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• 小鼠骨髓瘤与人的B细胞杂交瘤，该技 术优点是易获得小鼠骨髓瘤细胞，融合率 较高，但最大的缺点是不同种杂交后不稳 定，杂交瘤传代后，很快丧失分泌抗体的 染色体。
二、T 细胞杂交瘤
自 B 细胞杂交瘤技术后，T 淋巴细胞 杂交瘤成为热门，为获得淋巴因子，更深 入地研究T细胞的各种功能，虽然有一些小 鼠T细胞杂交瘤成功的报道，但结果不满意， 该细胞很不稳定，分泌淋巴因子无特异性， 一种T细胞杂交瘤可同时分泌几种淋巴因子， 到目前仍无突破性进展。
• 2.细胞工程BsAb
• 将二种杂交瘤细胞进行融合产生杂交 瘤，核酸随机组合多种多样。
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3.基因工程BsAb
• 用抗体分子片段如ScFv或Fab等，经基 因操作修饰后，或体外组装成为BsAb，或 直接导入受体细胞表达分泌BsAb。
• 在免疫检测、肿瘤放射免疫显象、药 物刹伤、介导细胞刹伤效应起重要作用。
所以，前面提到的 2）瘤细胞与瘤细 胞及 5) 未融合的瘤细胞不能生长，只有 1） 脾细胞与瘤细胞才能生长，因为脾细胞为
HGPRT 阳性，通过补偿途径代替氨基蝶呤 阻断的主要途径。
（三）有限稀释与抗原特异性选择
在免疫动物时，一种抗原往往有多个表 位 ，一个B细胞克隆接受一个表位，故在 免疫动物时是众多 B 细胞克隆的抗体的分 泌，而针对目的抗原的B细胞只占很少部分 ，在细胞融合后，有相当一部分是无关的 细胞融合体，即融合细胞分泌的不是目的 抗体，要进行筛选，分二步稀释。
（一）人-鼠嵌合抗体
通过基因工程技术将人 IgG C 区与鼠 IgG V 区连接，导入细胞内表达制备的抗 体称为嵌合抗体，因 IgG 的抗原性在 C 区， 来自人，故抗原性降低，且半衰期明显延长， 在介导 CDC 及 ADCC 亦明显增强。
1.鼠单克隆抗体可变区基因克隆
用探针从该杂交瘤细胞的基因组文 库 中 调 取 。 用 PCR 方 法 从 该 细 胞 的 RNA 中扩增 VH 及 VL 基因。
一是辅助途径，是在次黄嘌呤和胸腺 嘧啶存在下，经次黄嘌呤磷酸核糖转化酶 （hypoxanthine guanine phospheribosyl transferase,HGPRT）和 胸腺嘧啶核苷激酶（thymidine kinase,TK）的催化作用合成 DNA。
氨基蝶呤是叶酸的拮抗剂，当氨基蝶 呤存在时，能阻断第一条途径。细胞融合 的选择培养基中有三种关键成分，次黄嘌 呤(hypoxanthine,H)、氨基蝶呤 (aminopoterin,A)、胸腺嘧啶核苷 (thymidine,T)，三者取前缀缩写为 HAT 培养基，其融合细胞所用的瘤细胞是经毒 性培养基选择出来的 HGPRT 阴性细胞株。
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1. 稳定、易培养
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2. 自身不分泌Ig或CK
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3. 融合率高
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4. 是HGPR瘤株有P3X63-Ag8.653C （ P3.653 ） 、 Sp2/0 等 。 为 HAT敏感株，易培养, 融合率高，最常选用 聚乙二醇(PEG)使细胞膜轻度损伤，细胞容 易融合。
（四）双特异性抗体 双特异性抗体（bispecific
antibody,BsAb）又称双功能抗体。两个抗 原结合部位具有不同的特异性，可以同时 与两种不同特异性抗原发生结合。
• 1.化学交联BsAb
• 分别分离纯化两种抗原的单抗，先使 Ig解离后，获得单价抗体，再使两种不同 抗原特异性的单价抗体或其片段交联起来 。该方法易致抗体失活，其产物也难以保 证均质性。
