漆酶转化对氨基苯胂酸的研究

近年来， 氧化耦合反应对环境中有机污染物归趋 氧化耦合反应是指带 的研究日益引起学术界的关注。 有 酚 或 者 苯胺 官 能 团的 化 合 物被 氧化 形 成自 由基或 者醌类中间体， 再通过共价键相互聚合[5]。 这类反应一
般由 某 些 天然金 属 氧化物 以 及 由植 物 或 真菌分泌的 体外氧化酶催化。 氧化耦合反应被认为在土壤腐殖化 过程中起着重要作用， 是土壤有机质生成的主要机制 之一[6]。过氧化物酶和酚氧化酶是最重要的两大类能 （Laccase） 够催化氧化耦合反应 的细胞 体 外 酶 。漆 酶 主要由漆树或真菌分 是一种常见的含铜多酚氧化酶， 能催化氧化酚类、 苯 泌产生， 它以氧气作为电子受体，
毒性更 素的作用 下 发 生转 化 ， 转 变 为迁 移 能力 更强、 大的三价和五价 的 无 机砷 化 合 物[3]， 对 环境造 成 严 重 [4] 污染。 王付民等 对广东省长期使用 ARS 为饲料添加
90%的 ARS 几乎以药物原型随粪便排出体外[2]。 这些 进入到 以通过吸附 、 淋 溶 等途 径 在 环境中发 生 迁移 ， 化学 和微生物 等 因 地表水和地下水 ； 还可 以 在物 理、
3.8） 配成混 和 0.01 mL 漆酶溶液加入 1 cm 比色皿中， 重复 合溶液， 检测其在 420 nm 下吸光度的变化速率， 3 次， （Act） 取平均值。漆酶酶活力单位 定义为每分钟
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有机污染 胺类等底物 。漆酶在废水处理、 生物漂白、 控制等方面都具有重要的应用[8]。 在漆酶作用下环境中苯胺类污染物可与腐植酸分 漆酶首 子通过共价键形成结合态残留[9]。在此过程中， 先氧化腐植酸分子中的苯酚结构单元，将其转化为醌 根 类中间体， 后者和苯胺类污染物发生亲核加成反应。 2-加成和 1， 4-加成两 又可分为 1， 据加成位点的不同，
明， 周边长期使用猪粪为肥料的甘薯地土壤的砷含量 kg-1， 高达 25.83~55.51 mg · 远远 大于 自 然 界砷 的 背景 kg-1 的 3~6 倍。 限 0.5 mg · 值， 而甘薯根内的总砷含量高达国家规定的最高检出
剂的 15 个大型猪场的周围环境进行了调查，结果表
2015-11-15 收稿日期： 基金项目： 江苏高校优势学科建设工程资助项目 （PAPD） （1990—） 从事水 污染 作者简介： 师元元 ， 女， 河北保定人 ， 硕士研究生， 2014103040@ 控制研究。E-mail： * 通信作者： jhlu@ 陆隽鹤 E-mail：
humic constituents. Laccase alone could not decompose ARS. However, the presence of catechol or syringic acid facilitated ARS transfor -
（p -arsanilic, ARS） 对氨 基苯胂酸 是一 种 饲 料 添 被广泛 应 加剂， 具有良 好 的 促生 长 和 广 谱杀 菌 作用， [1] 80%~ 用于畜禽养殖业 。ARS 不易在动物体内累积， ARS 通过粪便施肥进入土壤， 可以被植 物 吸收 ； 也可
[7]
32 卷第 第2016 期 年 41月
师元元， 等： 漆酶转化对氨基苯胂酸的研究
unit mL-1。酶活性根 氧化 1 mol ABTS 所需要的酶量， · 其中 r 表示漆酶催化氧化 ABTS 产 物在 据下式计算， 0.036 为 ABTS 波 长 420 nm 处 的 吸 光 度的 变化 速 率 ， 氧化产物的摩尔吸光系数。 Act mL-1） =3 × （unit · （mL） 1 1000 μL r cm-1 s-1） （ · × × 1 mL 0.036 L-1 cm-1） 10 μL （μmol · ·
2016， 35 :706-710 （4）
农 业 环 境 科 学 学 报
Journal of Agro-Environment Science
2016 年 4 月
Science , 2016, 35 :706-710. （4）
SHI Yuan-yuan, JI Yue-fei, LU Jun-he, et al. Transformation of p -arsanilic acid by laccase catalyzed oxidative processes[J]. Journal of Ag[9， ， 然后进一步脱水生成 Shiff 碱。 生 1， ARS 进入土壤后可能 因此可以推测， 是苯胺类化合物，
种途径[10-11]。例如， 邻苯二醌中间体倾向于和苯胺通过 [11] 1， 4-加成进行聚合 ， 而对苯醌倾向于和苯胺类物质发
ARS （邻苯二酚或丁香酸） ， 和 一种腐植酸模型 化合物 -1 -1 L ， mL ， 初 始 浓 度 为 10 μmol · 漆 酶 浓 度 1 unit · 加入 0.01 mol L-1 柠檬酸-磷酸盐缓冲液控制 pH 为 6.8。 · 反
