真菌漆酶的研究进展

真菌漆酶的研究进展

宋瑞（安徽大学生命科学学院合肥230039）

【摘要】漆酶是一种蓝色多铜氧化酶，和植物中的抗坏血酸氧化酶，哺乳动物的血浆铜蓝蛋白属同族，能够催化多种有机底物和无机底物的氧化[1,2]，同时伴随分子氧还原成水。漆酶广泛分布于真菌、高等植物、少量细菌和昆虫中，尤其在白腐真菌中普遍存在。漆酶特有的结构性质和作用机理使其具有巨大的应用价值。本文就真菌漆酶结构，功能的研究进展作一综述，并对其应用作简单介绍。

【关键词】真菌漆酶三维结构功能应用

1真菌漆酶结构特征

1.1 漆酶的组成

漆酶是一种糖蛋白，肽链一般约由500个氨基酸组成[3]，糖基含量差异较大，占整个分子质量的10%—80%[4]，据相关报道，漆酶的热稳定性可能与其糖基化有关。糖组成包括半乳糖、葡萄糖、甘露糖、岩藻糖、氨基己糖和阿拉伯糖等。Mayer[5]认为漆酶并不均一，它由多条5000~7000分子量的糖肽链基本结构单元组成。由于结构单元之间的缔合度不同，造成了各种漆酶分子量的不同。另外，分子中的糖基的差异，也会引起漆酶的分子量随来源不同会有很大的差异，从59—390ku不等。真菌漆酶约含19种氨基酸，绝大部分为单体酶，但也有例外，如双孢蘑菇和长绒毛栓菌漆酶由两个亚基组成[6]，而柄孢壳漆酶I由四个亚基组成。漆酶种类繁多，不同种类的真菌产生的漆酶种类不同，即使同一种真菌在不同环境下也产生不同种漆酶。

1.2漆酶的晶体结构

由于漆酶是含糖蛋白质，且糖质量分数较高，一直以来很难获得X-衍射分析所用的单晶体，因此阻碍了关于漆酶结构的研究进展。1998年第一个漆酶晶体是Ducros V[7]制备的来自灰盖鬼伞(Coprinus cinereusv)T1Cu缺失型漆酶晶体，并分析了其结构。至今为止，Bacillus subtilis(CoA)[8]；Melanocarpus albomyces(MaL)[9]；Rigidoporus lignosus(RiL)[10]；Pycnoporus cinnabaricus(PcL)[11]；Coprinus cinereus(CcL)[12]和Trametes versicolor(TvL)[13]漆酶的三维结构已相继被报道。

漆酶分子整体由3个杯状结构域所组成，分别称作结构域A、B、C，每个结构域主要由β-折叠桶，α-螺旋，loop结构所组成。三者紧密结合形成球状结构。这是铜蓝蛋白家族所共有的结构形式[7,9]。分子当中含有二硫键，漆酶种类不同，二硫键数目也不一样，MaL 漆酶分子由3个二硫键，分别是位于结构域A Cys4～Cys12、结构域A和C界面上Cys114～Cys540、结构域C Cys298～Cys332，而CcL，RiL漆酶中则含有两个二硫键。在CcL漆酶分子中，由结构域A的Cys85和结构域B的Cys487形成一个二硫键，另一个二硫键存在于结构域A和结构域B(Cys117—Cys204)之间。一个伸展的loop(氨基酸284—327)连接结构域B和结构域C。Asn343上有N连接的N—乙酰葡萄胺。

1.3 漆酶的催化中心

真菌漆酶分子中一般都含有4个Cu原子，根据磁学和光谱学性

质不同可将4个Cu原子分为三类：Ⅰ型Cu2+(T1Cu)和Ⅱ型Cu2+(T2Cu)各一个，都是单电子受体，呈顺磁性；Ⅲ型Cu24+(T3Cu)两个，是耦合离子对，是双电子受体，反磁性[14]。T1Cu位于结构域C上，T2Cu 和T3Cu位于结构域A和C的界面上。漆酶绝大多数都只含4个Cu 原子，Karhunen E等[15]研究的射脉菌( Phlebia radiata)漆酶却只含有2个Cu原子(T1Cu、T2Cu各一个)，无T3Cu原子，但该漆酶分子中含有1个具有类似T3Cu功能的有机小分子辅基吡咯喹啉(pyrroloquinolinequinone，PQQ)。Palmieri G等[16]从糙皮侧耳(Pleurotus ostreatus)中纯化的一种新型漆酶POXA1中含有1个Cu原子，2个Zn原子和1个Fe原子，由于缺少T1Cu，在610nm处没有吸收峰，酶蛋白呈白色。在不同种真菌漆酶分子中，与Cu原子相连的1个Cys 和10个His及其周围的氨基酸配基则是相对保守的，这些氨基酸都分布在含有两对His的N末端区域，或是分布于C末端的Cys和其余结合铜原子的His之间。Cu离子构成了漆酶的活性中心，在漆酶催化氧化过程中起决定性作用，如果除去Cu离子，漆酶将失去催化功能。

1.3a T1Cu结合位点

T1Cu形成单核中心接受来自底物的电子转移，具有典型的蓝铜谱带，紫外可见光谱上600nm处有吸收峰，它是底物反应场所，把来自底物的电子传递三核中心铜原子上。T1Cu以Cu2+形式存在，在所有的漆酶中都与两个His的N原子和一个Cys的S原子配位结合，形成扭曲的四面体结构。有些多铜氧化酶还有第四个轴向的氨基酸配

基，在不同的多铜氧化酶中配基种类不同，在抗坏血酸氧化酶中为Met，大多数其它真菌漆酶中通常为Phe，而灰盖鬼伞漆酶中为Leu，距离T1Cu 3.51Å，因此不能成为T1Cu的配基。这种配位的不同被认为可能引起真菌漆酶氧化还原电位升高。Perrycr等[17]认为此位置的还原电势强弱与其疏水基团大小成正比，如为甲硫氨酸(Met)配基，亮氨酸(Leu)配基，苯丙氨酸(Phe)配基，其还原电势依次升高。然而Silvia Garavaglia等[10]通过比较CcL(低Eo)和TvL(高Eo)的不同发现，Leu或Phe不同的配位并不是导致氧化还原电位变化的最主要因素，认为T1Cu-NE间的距离则是影响氧化还原电位高低的主导因素。

围绕在T1Cu一侧的是一个疏水性口袋，Leu462两边分别为Phe340和Phe398。T1Cu存在于Ile454的一侧，且位于一个约12Å宽、6Å深的凹陷中，结构域A和结构域C的三个loop构成了凹陷的表面。这个区域与还原底物的结合有关。这些伸展的loop区，决定了底物特异性，而真菌漆酶具有极度广泛的底物专一性，这可能是由于漆酶中缺少这些区域，序列变异性也较大，且结合位点相对较大，再加上loop 构象上存在的变化(表现在室温和100K结构之间的不同)的影响。1.3b T2/T3Cu结合位点

T2Cu与T3Cu形成三核中心接受来自T1Cu单核位点的电子，与高度保守的四个His-X-His花样的8个His配位结合，T2Cu结合2个，每个T3Cu结合3个[8,10]。两个T3Cu之间结合漆酶的第二个底物氧分子。T2Cu具有电子顺磁共振效应，不易结合弱的配体，且不稳定，当螯合剂存在时，能够被一些2型耗竭(T2D)衍生物选择性还原