T 淋巴细胞杂交瘤分为小鼠及人， 由于 T 细胞功能的多样化，制备出的 T 细胞杂交瘤也各有其特性，如分泌淋 巴因子，特异性杀伤功能，分泌抑制因 子，自身反应性等。其基本过程是将激 活的T细胞与酶缺陷型T淋巴细胞瘤细胞 融合，可表达特异性 TCR 或其他功能 的杂交瘤T细胞，与 B 细胞相以，但细 胞激活和阳性克隆筛选较为杂交，不稳 定，简介主要步骤 。
三、阳性杂交瘤细胞的克隆化培养
杂交瘤细胞形成的初期很不稳定， 鼠的二倍体细胞有40对染色体，杂交后 80对，易丢失，丢失后仍生长，要检测 上清液中是否有目的抗体及淋巴因子。
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将阳性细胞进行单细胞培养，反复2～
3次，确保为一单细胞阳性杂交瘤细胞应及
时冻存，以防止细胞染色体丢失，发生变
异或污染，冻存于液氮（-196℃）,冻存时
( 二 ) 改 形 抗 体 （ reshaped antibody,RAB）
应用基因工程技术在嵌合抗体基础 上用人抗体可变区序列取代鼠源单抗CDR 以外的骨架序列，重新构成既有鼠源单 抗的特异性又保持抗体亲和力的人源化 抗体，该抗体对人无免疫原性。
（三）抗体的表面修饰
人和鼠 IgV区来自不同的种属，轻链不同型 别 ， 互 补 性 决 定 区 (complementarity determining region,CDR) 的 长 度 可 不 一 致 ， 但暴露于表面的AA残基的位置数量都很保守， 通过改变表面残基使其人源化，降低鼠可变区 的异源性，将Fv的表面人源化，消除其免疫原 性而不影响 Fv 的整体空间构象。
第三节 基因工程抗体技术
杂交瘤单克隆抗体在诊断、治疗、 预防和蛋白质提纯应用中非常广泛， 但对人是异源性，人抗小鼠抗体， 应用基因工程技术减少小鼠源成分， 保留原有的抗体特异性。
一、人源化抗体
人源化抗体主要指鼠源性单克隆抗 体的基因克隆及 DNA 重组技术改造， 重新表达的抗体。其大部分氨基酸序列 为人源序列所取代，既基本保留亲代鼠 单克隆抗体的亲和力和特异性，又降低 了鼠异源性。
• 目前纯化方法有十几种，一般采用盐 析、凝胶过滤、离子交换层析和辛酸提取
等，现在最有效的方法是亲和纯化法，常 用 SPA 或抗小鼠免疫球蛋白抗体与载体交 联。称为 Sepharose 柱，抗体结合上去，然 后洗脱。
三、单克隆抗体的性质鉴定
鉴定的方法很多，用已知抗原测 定抗体，几乎所有的抗原抗体反应 试验都可以作，如阳性，再定量， 确定工作浓度。
计数，每个孔只放一个细胞，实际是0 至数个，整个过程为克隆化，将阳性细胞 株重复一次，尽量使抗体更纯，将阳性细 胞进行增殖，部分冻存，部分进行体外培 养或动物接种。
• 另外还有其他杂交瘤技术，如人-人 B 淋巴细胞杂交瘤和鼠-人 B 淋巴细胞杂 交瘤，人骨髓瘤细胞系体外建株比较困难， 生长不稳定，有的分泌 IgE，有的分泌 Ig 的γ、κ链。B细胞取外周血淋巴细胞、 脾细胞、淋巴结细胞、病灶浸润性淋巴细 胞。从理论上讲很好，但实际比较困难， 在于缺乏好的亲体骨髓瘤细胞株，较难获 得抗原特异性B淋巴细胞；人杂交瘤细胞 不能在小鼠或其他动物体内生长。
第四章 单克隆抗体与基因 工程抗体的制备技术
中南大学湘雅医学院检验系 临床微生物学免疫学教研室
李闻文 2013 ,10
目的要求 1. 掌握杂交瘤技术的基本原理 2. 熟悉单克隆抗体的制备技术 3. 熟悉基因工程抗体技术
概述
大多数抗原分子具有多个抗原决定 簇（表位，epitope）。一个抗原决定 簇刺激一个B细胞克隆产生一种特异性 抗体，一种抗原刺激机体产生多种抗 体称为多克隆抗体（polyclonal antibody ,PcAb）如免疫血清。由一个 只识别一种抗原表位的B细胞克隆产生 的同源抗体称为单克隆抗体 (monoclonal antibody,McAb)。
• 单克隆抗体理化性状高度均一，其抗原 结合部位完全相同，生物活性专一，特异性 强，纯度高，效价高，易于实验标准化及大 量制备，是研究抗体的一重大突破。应用比 较广，如试剂诊断盒、治疗肿瘤、器官移植 及自身免疫病等。