1.1 试剂与仪器
250 mm） ， 流动 相采 用 V
甲 醇 (1%乙 酸 )
∶V
水 （ 1%乙 酸 )
=20 ∶80 等
布鲁克-傅立叶红外光谱仪 安捷伦 G6410B 型质谱仪； Varian Cary50 ； （德 国） 紫外-可见分光光度计； SL1002N 型电子天平 （上海民桥精密科学仪器有限公 UP-10A 型纯水机 。 司） ； （南京前沿仪器设备有限公司） 1.2 试验方法 1.2.1 酶活性的测定
且漆酶-邻苯二酚体系中 ARS 的转化更加彻底。 的降解效果显著， 在反应过程中， 邻苯二酚和丁香酸首先在漆酶的作用下氧化成为
ARS 结果发现在漆酶-ARS 单一体系中， 在时的转化过程及产物鉴定。 漆酶并不能降解 ARS； 当体系中加入邻苯二酚或者丁香酸时，
（1.College of Resources and Environmental Sciences, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China）
摘
丁香酸； 亲核加成 关键词： 对氨基苯胂酸； 漆酶； 邻苯二酚； X53 中图分类号： A 文献标志码：
1,2-醌和 1,4-醌， 始终以有机胂形态存在。 然后分别和 ARS 发生亲核加成反应， 形成聚合物， 产物中均没有发现砷酸基团的脱落， 1672-2043 04-0706-05 文章编号： （2016） doi:10.11654/jaes.2016.04.014
SHI Yuan-yuan, JI Yue-fei, LU Jun-he*
Transformation of p-arsanilic acid by laccase catalyzed oxidation process
transformation of ARS by laccase catalyzed oxidation process was investigated in the presence of catechol and syringic acid as representative
并通过改 均设置未加酶液的底物溶液作为空白对照。 变邻苯二酚或丁 香 酸的浓 度，分别 考 查 它 们对 ARS 20、 30、 40、 50、 60 min 后取样分析。 1.3 ARS 的定量分析
转化的影响。选择 6 个不同邻苯二酚和丁香酸浓度， 10、 20、 30、 40、 50 μmol· L -1，并分 别 在 10、 分 别 为 5、 样 品 中 ARS 浓 度 采 用 高效液 相 色谱 仪 进行分 5 μm × （Hitachi Lachrom ， 析。 采 用 C18 反 相 色谱 柱 min ， 流 速 为 1.0 mL 梯度 洗 脱 ， · 进 样 量 为 10 μL， 紫 外检测器进行检测。 1.3.1 反应产物 MS 分析
Abstract： p -Arsanilic acid , a veterinary feed additive promoting growth, may contaminate the environment. In the present study, （ARS）
mation. Fourier transform infred spectra （FTIR）and mass spectra （MS）analysis revealed that ARS was degraded via the formation of cova lent bonds with quinone intermediates upon oxidation of catechol and syringic acid by laccase. In general, the reaction was a nucleophilic sent findings suggest a transformation pathway of ARS in environment in addition to biodegradation and photolysis. Keywords： p -arsanilic; laccase; catechol; syringic acid; necleuphilic addition addition process with the aniline N acting as necleophile attacking the α -carbon of the carbonyl group in the quinone molecules. The pre-
采 用 紫外 分 光光 度 法 以 ABTS 为 底 物 测 定 漆 酶 （pH 活性 [13] 。分 别取 3 mL 0.3 mmol·L -1 ABTS 溶 液
1.3.2 产物的 FTIR 分析
流速保 源 （ESI） 负离子模式检测， 利用氮气作干燥气， -1 min ， 持在 10 L · 干燥气温度 350 ℃。